生物：1.2基因工程的基本操作程序(使用).ppt

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限制酶,目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。,科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。,起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。,然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子,(,抗虫基因首端,),，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子,(,抗虫基因末端,),，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。,资 料,:,基因表达载体的组成：,a,、目的基因,b,、启动子,c,、终止子,d,、标记基因等,位于基因,首端,，,RNA,聚合酶识别和结合,部位,，,驱动基因转录,出,mRNA,位于基因,尾端,，使,转录,在需要的地方,停止,鉴别筛选,受体细胞,是否含目的基因,(,三,),将目的基因导入受体细胞,常用的受体细胞：,动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。,将目的基因导入受体细胞的原理：,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,目的,目的基因只有进入,_,内，并且在受体细胞内维持,_,和,_,的过程，才能实现一种生物在另一种生物中的,转化,受体细胞,稳定,表达,方法,导入植物细胞,导入动物细胞,导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞吸收,DNA,分子,(,三,),将目的基因导入受体细胞,最多,采用,经济有效,单子叶,常用,成本高,简便经济,受精卵,大肠杆菌应用最广泛,用,Ca,2+,处理,(,四,),目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,分子,检测,检测转基因生物染色体的,DNA,上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了,mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA,分子杂交,DNA,分子杂交,抗原,-,抗体杂交,还可以进行,个体水平的鉴定,PCR,技术,聚合酶链式反应,原理：,前提：,条件：,PCR,扩增仪,DNA,双链复制的基本原理,一段已知目的基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,一对引物,热稳定,DNA,聚合酶,(,Taq,酶,）,DNA,的两条链为模板,温度控制,5,/,3,/,G,G,T,C,3,/,5,/,G,A,C,C,5,/,3,/,引物,G,G,高温变性,低温复性,适温延伸,1.,目的基因,DNA,受热变性，解链；,2.,引物与单链互补结合；,3.,合成链在,Taq,酶作用下进行延伸。,5,/,3,/,A,G,引物,PCR,技术扩增过程,a,、,DNA,变性（,90-95,）：双链,DNA,模板,在热作用下，,断裂，形成,_,b,、,复性（,55-60,）：系统温度降低，引物,与,DNA,模板结合，形成局部,_,。,c,、延伸（,70-75,）：在,Taq,酶的作用下，从,引物的,5,端,3,端延伸，合成与模板互补,的,_,。,氢键,单链,DNA,双链,DNA,链,目的基因的,mRNA,单链,DNA,(cDNA,）,双链,DNA,(,即目的基因,),反转录,合成,1,）反转录法：,以目的基因转录成的信使,RNA,为模板，反转录成互补的单链,DNA,，然后在酶的作用下合成双链,DNA,，从而获得所需的基因。,蛋白质的氨基酸序列,mRNA,的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,目的基因,推测,推测,化学合成,2,）根据已知的氨基酸序列合成,DNA,法：,2.,微生物作受体细胞原因：,将目的基因导入微生物细胞,3.,转化方法：,大肠杆菌,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,处理细胞,细胞表达载体与感受态细胞混合,_,细胞吸收,DNA,分子。,Ca2+,感受态,感受态,1.,常用菌：,目的基因插入,Ti,质粒的,T-DNA,上 农杆菌,植物细胞 插入到植物细胞的染色体,DNA,上 目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达,农杆菌特点：,易感染双子叶植物和裸子植物。,转化,如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因或目的基因已经转录或翻译。,用口径为,1m,的,DNA,注射器，,将大量的目的基因片段注入到,受精卵的核,内，然后把经过注射的受精卵,移植,到另一只雌性动物的,子宫,内，使,受精卵发育,为转基因动物,。,什么叫显微注射技术？,返回,1.,下表关于基因工程中有关基因操作,的名词及对应的内容，正确的组合是,2,、下列属于获取目的基因的方法的是,(),利用,mRNA,反转录形成从基因组文库中提取,从受体细胞中提取 利用,PCR,技术,利用,DNA,转录 人工合成,A.B.C.D.,3.,细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是,A,提高受体细胞在自然环境中的耐药性,B,有利于对目的基因是否导入进行检测,C,增加质粒分子的分子量,D,便于与外源基因连接,4.,有关基因工程的叙述正确的是,A,限制酶只在获得目的基因时才用,B,重组质粒的形成是在细胞内完成的,C,质粒都可作为运载体,D,蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,5.,哪项不是基因表达载体的组成部分,(),A.,启动子,B.,终止密码,C.,标记基因,D.,目的基因,6.,下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法,(),A,基因枪法,B,显微注射法,C.,农杆菌转化法,D,花粉管通道法,归纳,:,基因工程的基本操作程序,获取目的基因,从基因文库,利用,PCR,技术,人工合成,构建基因表达载体,目的基因、启动子、终止子、标记基因,将目的基因导入受体细胞,农杆菌转化法、显微注射法、基因枪法,目的基因的检测与鉴定,检测：是否插入、转录、翻译。个体水平的鉴定,2,、非编码区：,调控遗传信息表达,的核苷酸序列,(,启动子、,终止子），不编码蛋白质。,1,、编码区：能转录相应的信使,RNA,，能编码蛋白质的序列。,基因的结构（补充知识）,非编码区,非编码区,编码区,与,RNA,聚合酶结合位点,启动子,终止子,RNA,聚合酶能够识别调控序列中的结合位点，并与其结合。,转录开始后，,RNA,聚合酶沿,DNA,分子移动，并以,DNA,分子的一条链为模板合成,RNA,。,转录完毕后，,RNA,链释放出来，紧接着,RNA,聚合酶也从,DNA,模板链上脱落下来。,一、原核细胞的基因结构,二、真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,内含子,外显子,启动子,终止子,基因的结构（补充知识）,与,RNA,聚合酶结合位点,1,、编码区,2,、非编码区：,调控遗传信息表达,的核苷酸序列,(,启动子、,终止子），不编码蛋白质。,外显子：能编码蛋白质的序列,内含子：不能编码蛋白质的序列,原核细胞,真核细胞,不同点,相同点,原核细胞,真核细胞,不同点,编码区是,连续的,编码区是间隔的、不连续的,相同点,都由能够编码蛋白质的编码区和具有调控作用的非编码区组成的,原核细胞与真核细胞的基因结构比较：,答案和提示,1.,作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,答：,不可以,。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要,有其他控制元件，如,启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是：,（,1,）生物之间进行,基因交流,，只有,使用受体生物自身基因的启动子,才能比较有利于基因的表达；,（,2,）通过,cDNA,文库获得的,目的基因,没有启动子,，只将编码序列导入受体生物中,无法转录；,（,3,）,目的基因是否导入,受体生物中,需,要有,筛选标记,；,（,4,）为了,增强,目的基因的表达,水平,，往往还要增,加,一些其他,调控元件,，如增强子等；,（,5,）有时需要,确定,目的基因表达的,产物存在于,细胞的什么部位，往往,要加上可以标识存在部位的基因,（或做成目的基因与标识基因的融合基因）如绿色荧光蛋白基因等。,2.,根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？若想将一个抗病基因导入单子叶植物，如小麦，从理论上说，你应该如何做？,农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，在植物基因工程中以根瘤农杆菌的,Ti,质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆菌广泛存在于双子叶植物中。据不完全统计，约有,93,属,643,种双子叶植物对根瘤农杆菌敏感。裸子植物对该菌也敏感。当这些植物被该菌侵染后会诱发肿瘤。近年来，也有报道该菌对单子叶植物也有侵染能力。,根瘤农杆菌侵染植物是一个非常复杂的过程。根瘤农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中。,研究证明，主要酚类诱导物为乙酰丁香酮和羧基乙酰丁香酮，这些物质主要在双子叶植物细胞壁中合成，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不易被根瘤农杆菌侵染的原因。近年来还发现一些中性糖，如,L-,阿拉伯糖、,D-,木糖等也有诱导作用。酚类物质和糖类物质既可以作为根瘤农杆菌的趋化物，又可以作为农杆菌中,Ti,质粒上,Vir,区（毒性区）基因的诱导物，使,Vir,区基因活化，导致,T-DNA,的加工和转移，从而侵染植物细胞。,需要注意的是农杆菌中不同的菌株，侵染能力有差别，在基因工程中需要加以选择使用。利用农杆菌侵染单子叶植物进行遗传转化时，是需要加上述酚类物质的，同时单子叶植物种类不同，农杆菌侵染进行遗传转化的效果也有很大差异,如果想将一个抗病毒基因转入小麦，也可以用农杆菌，但要注意两点：要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的,Vir,区（诱导）的基因，使,T-DNA,转移并插入到染色体,DNA,上。,3.,利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在,内质网和高尔基,复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，,大肠杆菌不存在这两种细胞器,，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是,不可能的。,4.-,珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的,-,珠蛋白，想一想，应如何进行设计？,（,1,）从小鼠中,克隆出,-,珠蛋白基因的编码序列,（,cDNA,）。,（,2,）将,cDNA,前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，,构建成一个表达载体,。,（,3,）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体,未进入,大肠杆菌中，大肠杆菌会,因不含有抗四环素基因而死掉,；如果培养基上,长出大肠杆菌菌落,，则表明,-,珠蛋白基因,已进入其中,。,（,4,）培养进入了,-,珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取,-,珠蛋白。,你能推测出由,mRNA,反转录形成,cDNA,的过程大致分为哪些步骤吗？,提示：,1970,年，特明（,H.M.Temin,）和巴尔的摩（,D.Baltimore,）证实了,RNA,病毒中含有一种能将,RNA,转录成,DNA,的酶，这种酶被称为依赖,RNA,的,DNA,聚合酶，由于与中心法则中的从,DNA,到,RNA,的转录是反向的，所以称为反转录酶（,reverse transcriptase,）。,反转录酶既可以利用,DNA,又可以利用,RNA,作为模板合成与之互补的,DNA,链。像其他,DNA,聚合酶一样，反转录酶也以,53,方向合成,DNA,（图,1-3,）。,图,1-3,由,mRNA,反转录形成,cDNA,的过程,cDNA,合成过程是：,第一步，,反转录酶,以,RNA,为模板合成一条与,RNA,互补的,DNA,单链，形成,RNA-DNA,杂交分子。,第二步，,核酸酶,H,使,RNA-DNA,杂交分子中的,RNA,链降解，使之变成单链的,DNA,。,第三步，以单链,DNA,为模板，在,DNA,聚合酶,的作用下合成另一条互补的,DNA,链，形成双链,DNA,分子。,1.,为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物体内提取不行吗？,构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是惟一的方式。,如果,所需要的目的基因,序列已知,，,就,可以通过,PCR,方式从含有该基因的生物的,DNA,中，,直接获得,，也可以通过反转录，用,PCR,方式从,mRNA,中获得，,不一定要构建基因文库。,但如果,所需要的目的基因的,序列完全不知,，,或只知道,目的基因,序列的一段,，或想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。,2.,将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？,有人采用总,DNA,注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总,DNA,提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，,这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物,。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。,