江大微生物学课件6.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生产菌株来源,1、索取或购买,2、自己选育,(1)用原有菌株进行遗传改造进行育种,诱变育种,基因重组育种,(2)向菌种保藏机构索取、购买出发菌株进行选育,(3)从自然界中分离菌种,从自然界中分离菌种就是从自然界微生物资源中有目的、快速、准确地选出所需要的菌种。,设计方案采样增殖培养*平板分离 筛选(初筛、复筛)单株纯种分离 性能考察(生产性能试验、毒性试验、菌种鉴定）,从自然界中分离筛选菌种的一般步骤,采样,从自然界种采集含目的菌的样品,1环境条件对土样本中微生物分布的影响,（1）营养环境,高糖环境（加工蜜饯、糖果、蜂蜜的环境）土壤中：耐渗透压酵母，柠檬能产生菌，氨基能产生菌；,富含淀粉环境污泥、水沟旁土壤中：淀粉酶产生菌；,森林中腐叶烂草下土壤：纤维素酶产生菌；,含蛋白质（蚕丝、豆饼、生皮晒厂）土壤中：蛋白酶产生菌；,油田土：石油分解菌；,二.增殖培养（富集培养）,1适用：样品中目的菌数量不够多时,2目的：提高样品中目的菌的数量和比例,3原理：通过控制营养成分或培养条件，使目的菌得以繁殖和/或非目的菌的生长受到抑制,4方法,（1）控制营养成分,纤维素为唯一碳源，可增殖分解纤维素的菌,可溶性淀粉为唯一碳源，可增殖产淀粉酶的菌种,酒精废水，可以增殖废水利用菌,但：多种微生物所利用的碳源、氮源不能作控制因素,（2）控制培养基pH,细菌、放线菌：中性偏碱，真菌：偏酸,但非目的菌的生长不能被完全抑制,（3）控制培养温度,30左右培养，可培殖嗜温微生物,5060培养，可培殖嗜热微生物，筛选耐热菌株,（4）热处理增殖芽孢细菌,样品悬浮液经80、10分钟处理，杀死营养体，再添加营养培养后可增殖产芽孢细菌,（5）添加抑制剂,10%酚数滴：抑制细菌霉菌生长，增殖放线菌,抗生素：抑制细菌放线菌，增殖酵母、霉菌,多粘菌素,B：,抑制,G,-,细菌,青霉素：抑制,G,+,细菌,制毒菌素：抑制真菌,放线菌酮：抑制真菌,三.纯种分离,目的：将目的菌从混杂的微生物中分离出来，获得纯培养,1纯种分离的一般方法,（1）稀释平板法：倾注平板或涂布平板,（2）划线法,（3）组织培养法：适用于分离高等真菌及植物病原菌,高等真菌：如香菇切1小块菌盖10%漂白粉消毒处理无菌水冲洗置琼脂平板上培养长出菌丝体,或：悬挂在有琼脂培养基的三角瓶内培养长出菌丝体,注意：对蔓延性霉菌：,加1%去氧胆酸钠,察氏培养基：0.01%蔗糖，0.1%山梨糖,2、平皿反应快速检出法定性或半定量,（1）纸片培养显色法,滤纸饱浸含有指示剂的液体培养基,用接种环接种,保湿恒温培养,据菌落周围变色圈和菌落直径比值判别目的物产量,（2）透明圈法：,根据琼脂培养上透明圈/菌落直径大小判别目的产物的产量,淀粉平板透明圈：淀粉酶,碳酸钙平板透明圈：产酸,酪素（蛋白）透明圈：蛋白酶,（3）变色圈法,淀粉平板喷稀碘液：透明圈，液化型淀粉酶,支链淀粉平板喷稀碘液：,蓝色圈：异淀粉酶,无色圈：液化型淀粉酶,葡聚糖平板加刚果红：葡聚糖酶,木聚糖平板加刚果红：木聚糖酶,（4）生长圈法,工具菌：,营养缺酸型，不能合成的物质（生长因素）为目的菌积累的产物,菌落形态明显不同于目的菌,方法：10,6,10,7,工具菌与样品稀释液一起涂布至琼脂培养基表面，具有生长圈的菌落即为目的菌,适用：氨基酸，核苷酸，维生素产生菌的选育,（5）抑制圈,适用：抗生素产生菌的选育,工具菌：对目的抗生素敏感的微生物,例：目的菌为产生抗,G,+,细菌的抗生素的菌株,工具菌可使用金黄色葡萄球菌,方法：,目的菌分离：稀释分离法，培养长出菌落,代谢物积累：用打孔器（6,CM）,将菌落连同周围琼脂培养基一起取下，放一无菌空培养皿内，保湿培养4-5天，使新产生抗生素积累于小琼脂块中,测定：取10,7,工具菌涂布于球脂培养基，将小琼脂块放于上面培养过夜，抑菌圈的出现，说明琼脂块中有抗生素，大小说明抗生素单位的高低,3、厌氧性微生物的分离法,厌氧培养法,去除培养基中溶解氧，降低,Eh,除去环境中的,O,2,（1）去除培养基中的溶解氧，降低Eh,煮沸法：将培养基置沸水中煮沸15分钟，驱除其中的溶解氧，用冷水急骤冷却，勿再摇动，,Eh,可降至0.1,V,以下,培养基预还原：将培养基中加入还原性物质：半胱氨酸，巯基化生物，,Na,2,S，,抗坏血酸等降低,Eh,（2）创造无氧环境,物理除氧,空气置换法：干燥器或厌氧培养罐,抽真空 76,mmHg,充入,N,2,（,反复3次）充入,CO,2,10%+H,2,10%+N,2,80%,化学除氧,H,2,+O,2,H,2,O (,钯作,催化剂）,GASPAK,罐除氧：硼氢化钠、柠檬酸，碳酸氧钠化学反应产生,H,2,和,CO,2,，H,2,与,O,2,反应生成水,厌氧指示剂,（3）厌氧分离（培养）技术,高层琼脂柱技术,厌氧罐技术,厌氧手套箱技术,厌氧培养装置,GasPak,四,、筛选,1、初筛：通风发酵菌种，通过摇瓶发酵进行，每株一瓶,目的：淘汰80%-90%的分离菌株中的低产菌,（1）培养条件：主要通过查阅资料及需要而预先决定：如培养基组成，通风量（装液量，摇瓶机转数），pH、温度、培养时间等。,（2）分析测定：最好定量，如较困难时可采取半定量方法,2、复筛：每株35瓶，可提前培养种子，使接种量比较一致，35%接种量，,培养条件可同初筛,分析测定：定量，注意副产物,复筛可进行多次，逐步淘汰，留下35株甚至最好的1株,初筛和复筛的比较,好氧培养,五、培养工艺条件试验与生产试验,1、摇瓶发酵条件,培养基组成，初始pH，通风量（装液量），接种量，培养温度,2、小型台式发酵罐发酵工艺条件,溶解氧控制，pH值控制，原料添加模式，消泡剂,第二节 菌种退化、复壮与保藏,在生物进化中：,遗传性的变异是绝对的，稳定性是相对的；,在变异中：,退化性的变异是大量的，进化性的变异是个别的。,一.菌种的退化,菌种退化,degeneration,的表现,生产形状的劣化,遗传标记的丢失,原有的典型形状的不典型等,菌落及细胞形态的改变,生长速度缓慢,代谢产物生产能力下降，即负突变,致病菌对宿主侵染力下降,抗不良环境条件（抗噬菌体，抗低温）能力减弱,2.菌种退化的原因：基因自发突变,退化是发生在群体细胞中的一个从量变到质变的逐步演变过程。,自发突变率10,-8,10,-9,加速退化的因素,传代次数过多,不适宜的培养条件,3.防止退化的措施,（1）控制传代次数,（2）创造良好的培养条件：培养基；培养温度等,保藏培养基：,细 菌：营养琼脂,放线菌：高氏一号,霉 菌：察氏培养基,酵母菌：YEPD。,（3）利用不易衰退的细胞传代：霉菌、放线菌：无性孢子或有性孢子,（4）采用有效的菌种保藏方法,二.菌种的复壮 rejuvenation,狭义复壮,在菌种已发生衰退的情况下，通过纯种分离和测定典型性状、生产性能等指标，从已衰退的群体中筛选出少数尚未退化的个体，以达到恢复原菌株固有性状的相应措施；,广义复壮,在菌种的典型特征或生产性状尚未衰退前，就经常有意识地采取纯种分离和生产性状的测定工作，以期从中选择到自发的正突变个体。也称,生产育种,1、纯种分离法,平板表面涂布法,平板划线分离法,琼脂培养基浇注法,用“分离小室”进行单细胞分离,用显微操纵器进行单细胞分离,用菌丝尖端切割法进行单细胞分离,菌落纯,（菌种纯）,细胞纯,（菌株纯）,纯种分离法,小滴分离法,2、通过宿主体复壮：病原菌,3、淘汰已衰退的个体,对,S.microflavus,“5406”农用抗生菌的分生孢子采用-10-30的低温处理57天，使其死亡率达到80%左右，结果会在抗低温的存活个体中留下未退化的个体，从而达到复壮的效果。,三.菌种的保藏,（一）目的,使微生物菌种保持原来的形状和活力不退化、不死亡、不被污染，便于研究、交换和使用。,（二）,原理,挑选典型培养物（typical culture）的优良纯种，并创造最有利于休眠的环境条，件使微生物处于代谢不活泼、生长受抑制的休眠状态。,措施：,低温：,生长温度低限约为-30，水溶液中酶促反应温度低限-140,干燥,缺氧,避光,缺乏营养,添加保护剂：,甘油、脱脂牛奶、血清白蛋白,添加酸度中和剂,（三）菌种保藏方法,1、斜面保藏法,方法：接种适宜斜面培养基 培养 4保藏,措施：低温：4,适用：各大类,保藏期：16个月,用橡皮塞代替棉塞，可适当延长保藏时间,2、石蜡油封藏法,方法：斜面或半固体接种 培养 加无菌液蜡高出培养基1cm415保藏,措施：低温，隔氧,适用：不能利用石油的各大类,保藏期：12年,优点：简便,3、砂土管保藏法,方法：孢子或芽孢悬液 加入无菌砂土管中 干燥 封口 保藏,措施：无营养，缺氧，干燥,适用：产孢子（芽孢）微生物,保藏期：110年,4、冷冻干燥保藏,方法：菌种培养 用保护剂悬浮 加入安醅管中低温冻结（-25-40）抽真空（至0.01mmHg）真空封口 检查真空度 保藏,措施：低温、干燥，缺氧，有保护剂,适用：各大类,保藏期：515年或更长,5、甘油悬液低温冷冻保藏法,方法：,菌种培养 1530%甘油缓冲液悬浮 加入保藏管中 置-70冰箱保藏,措施：,低温（-70）、保护剂（1550%甘油）,适用：细菌、酵母菌,保藏期：约10年,6、液氮保藏法,方法：菌种培养 保护剂悬浮 加入保藏管中 置液氮瓶中,措施：超低温（-196）、保护剂,适用：各大类,保藏期：15年,（四）菌种保藏机构,1、中国微生物菌种保藏管理委员会 CCCCM,中国普通微生物菌种保藏中心CGMCC(归口中国科学院),中国科学院微生物研究所(AS),中国科学院武汉病毒研究所(AS-IV),中国农业微生物菌种保藏中心ACCC(归口中国农业科学院),中国农业科学院土壤与肥料研究所(ISF),中国工业微生物菌种保藏中心CICC(归口轻工业总会),中国食品发酵工业研究所(IFFI),中国医学微生物菌种保藏中心CMCC(归口卫生部),中国医学科学院皮肤病研究所(ID)，南京,卫生部药品生物制品检定所(NICPBP),中国预防医学科学院病毒研究所,中国抗生素微生物菌种保藏中心CACC(国家医药管理局),中国医学科学院医药生物技术研究所,四川抗生素研究所(SIA)，四川,华北制药厂抗生素研究所(IANP),石家庄,中国兽医微生物菌种保藏中心CVCC(归口农业部),农业部兽药监察研究所(NCIVBP),中国林业微生物菌种保藏中心CFCC(归口中国林业科学院),中国林业科学院林业研究所(RIF),2、美国典型培养物收藏中心 ATCC,3、美国北部开发利用研究部 NRRL,4、荷兰霉菌中心保藏所 CBS,5、英国国家典型菌种保藏所 NCTC,6、日本大阪发酵研究所 IFO,