DB64∕T 829-2021 葡萄苗木病毒检测技术规程(宁夏回族自治区).pdf

ICS 65.020 CCS B 16 电电导g电J DB 64/T 829-2021 代替DB64/T829-2013 Rules for virus detection of grapevine seeding 2021 - 08 -13发布2021 -11 -13实施宁夏回族自治区市场监督管理厅发布DB 64/T 829-2021 F.lIJ 本文件按照GB/T1. 1-2020 标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件代替DB64/T 829-2013 葡萄茵木病毒检测技术规程)，与DB64/T 829-2013相比，主要变化如下:一一增加了第3章术语与定义(见第3章的3.1、3.2、3.3); 一一增加了葡萄苗木主要检测对象(见第4章); 一一增加了二重RT-PCR检测方法(见7.3); 一一一更改了总RNA提取和反转录方法，并补充了HSP70和RdRp基因设计的特异性引物(见附录B, DB 64/T 829-2013的附录B)。请注意本文件的某些内容可能设计专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由宁夏贺兰山东麓葡萄产业园区管委会提出，归口，并实施。本文件起草单位:宁夏大学、宁夏林业研究院股份有限公司、宁夏农林科学院植保所、宁夏农垦玉泉营茵木繁育有限公司本文件主要起草人:顾沛雯、徐美隆、闰思远、张怡、沈效东、吕苗苗、马文礼、刘静、谢军、乔改霞、何金柱、李治锋、拓维庶、康宏。I DB 64/T 829-2021 葡萄菌木病毒检测技术规程1 范围本文件规定了葡萄病毒检测技术的术语和定义、检测对象、取样部位、抽样、检测方法和检测结果的判定。本文件适用于葡萄母本树、葡萄种条、组培苗、抒插苗、嫁接茵的RNA病毒检测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件:不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。NY 469葡萄苗木NY/T 1843葡萄无病毒母本树和苗木NY/T 2377葡萄病毒检测技术规范NY/T 2378葡萄苗木脱毒技术规程DB/T 956葡萄种条病毒检测方法3 术语和定义3霄1下列术语和定义适用于本文件。双抗体夹心酶联免疫检测法(Doubleantib协od句ys臼an时dw川IC由henzyme-I i n陆ked川m刚n刊m阳nDAS一E日LlSA)将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体抗原-固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原含量。来源NYfT2729-2015，有修改3.2 逆转录一聚合酶链式反应(Reversetranscription-polymerase chain reaction, RT-PCR) 又称反转录-聚合酶链式反应，是指提取组织或细胞中的总卧.JA，以其中的m孙JA为模板，利用逆转录酶将mRNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，从而获得目的基因或检测基因表达。因植物病毒均有RNA状态时期，经反转录后成为cDNA，再进行一般PCR扩增，故称为RT-PCRo来源GBfT18936-2020，有修改3凰3二重RT-PCR检测(阳ultipleRT-PCR detection) 又称多重引物PCR或复合PCR，是在同-PCR反应体系里加上两对以上引物，同时扩增出目标片段的PCR反应。增加两对引物进行扩增的RT-PCR反应称为二重RT-PCR。来源DB41fT 706-2011，有修改4 检测对象葡萄苗木病毒主要检测对象如下:a)葡萄扇叶病毒(glevinefanleaf virus, GFL V) 1 DB 64/T 829-2021 b)葡萄卷叶伴随病毒-1Cgrrpevine leafroll associated virus 1, GLRa V -1 ) c)葡萄卷叶伴随病毒之Cgrapevineleafroll associatedvirus 2, GLRaV-2) d)葡萄卷叶伴随病毒-3Cgrapevine leq斤-ollassociated virus 3, GLRaV-3) e)葡萄卷叶伴随病毒-4Cgrapevine leq斤。IIassociated virus 4, GLRa V -4) f)葡萄卷叶伴随病毒Cgrapevineleq斤。IIassociatedvirus 5, GLRaV-S) g)沙地葡萄茎痕相关病毒Cgrapevinerupes什isstem pitting associated virus , GRSPa V) f)葡萄病毒AC grapevine virus A, GV A) g)葡萄病毒BCgrapevine virus B, GVB) h)葡萄斑点病毒CgrapevineFleck Virus, GFkV)。5 取样部位病毒检测取样部位见表1。休眠期取成熟枝条，撕开表皮，用小刀刮取韧皮部组织:新稍生长期取完全伸展幼嫩叶的叶脉和叶柄。各样品称取1g左右。叶片和枝条样品若1周内检测，则存放在40C冰箱;若超过1周检测，则存放在一860C超低温冰箱，保存，备用。表1取样部位病毒种类取样部位葡萄扇叶病(GFLV)葡萄卷叶伴随病毒-1(GLRaV-I) 葡萄卷叶伴随病毒之(GLRaV-2)葡萄卷叶伴随病毒-3(GLRaV-3) 休眠期取成熟枝条，撕开表皮，用小刀刮取韧皮部组织;葡萄卷叶伴随病毒-4(GLRaV-4) 新稍生长期取完全伸展的幼嫩叶的叶脉和叶柄;对GFLV葡萄卷叶伴随病毒-5(GLRaV-5) 在新梢生长期至开花期检测灵敏度更高。沙地葡萄茎症相关病毒(GRSPaV)葡萄病毒A(GVA) 葡萄病毒B(GVB) 葡萄斑点病毒(GFKV)6 抽样6. 1 葡萄母本树和采条树的抽样每株均需检测。按NY469、NY/T1843和DB/T956有关葡萄茵木、葡萄母本树和葡萄种条采集的规定执行。6.2 出国苗木的抽样采用随机取样方法抽取出圃茵木进行病毒检测。以1万株抽检10株为基数不足1万株以1万株计), 10万株内(含10万株)，每增加1万株增检5株，超过10万株，每增加1万株增检2株。按NY/T1843执行。7 检测方法7.1 DAS-ELISA检测法检测方法见附录A。2 7. 2 单-RT-PCR检测按NY/T2377执行，检测方法见附录B。7. 3 多重RT-PCR检测检测方法见附录C。8 检测结果的判定如下:DB 64/T 829-2021 a) 凡酶联免疫检测或RT-PCR检测呈阳性反应的为带毒苗木。考虑到GLRaV-3在各葡萄产区检测率高，对RT-PCR检测呈阴性反应的样品9需要用其它基因再进行一次检测，若本次检测为阳性，则判定为带毒苗木。b) 葡萄母本树和采条树:带毒率为0。c) 出圃苗木:带毒率三3.0%。3 DB 64/T 829-2021 附录A(规范性双抗体夹心酶联免疫检测法(DAS-ELISA)A. 1容j夜自己制A. 1. 1 抽提缓冲液抽提缓冲液的配制见表A.lo表A.1抽提缓冲液的配制试剂(AR)名称工搓甲基氨基甲皖(Tris)氯化纳(NaCI)聚乙烯毗咯:院自同(PTP), 11VV40000 聚乙二醇(PEG)叠氮化纳(NaN3)吐温-20(Tween-20) 质量60.50 g 8.00 g 20.00 g 10.00 g 2.00 g 0.50 g 注:将以上试剂依次溶于900mL蒸馆水中，用盐酸将溶液pH值调整到8.2，再用蒸馆水定容至1000mL，40C下保存，有效期1年。A.1.2 洗涤缓冲液洗涤缓冲液的配制见表A.2。表A.2洗涤缓冲液的配制试剂(AR)名称质量氯化纳(NaCI)8.00 g 磷酸氢二纳(Na2HP04)1.15 g 磷酸二氢伺(阳2P04)0.20 g 氯化饵(KCI)0.20g 吐温-20(Tween-20) 0.50 g 注:溶于900mL蒸馆水中，用盐酸将溶液pH值调整到7.4，再用蒸馆水定容至1000mL, 40C下保存，有效期1年。A.1.3 包被缓冲液包被缓冲液的配制见表A.3。表A.3包被缓冲液的配制试剂(AR)名称质量碳酸纳(NaC03)1.59 g 碳酸氢纳(NaHC03)2.93 g 叠氮化纳(NaN3)0.20 g 注:溶于900mL蒸馆水中，用盐酸将溶液pH值调整到9.6，再用蒸馆水定容至1000n止，40C下保存，有效期l年。4 DB 64/T 829-2021 A.1.4 酶标抗体稀释缓冲液酶标抗体稀释缓冲液的配制见表A.4。表A.4酶标抗体稀释缓冲j夜的配制试剂(AR)名称质量牛血清蛋白(BSA)2.00 g 聚乙烯毗咯炕酣(PTP), 11VV40000 20.00 g 叠氮化纳(NaN3)0.20 g 注:溶于100mL洗涤缓冲液中(A.1.2)。不同抗血清，稀释缓冲液不同，应根据血清试剂盒说明配置。A.1.5 底物缓冲液底物缓冲液的配制见表A.5o表A.5底物缓冲液的配制试剂(AR)名称质量六水氯化镇(11gCh吧H20)0.10 g 叠氮化纳(NaN3)0.20 g 二乙醇胶(MDEA)97.00 ml 注:溶于900mL蒸惰水中，用盐酸将溶液pH值调整到9.8，再用蒸惰水定容至1000mL. 40C下保存，有效期1年。A.1.6 底物溶液(现用现配)5 mg4-硝基苯基磷酸二纳盐(PNP)溶解于5mL底物缓冲液。A. 2 样品制备取样品0.4g，加入2mL抽提缓冲液，充分研磨，40C条件下10000rpm离心10mil1，取上清液备用。A.3 操作步骤A. 3. 1 包被抗体用包被缓冲液按照抗体使用说明书中的稀释倍数稀释抗体，每加样孔中加120L经过稀释的抗体，370C保湿孵育2h或40C保湿过夜。A.3.2 洗板用洗涤缓冲液洗板3次，每次浸泡3mil1 5 mil10 A.3.3 包被样品每加样孔加样品110阵，370C保湿孵育2h或40C保湿过夜。同时设阴性、目标病毒的阳性和空白对照，可根据需要设置重复。A.3.4洗板同A.3.2o5 DB 64/T 829-2021 A.3.5 包被酶标抗体用酶标抗体稀释缓冲液按照酶标抗体说明书的稀释倍数将其稀释，每加样孔加100L经过稀释的酶标抗体，370C保湿孵育2h或40C保湿过夜。A.3.6 洗板同A.3.2。A.3.7 加底物每力日样孔加底物溶液90阵，室温避光反应1h。A.3.8 终止反应每加样孔加入50L3 mollL的NaOH终止反应。A.3.9 酶联检测用酶标仪检测405m丑的光吸收值(OD405)，记录反应结果。A.3.10 判断标准如下:6 a) (检测样品OD405-空白对照OD405)I (阴性对照OD405-空白对照OD405)三2为阳性。b) 1.5三(检测样品OD405-空白对照OD405)I (阴性对照OD405-空白对照OD405)三2应重复试验，进一步确定。c) (检测样品OD405-空白对照OD405)I (阴性对照OD405-空白对照OD405)三1.5为阴性。B. 1 试剂盒B. 1. 1 植物RNA提取试剂盒附录B(规范性)单一RT-PCR检测DB 64/T 829-2021 因葡萄富含多糖多盼，购买植物时A提取试剂盒时，应选用去糖去盼的试剂盒，按说明书进行操作，提取葡萄总RNAoB. 1.2 反转录试剂盒参照反转录试剂盒说明进行操作oB. 1.3 PCR扩增试剂盒参照PCR扩增试剂盒说明进行操作。B.1.4 GelStain矛日DNA Marker-2K 参照试剂盒说明进行操作oB. 2 引物B. 2. 1 病毒PCR引物见表B.1。表B.1葡萄病毒的特异性引物序列病毒基因引物引物序列(5-3)PMl 5二CCCTCAACCAGAGCCAATTA-3GLFV CP PM2 5-GGCATTGGTAGAGGCAACAT-3 Fl 5-TCTTTACCAACCCCGAGATGAA-3 GLRaV-l CP Rl 5-GTGTCTGGTGACGTGCT AAACG-3 F2 5-CATTATATTCTTCATGCCTCTCAGGAT-3 GLRaV-2 CP R2 5-GATGACAACTTCTGTCCGCTATAGC-3 F 5-ATGGCATTTGAACTGAAA T-3 CP R 5-CTACTTCTTTTGCAATAGT-3 吼叫5-CCATTTGTCCAGCAACAC-3 GLRaV-3 RdRp W5 5-CCGACTAAATATAAGGCTATC-3 F3 5-CGCTAGGGCTGTGGAAGTATT-3 HSP70 R3 5二GTTGTCCCGGGTACCAGATAT-3F4 5-ACATTCTCCACCTTGTGCTTTT-3 GLRaV圄4CP R4 5-CATACAAGCGAGTGCAATTAC-3 F5 5-CCCGTGATACAAGGTAGGACA-3 GLRaV嗣5CP R5 5仁CAGACTTCACCTCCTGTTAC-3扩增片段大小Tm 登录号(bp) 550C 378 h桂-J496420.1520C 232 HE649961.1 520C 93 h在1814501. 1520C 942 LR215345.1 550C 683 MK804765.1 550C 546 MK947126.1 520C 321 MF669483.1 550C 690 KJ466304.1 7 DB 64/T 829-2021 病毒基因引物Sy9F GRSPaV Rdl毛pSy8R H587 GVA CP C995 C410 GVB CP H28 U279 GFkV RdRp L630 B. 2. 2 葡萄内参基因引物见表B.2o内参基因18S rRNA B.3 操作步骤B. 3. 1 葡萄总RNA提取引物序列(5-3)Tm 5-AGGATTCCAAACTGTAGAGCAA-3 560C 5-TTGGTCGTCATCTTCCAGTT-3 5-GACAAATGGCACACTACG-3 520C 5-AAGCCTGACCTAGTCATCTTGG-3 5-GTGCTAAGAACGTCTTCACAGC-3 570C 5国ATCAGCAAACACGCTTGAACCG-3 5-TGGTCCTCGGCCCAGTGAAAAAGTA-3 550C 5-GGCCAGGTTGTAGTCGGTGTTGTC-3 表B.2葡萄内参基因引物引物序列上游引物5-CGCATCATTCAAATTTCTGC-3 下游引物5-TTCAGCCCTTGCGACCATACT -3 参照卧.JA提取试剂盒说明进行，要点如下:a)称取葡萄韧皮部组织在加液氮条件下快速研磨成粉末;扩增片段大小登录号(bp) 628 MG938346.1 430 MJ王404722.1460 MF446633.1 352 KJ801846.1 扩增片段大小(bp)844 b)时.JA质量检测:若葡萄总时.JA提取电泳出现两条清晰明亮带，分别为28Sr卧JA和18Sr卧.JA。紫外分光光度计测得OD260/0D280比值约为2.0以上，表明所提取的总RNA完整性和纯度较好，不需要再进行cDNA检测。以此为模板直接进行反转录和PCR扩增。B.3.2 反转录参照反转录试剂盒说明进行反转录成cDNA，所得cDNA即用或保存于-200C冰箱备用。B.3.3 cDNA质量检测以内参基因18SrRNA为参考标准。B.3.3.1内参基因18SrRNA的PCR扩增在PCR反应管中依次加入2xReaction Buffer 12.5L、Taq酶0.2阵、内参基因18Sr时.JA上下引物各1L、cDNA模板0.5阵、无菌超纯水9.8.L，使PCR反应体系达到25L。将PCR管放入PCR仪中，950C 预热3min;进行35次循环(950C变性30s, 520C退火30s, 720C延伸到s)720C延伸5min，取出PCR反应管，对反应产物进行电泳检测或4oC条件下保存备用。B.3.3.2内参基因18SrRNA扩增产物的电泳检测j8 DB 64/T 829-2021 根据实验室电泳槽的大小，将适量的琼脂糖加入1xTBE缓冲液中，终浓度为1%，将其加热溶解9按照每11丑L琼脂糖溶液中加入0.5gDNA染液(GelStain) ，加入GelStain1昆匀，待冷却到600C左右时9将其倒入电泳板上，室温下凝固成凝胶后，放入1xTBE缓冲液。每个泳道加入10L的PCR产物，旁边泳道加入DNAMarker-2K (DNA分子量标记), 100 V条件下电泳60min。B. 3. 3. 3 ;胶成像分析电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪上成像，根据DNA分子量标记判断扩增出的目的条带大小，只有电泳条带大小为844bp的cDNA才能用于后期的病毒检测。B恒3.4病毒检测B. 3.4.1病毒检测的PCR扩增PCR的反应体系和程序除了各自病毒检测的上下引物需要对应表B.1外，其他步骤同B.3.3.1PCR反应体系和反应程序。B.3.4.2不同扩增产物的电泳检测同B.3.3.2。B.3.4.3疑胶成像分析电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪上成像，根据DNA分子量标记判断扩增出的目的条带大小，拍照存档后进行检测分析。B.3.4.4结果判定判定如下:a)如果检测样品和对应的阳性对照同时出现大小一致的目的条带，而阴性对照、空白对照均不出现该条带，该样品判为阳性;b)如果对应的阳性对照出现目的条带，而样品、阴性对照、空白对照均不出现该条带，该样品判为阴性;c)如果阳性对照、样品、阴性对照、空白对照均不出现该条带，重新进行RT-PCR检测:d)考虑到GLRav-3在各样本中检测率高，在利用CP基因检测后为阴性的样品，再用RdRp或HSP70基因进行复检，如果为阳性，则该样品判为阳性。9 DB 64/T 829-2021 。1试剂盒附录C(规范性二重RT-PCR检测植物RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、PCR扩增试剂盒、GelStain和DNAMarker-2K均同B.loC.2 引物进行GLRaV-l矛日GLRaV-3的二重RT-PCR检测，病毒PCR引物和葡萄内参基因引物均见表B.l和表B.2。C.3 操作步骤C.3.1 葡萄RNA提取具体步骤同B.3.1。C.3.2 反转录具体步骤同B.3.2。C. 3. 3 cDNA质量检测具体步骤同B.3.2。C.3.4 病毒检测C.3.4.1 PCR的反应体系总cDNAO.15g/阵、正向引物、反向引物各0刀M、EasyTaqDNA聚合酶3D、2.51出1dNTPs 2 L、10 xEasyTaqBuffer2.5L、用卧.Jase-free W ater 每体积补足至25L。C.3.4.2 PCR的反应程序PCR反应程序中除退火温度选择2种待检病毒或3种待检病毒退火温度平均值外，其他步骤同B.3.3.1PCR反应程序。C.3.4.3不同扩增产物的电泳检测同B.3.3.2。若样品中含有2种病毒，二重RT-PCR会出现检测目标病毒的2条亮带。C. 3. 4.4 ;.疑胶成像分析同B.3.4.30 C.3.4.5结果判定判定情况同B.3.4.4o10