生物工程下游技术.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,目录,第一章：（绪论）,325,第二章：下游技术的理论基础,2642,第三章,：,发酵液预处理,4387,第四章,：,微生物细胞的破碎,88122,第五章,：,溶剂萃取和浸取,123167,第六章,：,超临界流体萃取,168213,第七章,：,双水相萃取技术,214250,第八章,：,反胶团萃取,251,287,第九章,：,膜分离过程,288353,第一章,（,绪论）,本章要求,熟悉下游加工过程的重要性和特点,了解下游加工技术的发展过程,掌握下游加工过程的主要步骤和主要单元操作,一、下游加工过程在生物技术中的地位,下游技术（工程）,（downstream processing）,：,对于由生物界自然产生的或由微生物菌体发酵的、动植物细胞组织培养的、酶反应等各种生物工业生产过程获得的生物原料，经提取分离、加工并精制目的成分，最终使其成为产品的技术。,下游加工过程的重要性。（组成、费用和关注程度）,组成：下游加工过程是生物技术的重要组成部分，发酵液或反应液需要经过下游加工过程才能成为成品；,费用：传统发酵工业中下游部分的费用占整个工厂投资费用的，而对重组生产蛋白质等基因工程产品，下游加工的费用可占整个生产费用的；,关注程度：英国政府工业部于年发起生物分离计划（），专门研究下游加工过程；年英国化学工业会召开了专门讨论下游加工过程的国际会议；我国也于年在济南召开了一次专门会议；近十年来国内外有关生物分离或蛋白质纯化的专著陆续出版。,二、生物技术下游加工过程的特点,含水多，产物含量低；,含菌体蛋白；,溶有原来培养基成分；,相当多的副产物和色素；,易被杂菌污染或使产物进一步分解；,易起泡，粘性物质多。,1.发酵液的特点,2.整个下游加工过程应遵循下列四个原则,时间短；,温度低；,pH适中（选择在生物物质的温度范围内）；,严格清洗消毒（包括厂房、设备及管路，注意死角），这和传统产品抗生素的生产是一致的。,对基因工程产品还应注意生物安全（biosafety）问题，要防止菌体扩散，一般要求在密封的环境下操作。,以20世纪40年代出现的青霉素产品为代表。,无菌空气制备技术、大型好氧发酵装置开发，一大批通风发酵技术产品相继投入了工业生产，如抗生素（链霉素）、氨基酸（谷氨酸）、有机酸（核酸、柠檬酸）、酶制剂（淀粉酶）、微生物多糖和单细胞蛋白等。产品多样性决定了分离方法的多样性。借鉴和引进吸收了大量的近代化学工业的分离技术，如,沉淀、离子交换、萃取、结晶,等。,3.第二代生物技术,以20世纪70年代末崛起的DNA重组技术及细胞融合技术为代表。,生物技术在其主要领域：基因工程、酶工程、细胞工程和微生物发酵工程取得了长足进步，一批高附加值的产品开始面世，如乙肝疫苗、干扰素等。80年代，发现了一大批生理功能性物质，如活性糖质、活性肽、高度不饱和脂肪酸等，生物技术在深度和广度上都取得了很大的进展。1988年，日本由40多家公司组建高度分离系统技术研究联合体，瑞典的Pharmacia，Alfa-Laval等组建了Biolink公司，加强在生物工业下游技术领域的研究开发力量，不断推出新技术、新产品、新装备，以抢占更多的市场。新技术有,超临界CO,2,萃取技术、膜过滤、渗透蒸发技术、各种色谱（层析）技术,等。,4.第三代生物技术,20世纪80年代以来，生物工业下游技术进步很快，出现了很多新概念、新技术、新产品和新装备。大致可分为以下几大类：,（1）固液分离技术,（2）细胞破碎技术,（3）初步分离纯化技术,（4）高度分离纯化技术,（5）其他新型分离技术,近20年来，将在污水处理、化学工程和选矿工程上广泛使用的絮凝技术引入到发酵液的预处理上，研究开发了菌体及悬浮物絮凝技术，改善了发酵液的分离性能，加之纤维素助滤剂的开发，大大提高了发酵液的固液分离效率。在固液分离机械方面，也出现了一些性能优良的新型机械，如带式过滤机、连续半连续板框过滤机、螺旋沉降式离心机等。微滤膜可高效分离细微的悬浮粒子。,（1）固液分离技术,（2）细胞破碎技术,（3）初步分离纯化技术,（4）高度分离纯化技术,（5）其他新型分离技术,已开发出球磨破碎、压力释放破碎、冷冻加压释放破碎和化学破碎等技术。该技术的成熟使得胞内生物物质的大规模工业化生产成为可能。,（1）固液分离技术,（2）细胞破碎技术,（3）初步分离纯化技术,（4）高度分离纯化技术,（5）其他新型分离技术,主要开发了沉淀、离子交换、萃取、超滤等技术。较早出现的是酶及蛋白质的盐析法；有机溶剂沉淀法；双水相萃取技术比较适合于胞内活性物质和细胞碎片的分离，为进一步纯化精制创造了前提；超滤技术解决了生物大分子对pH、热、有机溶剂、金属离子敏感等难题，在生物大分子的分级、浓缩、脱盐等操作中得到了广泛的使用。,（1）固液分离技术,（2）细胞破碎技术,（3）初步分离纯化技术,（4）高度分离纯化技术,（5）其他新型分离技术,小分子物质一般可通过离子交换、脱色和结晶、重结晶等方法获得纯度很高的产品。生物大分子的纯化一直是个难题。20世纪70年代以来，逐渐开发出各种色谱（层析）技术，如亲和色谱、疏水色谱、离子交换色谱和凝胶色谱等，后两种技术已开始用于批量生产。,（1）固液分离技术,（2）细胞破碎技术,（3）初步分离纯化技术,（4）高度分离纯化技术,（5）其他新型分离技术,超临界CO,2,萃取技术在获得天然生物物质方面有着独特的优势。20世纪80年代以来，已经在许多领域中迅速实现了工业化。如啤酒花中有效成分和咖啡豆中咖啡因的萃取分离。介于反渗透和超滤之间的纳米滤（Nanofiltration）技术，由于其能使水和大部分无机盐通过而截留分子量300-1000u的小分子有机物，且操作压力低，在生物工业和水处理中具有广阔的应用前景。渗透蒸发技术、液膜技术及反胶团技术的研究和应用开发等也相继取得了很大的进展。,四、生物技术下游加工过程的一般流程和单元操作,培养液（发酵液）的预处理和固液分离；,初步纯化（提取）；,高度纯化（精制）；,成品加工。,1.一般下游加工过程可分为4个阶段,2.下游加工过程的一般流程,（沉淀、吸附、萃取、超滤、结晶）,发酵液,初步纯化,细胞碎片分离,细胞破碎,细胞分离,高度纯化,成品加工,预处理,胞外产物,（加热、调pH、絮凝）,（过滤、离心分离、膜分离),（匀浆、研磨、酶解）,（离心分离、双水相萃取、膜分离）,（重结晶、离子交换、色谱分离、膜分离）,（浓缩、无菌过滤、干燥、成型）,胞外产物,提取,精制,产品的收得率和质量控制,。,下游工艺过程决定于产品的性质和要求达到的纯度,如产品为菌体本身，则工艺比较简单，只需经过滤、得到菌体，再经干燥就可，如单细胞蛋白的生产。,如可以从发酵液直接提取，则可省去固液分离步骤。,如为胞外产物则可省去细胞破碎步骤。,3.单元操作,过滤、离心固液分离；,蒸发、蒸馏、结晶进一步纯化；,萃取浓缩或提取液相中的成分；,离子交换、层析、膜技术、超滤；,干燥,适合于大规模工业化生产的传统技术经过改造提高后，适应面更宽，效率会更高，仍然显示出强劲的生命力。,各种新型高效的过滤机械和离心机械的问世，结晶理论和离子交换技术的新进展，提高了产品的收率、质量和生产效率。,五、生物工业下游技术的发展动态,成本,、,质量,、,环保,将是该技术发展方向和动力,1.传统分离技术的提高和完善,1）新型分离介质的研究开发,2）子代分离技术,3）其他新兴下游技术,2.新技术的研究开发,膜（膜材料和膜制造工艺）、树脂（离子交换树脂和大网格树脂）和凝胶（琼脂糖凝胶为基质，与各种配基结合后制成各种色谱分离介质）是目前主要的新型分离介质。,各种分离纯化技术相互结合、交叉、渗透，形成子代分离技术。如膜技术和萃取、蒸馏、蒸发技术相结合形成了膜萃取技术、膜蒸馏及渗透蒸发技术；色谱技术与离子交换技术等结合形成了离子交换色谱、等电聚焦色谱等。,由溶剂萃取技术衍生出一大批生物工业分离技术，如双水相萃取、超临界CO,2,萃取、反胶团萃取（细胞碎片去除、细胞胞内物质、酶及蛋白质、天然生物物质的提取分离）；菌体絮凝技术和菌体细胞破碎技术的进展为工业化经济地分离菌体细胞和大规模生产胞内物质创造了技术前提。,3.清洁生产,清洁生产是指将综合预防的环境保护策略持续应用于生产过程和产品中，以期减少对人类和环境的风险。,包括三方面内容：,（1）清洁生产工艺,（节约原材料和能源，淘汰有毒害的原材料，无废和少废技术）,（2）清洁产品,（使用中和使用后对人体和环境无害）,（3）清洁能源,（常规能源清洁利用、可再生能源和新能源的开发利用）,作业：,1.什么是生物工业下游技术？,2.试述生物工业下游技术的一般工艺过程。,3.什么是清洁生产？主要包括哪些内容？,第二章,下游技术的理论基础,生物工业下游技术：,尚无一个严格意义上的定义，本课程中所涉及的内容有许多在本质上属于物质分离的范畴。因此，本章及后续内容将会经常使用“分离”一词。,分离机理与分离操作,利用目标产物与杂质之间在,物理、化学、生物学性质,上的差异进行分离。,往往需利用多种分离机理，实施多步分离步骤。,第一节 下游技术中的物理学过程,一、基础物性,“分离”可利用各种物质固有性质的差异。物性差异越大，利用价值越大。,二、分类,以物理学过程为基础的分离操作，大致可分为以下三类：,1平衡分离过程,建立在相平衡关系上的。利用相的组成差别进行混合物体系的分离。表21为平衡分离的代表性单元操作。,2拟平衡分离操作,在混合物体系本身所占有的空间之外加一个能引起物质分离的势能场，在它的作用下，形成分离场。如表22所示。,3 非平衡分离操作,1、2以外均划归其中，利用物质移动速度差和广义的、基于“屏蔽效应”的分离操作。如表23所示。,第二节 下游技术中的化学过程,一、化学性分子识别,液液萃取：利用物质在溶剂中溶解度不同的分离。,如果在萃取溶剂中加入对原料中目标物质有特异性作用的成分(萃取剂、抽提剂)，能达到高选择性。,1分子间相互作用,分子间的相互作用力除了众所周知的范德华力、氢键力等，近年来备受注目的分子间作用力是疏水性相互作用力。,2 分子识别,酶和底物的专一性结合。钥匙和锁的关系。只有底物分子才能进入这个口袋。酶分子正是通过对底物的多点识别才显示出它高效、专一的底物识别功能。,环状糊精也有一定的分子识别功能。它是由68个葡萄糖环状结合而成的低聚糖筒状，内部具空洞结构。,“皇冠醚”,皇冠醚有多种，均为大环状化合物。中心开孔，一些金属离子和氨基酸分子等正好能进入其中。,泡沸石（无机吸附剂）,具有细孔结构的氧化铝、硅石类陶瓷，孔,径接近分子水平时，则可用做分子筛,对气体分子选择性吸附分离。,泡沸石,二、下游技术中的化学反应,选择性分离纯化：,如柠檬酸工业中常用钙盐沉淀，以便于与发酵液中残糖及其他可溶性杂质的分离。,利用草酸与Ca,2+,反应，生成不溶性钙盐可除去杂质Ca,2+,。,产品制造：,氨基酸或短肽能络合或螯合某些金属离子生产保健产品。补充人体缺乏又不易被人体吸收的钙、铁、锌等微量元素。,山梨醇和木糖醇可以通过葡萄糖和木糖经金属镍催化加氢工艺(高压)获得。,第三节 下游技术中的生物学过程,一、特异性相互作用(锁钥关系）,（一）可逆性结合作用（除共价结合外）,1离子间的相互作用（静电作用）,2氢键结合,3疏水性相互作用,4对金属原子配位,5弱共价键结合,影响蛋白质立体构象的环境因素,(1),热：,热是影响蛋白质构象的最普通的因素。,(2),温度：,温度的上升，使原子、分子的热运动更活泼，离子间的相互作用、氢键、金属原子配位作用等变弱。但疏水性的相互作用因温度上升而加强。,(3),pH：,pH对离子间的作用影响很大，pH也对蛋白质侧链上的氨基酸残基的离解度影响很大。,(4),静电性的环境变化：,如在溶液中加入在水中能离解为阳离子和阴离子的强电解质(如食盐等无机盐)。溶液离子强度增加，离子间相互作用变弱，氢键也受到同样影响。,(5),试剂：,在试剂中，尿素、盐酸胍、十二烷基磺酸钠等会对蛋白质构象造成影响。尿素或盐酸胍有增加水的介电常数和离子强度的作用，从而影响氢键作用。,二、亲和色谱,利用某些生物物质之间特异的亲和力进行选择性,分离的色谱技术,。,第三章,发酵液预处理,目的,不仅在于分离细胞、菌体和其它悬浮颗粒（细胞碎片、核酸和蛋白质的沉淀物），,还希望除去部分可溶性杂质和改变滤液的性质，以利于后继各步操作。,采用絮凝或凝聚的方法，设法增大悬浮液中固体粒子的大小，提高其沉降速度；,或采用稀释、加热等方法降低黏度，以利于过滤。,第一节 发酵液的预处理,一、发酵液过滤特性的改变,微生物发酵液的特性为：,发酵产物浓度较低，大多为1-10%，悬浮液中大部分是水；,悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大；,液相粘度大，大多为非牛顿型流体；,性质不稳定，随时间变化，如易受空气氧化、微生物污染、蛋白酶水解等作用的影响。,微生物发酵液的成分极为复杂，其中除了所培养的微生物菌体及残存的固体培养基外，还有未被微生物完全利用的糖类、无机盐、蛋白质，以及微生物的各种代谢产物。,改善发酵液过滤特性的物理化学方法：,调酸（等电点）、热处理、电解质处理、添加凝聚剂、添加表面活性物质、添加反应剂、冷冻-解冻及添加助滤剂等。,1.降低液体粘度,2.调整pH,3.凝聚与絮凝,根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速率与液体的粘度成反比，降低液体粘度（加水稀释法和加热法等）可有效提高过滤速率。注意加热温度与时间，不影响产物活性和细胞的完整性。,pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质，适当调节pH值可改善其过滤特性。氨基酸、蛋白质等电点的调节；在膜过滤中，发酵液中的大分子物质易与膜发生吸附，通过调整pH值改变易吸附分子的电荷性质，即可减少堵塞和污染；细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在某个pH值下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒，有利于过滤的进行。,采用凝聚和絮凝技术能有效改变细胞、细胞碎片及溶解大分子物质的分散状态，使其聚结成较大的颗粒，便于提高过滤速率。另外，还能有效地除去杂蛋白和固体杂质，提高滤液质量。,凝聚,指在电解质作用下，由于胶粒之间双电层电排斥作用降低，电位下降，而使胶体体系不稳定的现象；,絮凝,指在某些高分子絮凝剂存在下，基于桥架作用，使胶粒形成较大絮凝团的过程。,阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为：,Al,3+,Fe,3+,H,+,Ca,2+,Mg,2+,K,+,Na,+,Li,+,常用的凝聚剂电解质有：,硫酸铝,Al,2,(SO,4,),3,18H,2,O（明矾）；,氯化铝,AlCl,3,6H,2,O;,三氯化铁,FeCl,3,;,硫酸亚铁,FeSO,4,7H,2,O；,石灰；,ZnSO,4,；MgCO,3,（1）凝聚,发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子双电层的结构使胶粒之间不易聚集而保持稳定的分散状态。,采用絮凝法可形成粗大的絮凝体，使发酵液较易分离。,絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物,，其相对分子质量可高达数万至一千万以上，长链状结构，其链节上含有许多活性官能团，包括带电荷的阴离子（如-COOH）或阳离子（如-NH,2,）基团以及不带电荷的非离子型基团。,它们通过静电引力、范德华引力或氢键的作用，强烈地吸附在胶粒的表面。,当一个高分子聚合物的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生桥架联结时，就形成了较大的絮团，这就是絮凝作用。,（2）絮凝,高分子絮凝剂的吸附和絮凝作用示意图,1）有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物；,2）无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等；,3）天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。,目前最常见的高分子聚合物絮凝剂,有机合成的聚丙烯酰胺（polyacrylamide）类衍生物,根据活性基团在水中解离情况不同，可分为三类：,非离子型、,阴离子型（含有羧基）,阳离子型（含有胺基）,工业上使用的絮凝剂可分为三类：,聚丙烯酰胺絮凝剂,聚丙烯酰胺类絮凝剂的,优点,用量少，一般以mg/L计量；,絮凝体粗大，分离效果好；,絮凝速度快；,种类多，适用范围广。,聚丙烯酰胺类絮凝剂的,缺点,存在一定的毒性，特别是阳离子型聚丙烯酰胺，用于食品和医药工业时应谨慎。,聚丙烯酰胺类絮凝剂的,应用,医药和食品工业：,聚丙烯酸类阴离子絮凝剂（无毒），聚苯乙烯类衍生物，无机高分子聚合物絮凝剂（聚合铝盐、聚合铁盐等），天然有机高分子絮凝剂（多聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等）。,影响絮凝的因素,絮凝剂的加量(图3-1）,絮凝剂的分子量,溶液的pH,搅拌速度,搅拌时间,对于带负电荷的菌体或蛋白质来说，采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双重机理；,对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂，要采用凝聚和絮凝双重机理才能提高过滤效果，这种包括凝聚和絮凝机理的过程，称为混凝。,（3）混凝,4.加入助滤剂,5.加入反应剂,一种不可压缩的多孔微粒，它能使滤饼疏松，滤速增大。悬浮液中大量的细微胶体粒子被吸附到助滤剂的表面上，改变了滤饼结构，降低了过滤阻力。,常用的助滤剂有：硅藻土、纤维素、石棉粉、白土、炭粒、淀粉等，最常用的是硅藻土。,使用硅藻土时，通常细粒用量为500 g/m,3,；中等粒度用量为700 g/m,3,；粗粒用量为700-1000 g/m,3,。,加入反应剂和某些可溶性盐类发生反应生成不溶性沉淀，如CaSO,4,，AlPO,4,等。生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝具有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，且能使胶状物和悬浮物凝固，改善过滤性能；,如发酵液中含有不溶性多糖物质，用酶将其转化为单糖，以提高过滤速率。如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过滤前加入0.025%的淀粉酶，搅拌30min后，再加2.5%硅藻土助滤剂，可提高过滤效率5倍。,发酵液中的杂质,高价无机离子（Ca,2+,、Mg,2+,、Fe,2+,）,杂蛋白,在采用离子交换提炼时，会影响树脂对生化物质的交换容量。,在采用离子交换和吸附法提取时会降低其交换容量和吸附能力，,在有机溶剂法或双水相萃取时，易产生乳化现象，使两相分离不清。,在常规过滤或膜过滤时，易使过滤介质堵塞或受污染，影响过滤效率。,因此，在预处理时，应尽量除去这些物质。,二、发酵液的相对纯化,（一）、高价无机离子的去除方法,Ca,2+,草酸、,草酸钠,，,形成草酸钙沉淀,（注意回收草酸）,；,Mg,2+,三聚磷酸钠，,形成三聚磷酸钠镁可溶性络合物；,Fe,2+,黄血盐，,普鲁士蓝沉淀,（二）杂蛋白的去除方法,蛋白质一般以胶体状态存在于发酵液中。,在酸性溶液中带正电荷；,在碱性溶液中带负电荷。,在某一pH下，净电荷为零，溶解度最小，称为等电点。,1.沉淀法,在酸性溶液中，蛋白质与一些阴离子,，如三氯乙酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸盐、过氯酸盐等形成沉淀；,在碱性溶液中，蛋白质与一些阳离子，,如Ag,+,、Cu,2+,、Zn,2+,、Fe,3+,和Pb,2+,等形成沉淀。,酸碱调节，使蛋白质与盐或离子形成沉淀。,2.变性法,加热,大幅度调节pH值,加酒精、丙酮等有机溶剂或表面活性剂等。,不足之处,加热法只适合于对热较稳定的目的产物；,极端pH值也会导致某些目的产物失活，且要消耗大量酸碱；,有机溶剂法通常只适用于所处理的液体数量较少的场合。,加入某些吸附剂或沉淀剂吸附杂蛋白质而除去。,在四环素类抗生素中，采用黄血盐和硫酸锌的协同作用生成亚铁氰化锌钾的胶状沉淀来吸附蛋白质；,在枯草杆菌发酵液中，加入氯化钙和磷酸氢二钠，两者生成庞大的凝胶，把蛋白质、菌体及其他不溶性粒子吸附并包裹在其中除去。,3.吸附法,第二节 固液分离工程及设备,重力沉降,浮选,旋液分离,过滤,离心,通气，产生气泡，使固体附着在气泡表面除去。,用于固液比重差小、直径530,m颗粒的分离，污水处理,悬浮液以较高速度沿切线方向进入,旋液分离器,，,轻相由分离器中央排出，,重相由分离器下部排出，,但不适合直径5,m颗粒去除（可用丝网分离器）。,工业上常用,霉菌和放线菌为丝状菌，体形较大，发酵液采用过滤方法；,细菌和酵母菌为单细胞，体形较小，其发酵液采用高速离心分离，如对发酵液进行预处理，也可用过滤进行固液分离。,一、固液分离的方法,优点：分离速度快，分离效率高、液相澄清度好；,缺点：设备投资高、能耗大。,离心机种类：碟片式离心机、管式离心机、倾析式离心机。,1.离心分离,在液相非均一系统中，利用离心力达到液液、液固、液液固分离的方法，统称为离心分离。,碟片式离心机,是传统离心机，为目前工业上应用最广泛的离心机。分离因数可达1000-20000，最大处理量达到300m,3,/h，常用于大规模的分离过程,。,适用范围,细菌、酵母菌、放线菌、细胞碎片,管式离心机,管式离心机是一种分离效率很高的离心分离设备，其转鼓细长，可在15000-50000的高转速下工作，分离因数可达10,4,-610,5,。它设备简单、操作稳定。,适用范围,细胞、细胞碎片、细胞器、病毒、蛋白质、核酸等。特别适合一般分离机难以分离的固形物含量10）的悬浮液的分离，在发酵工业中广泛用于霉菌、放线菌和酵母发酵液或细胞悬浮液的过滤分离。,缺点：,由于受真空度的限制，不适于菌体较小和粘度较大的细菌发酵液的过滤，且过滤所得固相的干度不如加压过滤。,（2）真空转鼓过滤机,硅藻土的使用方法：,作为过滤介质,预涂在支持介质上,加入到悬浮液中,按支撑单元分：,板框过滤机，叶片式过滤机等,（3）硅藻土过滤机,1）切向流过滤（Cross-Flow Filtration）又称错流过滤,交叉过滤和十字流过滤，是一种维持恒压下高速过滤的技术。其操作特点是使悬浮液在过滤介质表面作切向流动，利用流动的剪切作用将过滤介质表面的固体（滤饼）移走。,2）双水相萃取,向水相中加入溶于水的某些高分子化合物（如葡聚糖、聚乙二醇等）后，形成密度不同的两相，轻相中富含某种高分子化合物，重相中富含盐类或另一种高分子化合物，从而达到分离和提纯某种高分子化合物的目的。,3）吸附法,向细胞碎片悬浮液中加入某种固体吸附剂，或者用细胞碎片悬浮液通过装有吸附剂的固定床，即可达到除去细胞碎片的目的。主要的问题是很难选择合适的吸附剂，以保证目的产物不被吸附而损失。,3.其他固液分离方法,作业：,1.名词解释：絮凝；凝聚；混凝,2.发酵液中的高价无机离子和杂蛋白可以采用哪些方法去除？,3.试述生物工业中常用固液分离设备的原理、特点、及适用范围。,第四章,微生物细胞的破碎,知识点：,细胞壁的组成和结构，微生物细胞的破碎技术，破碎率的测定。,重点：,工业生产中常用的几种细胞破碎方法的原理，操作过程及常用设备，并能就实际生产情况予以合理的选择。,难点：,常用破碎方法的合理选用。,为了研究细胞的破碎，提高其破碎率，有必要了解各种微生物细胞壁的组成和结构（表1）：,一、细胞壁的组成和结构,细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构，网状结构越致密，破碎的难度越大，革兰氏阴性细菌网状结构不及革兰氏阳性细菌的坚固；,酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度；,由于霉菌细胞壁中含有几丁质或纤维素的纤维状结构，其强度比细菌和酵母菌的细胞壁有所提高。,不同种类的细胞结构差别很大，破碎的难易程度也不同，由难到易的大致排列顺序为：植物细胞真菌（如酵母菌）革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌动物细胞。,二、常用破碎方法,细胞破碎机理图,进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英砂、氧化铝等研磨剂（直径小于1mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎，释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。破碎中产生的热量一般采用夹套冷却的方式带走。,1.珠磨法（Bead mill）,原理：,高速珠磨机,实验室规模的细胞破碎设备有Mickle高速组织捣碎机、Braun匀浆器；,中试规模的细胞破碎可采用胶质磨处理；,在工业规模中，可采用高速珠磨机（瑞士WAB公司和德国西门子机械公司制造）。,珠磨法的破碎率一般控制在80%以下：降低能耗、减少大分子目的产物的失活、减少由于高破碎率产生的细胞小碎片不易分离而给后续操作带来的困难。,胶体磨,德国进口珠磨机,采用,高压匀浆器,（由高压泵和匀浆阀组成，英国APV公司和美国 Microfluidics公司均有产品出售）。,2.高压匀浆法（High-pressure homogenization）,大规模细胞破碎的常用方法,利用高压使细胞悬浮液通过针形阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破碎，细胞悬浮液自高压室针形阀喷出时，每秒速度高达几百米，高速喷出的浆液又射到静止的撞击环上，被迫改变方向从出口管流出。细胞在这一系列高速运动过程中经历了剪切、碰撞及由高压到常压的变化，从而造成细胞破碎。,原理：,高压匀浆器,大、中、小型高压匀浆器,在工业规模的细胞破碎中，对于酵母等难破碎的及高浓度的细胞，常采用多次循环的操作方法。,一般说来，酵母菌较细菌难破碎，处于静止状态的细胞较处于快速生长状态的细胞难破碎，在复合培养基上培养的细胞比在简单合成培养基上培养的细胞较难破碎。,易造成堵塞的团状或丝状真菌,较小的革兰氏阳性菌,含有包含体的基因工程菌（因包含体坚硬，易损伤匀浆阀）,不宜采用高压匀浆法的细胞类型：,破碎的动力学方程为：ln1（lR）KNP,其中 R破碎率；,K与温度有关的速度常数；,P一操作压力；,N一悬浮液通过匀浆器阀的次数。,与微生物种类有关的常数；,破碎酵母菌,值可取2.2。可见，影响破碎的主要因素是,压力、温度和通过匀浆器阀的次数。,利用发射15-25kHz的超声波探头处理细胞悬浮液。,一般认为超声波破碎的机理是：在超声波作用下液体发生空化作用，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。,3.超声破碎法（Ultrasonication）,一般杆菌比球菌易破碎，G-细菌比G+细菌易破碎，对酵母菌的效果较差，该法,在实验室小规模细胞破碎中常用,。,但超声波产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。,4.酶溶法（Enzymatic Lysis）,（1）外加酶法,常用的溶酶,溶菌酶,-1，3-葡聚糖酶,-1，6-葡聚糖酶,蛋白酶,甘露糖酶,糖苷酶,肽键内切酶,壳多糖酶等,溶菌酶主要用于细菌类,细胞壁溶解酶是几种酶的复合物,如：对酵母细胞采用酶法破碎时，先加入蛋白酶作用蛋白质-甘露聚糖结构，使二者溶解，再加入葡聚糖酶作用裸露的葡聚糖层，最后只剩下原生质体，这时若缓冲液的渗透压变化，则细胞膜破裂，释出胞内产物。,利用溶酶系统处理细胞时必须根据细胞壁的结构和化学组成选择适当的酶，并确定相应的次序,。,酶溶法的优点：,选择性释放产物，条件温和，核酸泄出量少，细胞外形完整。,缺点：溶酶价格高，溶酶法通用性差（不同菌种需选择不同的酶），产物抑制的存在。,如在溶酶系统中，甘露糖对蛋白酶有抑制作用，葡聚糖抑制葡聚糖酶。,诱发微生物产生过剩的溶胞酶或激发自身溶胞酶的活力，以达到细胞自溶的目的。,影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH值、激活剂和细胞代谢途径等。,缺点是：对不稳定的微生物，易引起所需蛋白质的变性，自溶后细胞悬浮液粘度增大，过滤速度下降。,（2）自溶法（Autolysis）,某些化学试剂，如有机溶剂、变性剂、表面活性剂、抗生素、金属螯合剂等，可以改变细胞壁或膜的通透性（渗透性），从而使胞内物质有选择地渗透出来。,4.化学渗透法（Chemical permeation）,该法取决于化学试剂的类型以及细胞壁膜的结构与组成。,如,Triton X-100是一种非离子型清洁剂,，对疏水性物质具有很强的亲和力，能结合并溶解磷脂，破坏内膜的磷脂双分子层，使某些胞内物质释放出来。,其他的表面活性剂，如,牛黄胆酸钠、十二烷基磺酸钠,等也可使细胞破碎。,（1）表面活性剂,可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。,处理G-细菌，对细胞外层膜有破坏作用。G-细菌的外层膜结构通常靠二价阳离子Ca,2+,或Mg,2+,结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca,2+,或Mg,2+,螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。,（2）EDTA螯合剂,能分解细胞壁中的类脂，使胞壁膜溶胀，细胞破裂，胞内物质被释放出来。,甲苯、苯、氯仿、二甲苯及高级醇等。,（3）有机溶剂,（4）变性剂,盐酸胍（Guanidine hydrochloride）和脲（Urea）是常用的变性剂。,变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。,*表示适用,通用性差；,时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过50%；,有些化学试剂有毒。,化学渗透法优点：,缺点：,对产物释放有一定的选择性，可使一些较小分子量的溶质如多肽和小分子的酶蛋白透过，而核酸等大分子量的物质仍滞留在胞内；,细胞外形完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。,将浓缩的菌体悬浮液冷却至-25形成冰晶体，利用500MPa以上的高压冲击，使冷冻细胞从高压阀小孔中挤出。细胞破碎是由于冰晶体的磨损，使包埋在冰中的微生物变形而引起的。,此法主要用于实验室，适应范围广、破碎率高、细胞碎片粉碎程度低及活性保留率高等优点，但不适应于对冷冻敏感的生化物质。,5.其他方法,1.X-press法,将细胞放在高渗透压的介质中（如一定浓度的甘油或蔗糖溶液），达平衡后，转入到渗透压低的缓冲液或纯水中，由于渗透压的突然变化，水迅速进入细胞内，引起细胞溶胀，甚至破裂。,仅适用于细胞壁较脆弱的细胞或细胞壁预先用酶处理或在培养过程中加入某些抑制剂（如抗生素等），使细胞壁有缺陷，强度减弱。,2.渗透压法（Osmotic pressure）,将细胞放在低温下突然冷冻而在室温下缓慢融化，反复多次而达到破壁作用。,由于冷冻，一方面使细胞膜的疏水键结构破裂，另一方面胞内水结晶，使细胞内外溶液浓度变化，引起细胞膨胀而破裂。,适用于细胞壁较脆弱的菌体，破碎率较低，需反复多次，此外，在冻融过程中可能引起某些蛋白质变性。,3.反复冻结-融化法,使细胞结合水分丧失，从而改变细胞的渗透性。当采用丙酮、丁醇或缓冲液等对干燥细胞进行处理时，胞内物质就容易被抽提出来。,气流干燥主要适用于酵母菌，一般在25-30的气流中吹干；,真空干燥多用于细菌。,4.干燥法,气流干燥,真空干燥,喷雾干燥,冷冻干燥,三、破碎率的测定与破碎技术的研究方向,细胞破碎后，大量带电荷的内含物被释放到水相，使导电率上升。导电率随着破碎率的增加而呈线性增加,。,1.破碎率的测定,直接测定法,目的产物测定法,导电率测定法,采用染色的方法把破碎的细胞与未破碎的细胞区别开来。,如破碎的革兰氏阳性菌可染成革兰氏阴性菌的颜色；,采用革兰氏染色法染色酵母破碎液，完整的细胞呈紫色，而受损害的细胞呈亮红色。,将破碎后的细胞悬浮液离心分离细胞碎片，测定上清液中目的产物（如蛋白质或酶）的含量或活性，并与100%破碎率所获得的标准数值比较，计算其破碎率。,细胞破碎与固液分离紧密相关。,2.破碎技术的研究方向,多种破碎方法相结合,与上游过程相结合,与下游工程相结合,化学法、酶法、机械法相结合。,如用溶解酶预处理面包酵母，然后高压匀浆，95MPa压力下匀浆4次，总破碎率接近100%。而单独采用高压匀浆法，同样条件下破碎率只有32%。,在发酵培养过程中，培养基、生长期、操作参数（如pH、温度、通气量、搅拌转速、稀释率等）等因素都对细胞壁膜的结构与组成有一定的影响。细胞的破碎与上游培养过程有关。,用基因工程的方法对菌种进行改造，以提高胞内物质的提取率也是非常重要的。,在生长后期，加入某些能抑制或阻止细胞壁物质合成的抑制剂（如青霉素、环丝氨酸等），继续培养一段时间后，新分裂的细胞其细胞壁有缺陷，利于破碎；,选择较易破碎的菌种作为寄主细胞，如革兰氏阴性细菌；,在细胞内引进噬菌体基因，培养结束后，控制一定条件（如温度等），激活噬菌体基因，使细胞自内向外溶解，释放出内含物。,作业:,1.常用细胞破碎方法(珠磨法、高压匀浆法、超声破碎法、酶溶法、化学渗透法)的原理、特点及适用性。,2.举例说明采用多种破碎方法相结合提高破碎率的机理。,第五章,溶剂萃取和浸取,萃取：,利用物质在互不相溶的两相之间溶解度的不同而使物质得到纯化或浓缩的方法。,反萃取：,调节水相条件，将目标产物从萃取相转入水相的萃取操作。,物理萃取：,根据相似相溶的原理，溶质在两相间达到分配平衡，萃取剂与溶质之间不发生化学反应的萃取过程。,化学萃取:,利用萃取剂与溶质之间的化学反应生成脂溶性复合分子实现溶质向有机相的分配。,有机溶剂萃取法广泛应用于抗生素、有机酸、维生素、激素等发酵产物工业规模的提取上。,利用一种溶质组分（如产物）在两个互不混溶的液相（如水相和有机溶剂相）中竞争性溶解和分配性质上的差异来进行分离操作的。,有机溶剂,萃取,比化学沉淀法分离程度高；,比离子交换法选择性好、传质快；,比蒸馏法能耗低；,生产能力大、周期短、便于连续操作、易实现自动化控制。,优点,溶剂萃取法和其他新型分离技术相结合，产生了一系列新型分离技术：,超临界流体萃取（Supercritical fluid extraction）,反胶团萃取（Reversed micelle extraction）,双水相萃取技术（Partition of two aqueous phase system）等。,用于高品质的天然物质、胞内物质（胞内酶、蛋白质、多肽、核酸等）的分离提取上。,用某种溶剂把有用物质从固体原料中提取到溶液中的过程称为,浸取或浸出,。,用温水从甜菜中提取糖，,用有机溶剂从大豆、花生等油料作物中提取食用油，,用水或有机溶剂从植物中提取药物、香料或色素等。,几种萃取方法的比较,第一节 溶剂萃取,一、溶剂萃取过程的理论基础,1物质的溶解和相似相溶原理,从热力学角度考虑，一个过程要能自动进行，体系的自由能应下降，自由能的变化包括焓变化和熵变化两部分：,为了简单起见，忽略熵的变化，并忽略压力和体积变化(一般溶解过程压力和体积的变化很小)，这样只要考虑体系能量的变化即可。,溶解过程的三个能量变化过程,(1),溶质B各质点的分离,；原先是固态或液态的溶质B，先分离成分子或离子等单个质点。此过程需要吸收能量，这种能量的大小通常与分子之间的作用力有关，一般顺序为：,非极性物质极性物质氢键物质离子型物质,(2),溶剂A在溶质B的作用下形成可容纳B质点的空位,；此过程也需要吸收能量，其大小与溶剂分子A之间的相互作用力有关，一般顺序与上述相同：,非极性物质极性物质氢键物质,该能量还与溶质分子B的大小有关。,(3),溶质质点B进入溶剂A形成的空位,；此过程放出能量，放出能量的大小有以下规律：,A、B均为非极性分子一非极性分子、另一极性分子 均为极性分子B被A溶剂化,（1）两种惰性溶剂互溶,（2）水向油中溶解,（3）油向水中溶解,（4）水和乙醇的溶解,从能量角度分析几种溶解过程：,“相似相溶”原理,分子之间可以有两方面的相似：一是,分子结构相似,，如分子的组成、官能团、形态结构的相似；二是,能量(相互作用力)相似,，如相互作用力有极性的和非极性的之分，两种物质如相互作用力相近，则能互相溶解。与水“相似”的物质易溶于水，与油“相似”的物质易溶于油就是相似相溶原理的表现。,2溶剂的互溶性规律,物质分子之间的作用力与物质种类有关，包括较强的氢键力和较弱的范德华力。氢键力与化合键能相比较弱，但比范德华力要强得多。按照生成氢键的能力，可将溶剂分成四种类型。,(1)N型溶剂,不能形成氢键，如烷烃、四氯化碳、苯等,称惰性溶剂。,(2)A型溶剂,只有电子受体的溶剂，如氯仿、二氯甲烷等，能与电子供体形成氢键。,(3)B型溶剂,只有电子供体的溶剂，如酮、醛、醚、酯等，萃取溶剂中的TBP(磷酸三丁酯)、