拉呋替丁超高效液相色谱稳定性指示性方法开发与验证.ppt

,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,Click to edit Master title style,目的,明确分析方法开发过程与要点,明确在验证中所需要考虑问题,了解开发过程与验证的关系,1,材料和试剂,拉呋替丁及其四个杂质,来自实验室,正磷酸氢二氨,HPLC,级,默克,氨水,AR,级,默克,乙腈,梯度淋洗级,J.T.Baker,高纯去离子水,Millipore,纯水制备系统,2,拉呋替丁,四个杂质,3,色谱条件,恒温,:35,C,流动相A:磷酸盐缓冲,液,(0.02M磷酸氢二铵水溶液,用氨水,调整pH到9),以及,乙腈,80:20(V/V),流动相B:磷酸盐缓冲,液以及,乙腈,30:70(V/V),流量,:0.5ml/min,进样,量:4,l,6,梯度条件,时间,T(,分,),A(V),B(V),0.01,100,0,2.0,75,25,3.0,60,40,10,30,70,12,30,70,12.5,100,0,16,100,0,7,数据获得,波长,:276nm,洗脱时间,:16分钟,数据处理,:通过Empower软件V3.0处理,8,强制降解研究,光电二极管阵列探测器,扫描,范围,200nm到400nm,计算峰纯度,9,溶液制备,稀释剂,:700ml,水,与,300ml,乙腈均匀混合物,拉呋替丁,储备液,:1,000,g/ml,杂质储备液,:,每个杂质,150,g/ml,杂质定量标准液,:,按照每个杂质规格标准,(0.15%),进一步稀释,杂质储备,10,制剂样品,粉碎,20,片,拉呋替丁,片,准确称量,配制,相当于,1,000,g/ml,溶液,加,总体积,50%,稀释剂,超声,约,15,到,20,分钟,稀释到规定体积,用,0.45,m,尼龙过滤器过滤,收集,清液,用于分析制剂有关物质,进一步稀释到,100,g/ml,用于制剂含量测试,11,分析,方法,在,拉呋替丁浓度,为,1,000,g/ml,分别加入,0.15%,的四个,作为系统适用性混合物,在给定色谱条件下,分别将进样,4,l,系统适应性溶液,一式六次,拉呋替丁,与杂质,D,之间,分离度,不小于,2.0,六次进样所有杂质峰面积,相对标准偏差不超过,5.0%,12,降解研究,液体处理条件,:,酸,碱,氧化,配制原料药,1,000,g/ml,稀释液溶液,处理,0.1N,盐酸,(90,C,加热,1,小时,),0.1N,氢氧化钠,(90,C,加热,1,小时,),30%,过氧化氢水溶液,稀释到刻度,按照色谱条件分别进样,13,降解研究,固体处理条件,:,光照,加热,原料药,在,经过校准,60,C,烘箱内加热,24,小时,光降解样品,按照,ICH,指南,暴露到紫外光,7,天,经过处理,样品用稀释剂,稀释到所需,的,1,000,g/ml,按照规定方法进样,14,降解研究,对,所有,降解样品中的,拉呋替丁,与,杂质,进行定量,用,光电二极管阵列检测器来建立,每个降解条件,峰纯度,15,方法开发,用,高效液相色谱法,对,拉呋替丁,原料药,制剂,含量与,相关杂质,进行,测定,由于,运行时间,60,分钟左右,比较长,没有对,高效液相色谱法进行验证,转移到,UPLC,其运行时间,从,60,分钟,减少,到,16,分钟,开发,UPLC,方法核心目的是检测并确定拉呋替丁,原料药与制剂中,潜在杂质,并实现所有四个杂质及在,降解,研究中生成降解产物,分离,UPLC,色谱条件,开发与优化,16,方法开发,在开发过程中使用了各种,UPLC,固定相,Acquity UPLC BEH-C18(2.1mm,50mm,1.7,m),Acquity CSH phenyl-hexyl(2.1mm,100mm,1.7,m),Acquity UPLC BEH-shield RP18(3.0mm,100mm,1.7,m),基于,例如分离度,拖尾因子,选择性,特别是对,酚类的,杂质,A,最后用,Acquity UPLC BEH-shield RP18(3.0mm,100mm,1.7,m),UPLC,柱选择,17,方法开发,开发中试验了,pH,从,3.0,到,10.0,缓冲液,磷酸,盐,硫酸,盐,醋酸盐,在碱性缓冲液,pH,约,8.0,当于磷酸缓冲液,的,分离,度与拖尾因子,令人满意,因此,选择,磷酸氢二铵盐缓冲,液用于,分析,缓冲系统选择,18,方法开发,在,流动相,B,评价了,乙腈,与甲醇,在流动相,B,中使用,乙腈,具有,更好,的分离度与拖尾因子,甲醇尝试作为一个,有机改进剂,时,所有峰,拖尾,因子,都不在,系统适用性标准范围内,因此乙腈,用于分析中的有机改进剂,有机改进剂选择,19,方法开发,预混缓冲区,液与,有机改进剂符组合,制备,流动相,A,与,流动相,B,来改善,基线干涉,尝试了,各种,时间程序,组合,最后,确定,所有杂质,与降解产物,都,与,拉呋替丁主峰,分离,所选定,波长,276nm,是拉呋替丁紫外,吸收最,大值,选择优化柱温为,35,C,使关键的,拉呋替丁,与杂质,D,的分离度,最大,色谱条件优化,20,方法开发,选择,3mm,直径流量,0.5ml/min,的理由是流量,增加减少,杂质,D,与,拉呋替丁之间,分离度,小于,2.0,不能接受,计算总流量不考虑,2,m,粒径影响,因为,在宽泛,流,量,率恒定时,从,Van Deemter,曲线,在大约,1.7,m,粒子大小,可以达到最低,等量,理论塔板高度,(,或最高,分离度）,色谱条件优化,21,方法开发,典型保留时间,杂质,A:1.37,分,杂质,B:1.75,分,杂质,C:3.64,分,杂质,D:4.79,分,拉呋替丁,:5.04,分,色谱条件优化,22,典型图谱,空白,23,典型图谱,标准,24,杂质鉴定,在,拉呋替丁,中在,0.15%,水平加入,1,000,g/ml,的杂质,A,B,C,D,来确认在选定条件下,杂质保留时间,所有杂质是彼此很好,分离,在,已确定杂质,中,杂质,A,B,来自降解,杂质,C,来自关键起始物料与,降解杂质,杂质,D,为相关,杂质,25,系统适用性标准,系统适应性试验是基于取得的几个代表光谱分析结果来,确定,分析物峰,柱效,20,000,拖尾,因子,2.0,系统适用性溶液,六次进样,杂质,峰面积,相对标准偏差,(RSD)2.0,26,系统适应性测试结果,物质,相对,保留时间,理论,塔板数,拖尾因子,(T),分离度,(R,s,),杂质,A,0.27,25,721,1.33,-,杂质,B,0.35,35,801,1.10,5.69,杂质,C,0.72,26,913,1.60,21.64,杂质,D,0.95,29,211,1.14,11.12,拉呋替丁,1.00,32,469,1.15,2.93,27,专属,性,降解,研究数据显示降解产物,与,拉呋替丁,良好分离,(,纯度角度小于纯度阈值,),观察,到在,酸,碱,过氧化氢溶液重大,降解,28,降解实验图谱,酸降解,29,降解实验图谱,碱降解,30,降解实验图谱,氧化降解,31,强制降解结果,降解条件,拉呋替丁含量,(%),结果与平衡,峰纯度角,峰纯度阈值,未处理,98.74,-,0.205,0.530,酸,84.29,11.71%,未知降解物以及其它杂质,0.122,0.391,碱,84.65,杂质,B,增加到,6.96%,杂质,C,增加到,4.06%,3.85%,未知降解物以及其它杂质,0.165,0.433,氧化,85.21,未知降解物增加到,8.48%,以及其它杂质,0.072,0.341,热,98.97,已知与未知杂质无显著变化,0.214,0.505,光,98.85,已知与未知杂质无显著变化,0.214,0.505,32,线性,稀释杂质,储备液到需要浓度,定量限到,250%,六个浓度,LOQ,0.75,1.2,1.5,2.25,3.75,g/,ml,对数据用,统计分析中的线性回归模型,33,检测,限,/,定量限,按照峰面积标准偏差与线性数据斜率确定,检测限,与,定量限,杂质,A,杂质,B,杂质,C,杂质,D,的检测限与定量限度分别从,0.007%,至,0.022%,0.008%,至,0.023%,定量限浓度用,6,次进样精密度计算,定量限精密度从,1.22%,至,9.78%,34,精密,度,系统,精密,度,有关物质测定,的,系统精度,用系统适应性混合物,进样,六,次,拉呋替丁,与杂质峰精密度从,0.36%,至,1.30%,35,精密,度,方法,精密度研究包括方法精密度与,中间,精密度,有关物质方法,精密度,通过分析六个,加杂质,A,杂质,B,杂质,C,杂质,D,样,拉呋替丁,样品溶液,评价每个相关杂质的相对标准偏差,RDS(n=6),在中间,精密度,研究中,用同样的规程,不同分析师,不同流动相,不同,稀释剂,不同仪器,不同日期,相同品牌但不同批号的柱,有关物质,百分比相对标准偏差,在,0.4%-1.5%,36,准确度,所有的有关物质方法准确,度通过测试加样的,拉呋替丁,样品溶液得到,在,七个不同浓度,加样,LOQ,20%,40%,50%,80%,100%,150%,一式三份,所有,相关,物质,回收率在接受标准,80.0%120.0%,范围内,37,分析溶液,稳定性,在特定程度上在,拉呋替丁,溶液中加有关物质,立即分析,不同时间间隔,分析,最后,达,48,小时,样品溶液,保持,在,25,C,在这样的条件下,48,小时内稳定,38,耐用,性,评价开发方法的耐用性,人为改变色谱,条件,评估洗脱对,杂质,D,与,拉呋替丁峰,分离度,流量影响,:,改变了,0.1,单位,即从,0.4ml/min,到,0.6ml/min,温度影响,:32,C,到,38,C,所有其他流动相,成分,保持不变,在上述条件下,拉呋替丁,拖尾因子小于,1.30,任何两个峰之间,分离度,大于,2.0,所有改变条件对拖尾因子与分离度影响微小,说明该方法,耐用,39,样品分析,样品来源,杂质,A,杂质,B,杂质,C,杂质,D,制剂产品,一号,未检出,未检出,未检出,0.05,二号,未检出,未检出,未检出,0.04,原料药,一号,未检出,未检出,小于检出限,0.04,二号,未检出,小于检出限,小于检出限,0.03,三号,未检出,小于检出限,小于检出限,0.04,40,验证结果,物质,有关物质,杂质,A,杂质,B,杂质,C,杂质,D,精密度,(,平均值,标准偏差,),方法精密度,(n=6),0.1510.87,0.1550.40,0.1621.22,0.1550.91,中间精密度,(n=6),0.1520.85,0.1580.38,0.1611.30,0.1570.93,全部结果,(n=12),0.1520.86,0.1560.39,0.1621.26,0.1560.92,41,验证结果,物质,有关物质,杂质,A,杂质,B,杂质,C,杂质,D,检测,/,定量限度,检测限,0.008,0.008,0.016,0.016,定量限,0.023,0.024,0.048,0.049,42,验证结果,物质,有关物质,杂质,A,杂质,B,杂质,C,杂质,D,相关杂质线性与范围,:,从定量限到规格标准,250%,相关系数,0.9991,0.9999,0.9962,0.9995,斜率,55146.15,65742.56,57225.13,40483.59,截距,115.8901,74.74945,-685.587,31.98923,43,验证结果,物质,有关物质,杂质,A,杂质,B,杂质,C,杂质,D,准确度,(,平均回收率,):,从定量限到规格标准,150%,定量限,92,86,106,90,20%,103,102,85,99,40%,102,102,92,102,50%,109,101,95,100,80%,101,101,98,101,100%,102,101,98,102,150%,101,100,101,99,44,分析方法验证,拉呋替丁超高效液相色谱稳定性指示性方法开发与验证,现代验证系列,