核酸及其多糖的提取.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作。,第一部分：DNA提取方法简介,第二部分：DNA提取常见问题、,原因分析及其对策,第三部分：RNA提取方法简介,第四部分：RNA提取及其常见问题、,原因分析及其对策,DNA提取的基本步骤,I.材料准备,II.破碎细胞或包膜内容物释放,III.核酸分离、纯化,IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质,V.核酸溶解在适量缓冲液或水中,DNA提取的几种方法,基因组DNA的提取,CTAB法,SDS法,其它,基因组DNA CTAB法,CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物,。,该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。,注：,CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的,植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15,。,CTAB提取缓冲液的经典配方,组份,Tris-HCl （pH8.0）,EDTA（pH8.0）,NaCl,CTAB,-巯基乙醇,终浓度,100 mM,20 mM,1.4M,2%(W/V),0.1%（V/V）使用前加入,Tris-HCl（pH8.0）,提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；,EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；,NaCl,提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中；,CTAB,溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；,-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除。,CTAB法流程图,植物材料,裂解液,上层溶液,液氮研磨,抽提,细胞裂解,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA溶液,基因组DNASDS法,SDS法原理,SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（5565）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；,提高盐(KAc或NH,4,Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。,SDS法DNA提取缓冲液,组份,Tris-HCl（pH8.0）,EDTA（pH 8.0）,NaCl,SDS,终浓度,10 mM,20 mM,0.4M,2%,SDS法流程图,（以动物组织为例）,动物组织,细胞裂解,上层溶液,组织匀浆,抽提,干燥溶解,离心洗涤,酒精沉淀,DNA溶液,基因组DNA提取的其它方法,根据细胞裂解方式的不同有：,物理方式,：玻璃珠法、,超声波法、研磨法、冻融法,化学方式,：异硫氰酸胍法、碱裂解法,生物方式,：酶法,非基因组DNA的提取,质粒DNA的提取,碱裂解法,煮沸法,线粒体、叶绿体 DNA的提取,差速离心结合SDS裂解法,质粒,DNA,的提取：材料准备,使用处于对数期的新鲜菌体（老化菌体导致开环质粒增加）,培养时应加入筛选压力，否则菌体易污染，质粒易丢失,尽量选择高拷贝的质粒，如为低拷贝或大质粒，则应加大菌体用量,菌株不要频繁转接（质粒丢失）,质粒,DNA的,提取：细胞裂解,菌体量适当,培养基去除干净，同时保证菌体在悬浮液中充分悬浮,变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断,复性时间也不宜过长，否则会有基因组DNA的污染,G菌、酵母质粒的提取，应先用酶法或机械法处理，以破壁,质粒,DNA提取,碱裂解法,煮沸法,质粒DNA提取碱裂解法,碱裂解法原理,染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；,当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；,变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,质粒DNA碱裂解法,对数期菌体,溶液III中和,溶液I充分重悬,溶液II裂解,上清液,抽提,离心洗涤,酒精沉淀,干燥溶解,沉淀,质粒DNA溶液,碱裂解法流程图,质粒DNA煮沸法,煮沸法原理,染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；,当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；,变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相中，从而可通过离心将两者分开。,细胞器DNA提取,差速离心法,线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来,差速离心法原理,是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。,将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层，从而得以分离。,核酸分离纯化,吸附材料结合法：,硅质材料,高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值 洗脱。快捷,高效。,阴离子交换树脂,低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用,于纯度要求高的实验,磁珠,磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从,而达到分离目的,核酸分离、纯化,采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系,采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔,离心分离两相时，应保证一定的转速和时间,针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,核酸分离、纯化,蛋白质的去除,：,酚/氯仿抽提,使用变性剂变性（SDS、异硫氰酸胍等）,高盐洗涤,蛋白酶处理,核酸分离、纯化：多糖去除,高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。,用多糖水解酶将多糖降解。,在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。,用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500L DNA液中加入200l 20%PEG8000(含1.2 M NaCl)，冰浴20min。,多酚的去除,在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等,加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合,盐离子的去除,：70的乙醇洗涤,核酸沉淀、溶解,当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分,沉淀时加入1/10体积的,NaAc（pH5.2，3M,），有利于充分沉淀,沉淀后应用70的乙醇洗涤，以除去盐离子等,晾干,DNA,，让乙醇充分挥发（不要过分干燥）,若长期储存建议使用,TE,缓冲液溶解,TE,中的,EDTA,能螯和,Mg2+,或,Mn2+,离子，抑制,DNase,pH,值为,8.0,，可防止,DNA,发生酸解,RNA提取的通用方法,异硫氰酸胍/苯酚法,原理：,1.,细胞在变性剂异硫氰酸胍的作用下被裂解，同时核蛋白体上的蛋白变性，核酸释放；,2.释放出来的DNA和RNA由于在特定pH下溶解度的不同而分别位于整个体系中的中间相和水相，从而得以分离；,3.有机溶剂抽提，沉淀，得到纯净RNA。,步骤：,材料准备：尽量新鲜。,裂解变性：异硫氰酸胍,（,亚硫氢胍，巯基乙醇，N-月桂肌氨酸等）。,使细胞及核蛋白复合物变性，释放RNA，有效抑制核酸酶。,纯化分离：苯酚，氯仿，异戊醇。苯酚/氯仿可抽提去除杂物,。,洗涤：70乙醇。,沉淀：异丙醇、无水乙醇。乙酸钠（pH4.0）：维持变性的细胞裂解液的pH值，沉淀RNA。,此外还常用氯化锂选择沉淀RNA,RNA提取常见问题,RNA 的降解,OD,260,/OD,280,比值偏低,电泳带型异常,下游实验效果不佳,RNA降解,新鲜细胞或组织：,裂解液的质量,外源RNase的污染,裂解液的用量不足,组织裂解不充分,另外某些富含内源酶的样品(如脾脏，胸腺等)，很难避免 RNA 的降解。,建议在液氮条件下将组织碾碎，并且匀浆时使用更多裂解液。,冷冻样品：,样品取材后应立即置于液氮中速冻，然后可以移至-70冰箱保存。样品要相对小一点；,先用液氮研磨，再加裂解液匀浆；,样品与裂解液充分接触前避免融化，研磨用具必须预冷，碾磨过程中及时补充液氮。,多糖的提取,多糖是存在于自然界的醛糖和(或)酮糖通,过糖苷键连接在一起的聚合物，它是生物体除,蛋白质和核酸以外的又一类重要的信息分子。,种类繁多的植物多糖，存在于植物中的部位,不尽相同。而且，一般植物细胞壁比较牢固，,在提取前需进行专门的破细胞操作。,植物多糖提取的研究中采用了许多不同的,方法，包括溶剂提取法、酸提法、碱提法、酶,解法、超滤法、超声波强化法、微波法。,1溶剂提取法,溶剂提取法首先要考虑的因素是选择溶剂，,一般都应遵循相似相溶的原则，即极性强的有,效成分选择极性强的溶剂，极性弱的有效成分,选择极性弱的溶剂。多糖是极性大分子化合物,应选择水、醇等极性强的溶剂。,一般植物多糖提取多数采用热水浸提法，该法,所得多糖提取液可直接或离心除去不溶物；或,利用多糖不溶于高浓度乙醇的性质，用高浓度,乙醇沉淀提纯多糖。,2酸提法,有些多糖适合用稀酸提取,并且能得到更,高的提取率。,孟宪元等在茜草多糖提取研究中,发现相对于水提,以稀酸提取茜草多糖,产品纯度较高。,具体方法如下:茜草根粗粉1000g，5%HC1,浸泡，离心，取上清液加入EtOH并调节至,浓度为70%，静置，2500 rpm 离心，收集棕色,沉淀物，95%EtOH 洗涤3 次，以4%HCl 溶解,加1%活性炭脱色，真空抽滤，滤液4过夜，弃,去容器底部少许沉淀物，溶液置透析袋内，逆水,法透析3日，冷冻干燥，得白色粉末约10g(多,糖A)。,3碱提法,采用稀碱提取:多为0.1 1,M,氢氧化钠、,氢氧化钾，为防止多糖降解，常通以氮气或加,硼氢化钠或硼氢化钾。,碱提优势也是因多糖类的不同而异。与酸,提类似,碱提中碱的浓度也应得到有效控制,因为有些多糖在碱性较强时会水解。,4酶提法,在多糖的提取过程中,使用酶可降低提取条件,在比较温和的条件中分解植物组织,加速多糖,的释放或提取。,此外,使用酶还可分解提取液中淀粉、果胶、,蛋白质等非目的物,常用的酶有蛋白酶,纤维素酶,果胶酶等。,周峙苗得到酶解法提取羊栖菜多糖的最佳实验,参数为：加纤维素酶量为8%(酶/藻粉)，,果胶酶量为4%(酶/藻粉)，pH3.4，酶解时间,3h，酶解温度为50。,5超滤法,超滤是一种膜分离技术，所采用的超滤膜能,够从水和其他液体中分离出很小的胶体和大分,子。由于超滤膜具有不对称微孔结构，且采用,磨擦流道和湍流促进结构，减少膜污染，使得,在分离过程中大分子溶质和微粒(如胶体，淀粉,等)随溶液切向流经膜表面，而小分子物质和溶,剂则在压力驱动下穿过致密层上的微孔而进入,膜另一侧，因而超滤膜可以长期连续使用并,保持较恒定的产量和分离效果。,将超滤膜用于多糖这种生物活性物质的分离，,具有不损害活性、分离效率高、能耗低设备,简单、可连续生产、无污染等优点。,