生物技术制药课程总结094.pptx

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2012/10/23,#,第一章 绪论,是指利用生物体或生物过程生产药物的技术。主要阐述生物药物，特别是生物工程相关药物的研制原理，生产工艺，分离纯化，制剂和生物药品分析技术的应用科学。,行业特点,1,、高技术,2,、高投入,3,、高风险,4,、长周期,5,、高收益,制药工程研究内容与对象,制药工艺：从发现,药物上市,GLP-,药物非临床研究质量管理规范,GCP-,药物临床试验质量管理规范,GMP-,药物生产质量管理规范,新药研究中的两个重要原理,前药原理,:,前药是指对现有药物显效基因进行封闭体外无活性的衍生物，在体内经酶或非酶作用原药，从而产生生物活性，则称这种结构修饰后的化合物为原药的前药。,利用这一原理进行新药设计的方法称为“前药原理”。,生物电子等排体原理：广义指具有相同数目外层电子的不同分子或原子团药物生产过程共性规律及其应用,管理规范,严格按照三个管理规范而进行：,GLP GCP GMP,药品经营质量管理规范：,GSP,中药材生产质量管理规范：,GAP,研究对象,药品成产过程共性规律及其应用包括：,制备原理,+,工艺路线,+,质量控量,安全，有效，均匀，可控的保证,一、生物药物的来源,1,、生物药物的定义：指运用生物学、医学、生物化学等成果，从生物体，生物组织、细胞，体液等，综合利用物理学、化学、生物化学、生物技术，药学等学科的原理和方法制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品。,2,、蛋白质类药物的分离纯化方法,沉淀法：原理是使蛋白质胶体颗粒的表面水花膜或表面电荷破坏，从而使蛋白质沉淀。常用：盐析法，有机溶剂沉淀法，等电点沉淀法，靶向药物结合沉淀法（抗体,-,抗原）等,按分子大小分离方法：超滤法，透析法（膜分离法），凝胶过滤法，超速离心法等,按分子所带电荷进行分离的方法：氨基酸、多肽、蛋白质、酶均匀为两性物质，具有等电点，包括离子交换层析法、电泳法、等电聚焦等,亲和层析法：大部分生物活性物质都有其作用的靶向物质。如酶和底物、抗原和抗体、激素与液体等，它们之间有特殊的亲和作用，利用该性质进行的特异层析分离技术称亲和层析法,第三,章 抗体制药,1 药物生产过程共性规律及其应用包括,制备原理+工艺路线+质量控制,重要性：安全 有效 均匀 可控,生物制药,是指运用生物学、医学、生物化学等研究成果，从生物体、生物组织、细胞体液等综合利用物理学、化学、生物化学、生物技术、药学等学科的原理和方法制造的一类用于防治、治疗和诊断的制品。,蛋白质类药物分离纯化方法,（1）沉淀法,原理：是蛋白质胶体颗粒的表面水化膜或表面电荷破坏，从而使蛋白质沉淀。,常用盐析法、有机溶剂沉淀法、等电点沉淀法、靶物质结合沉淀法（抗原-抗体）等。,（2）按分子大小分离方法,超滤法、透析法、凝胶过滤法、超速离心法。,（3）按照分子所带电荷进行分离的方法,氨基酸、多肽、蛋白质、酶均为两性电解质，具有等电点。在远离等电点pH时，便带正/负电荷。包括离子交换层析法、电泳法、等电聚焦等。,（4）亲和层析法,大部分生物活性物质都有其作用的靶物质如酶与底物、抗原和抗体、激素与受体，它们之间特异的亲和作用。,第四,章 抗体,制药,抗体是能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白,。,它是机体免疫系统受到抗原物质刺激后，,B,淋巴细胞被活化、增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的,球蛋白,。,人工制备抗体是大量获得抗体尤其是治疗性抗体的有效途径,人工抗体的主要类型,多克隆抗体,单克隆抗体,基因工程抗体,多克隆抗体,由于病原微生物是具有多种抗原决定簇的抗原物质，因此这些抗体制剂也是多种抗体的混合物，称为,多克隆抗体,，即针对多种抗原决定簇的抗体,单克隆抗体,单克隆抗体,是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。这种抗体是针对一个抗原决定簇的抗体，又是由单一的,B,淋巴细胞克隆产生的，,故,称为单克隆抗体。,基因工程抗体,采用基因工程方法，在基因水平对免疫球蛋白基因进行切割，拼接或修饰后导入受体细胞进行表达产生新型抗体。,单克隆抗体的制备,免疫分为体内免疫和体外免疫。体内免疫用于抗原多，免疫性强的颗粒性抗原；体外免疫用于抗原少，免疫性弱。,PEG,常用作细胞融合剂，常用分子量,4000,，浓度,50%,。,常用,HAT,培养基来筛选杂交瘤细胞。,第五,章 动物细胞培养制药工艺,动物细胞培养代谢特征,葡萄糖和谷氨酰胺：能量和合成代谢的前体。,葡萄糖限制：通过增加谷氨酸消耗得以补偿，反之亦然。,葡萄糖代谢：谈交接为主，生成丙氨酸和乳酸，乳酸分泌到胞外并在培养液中积累。另一条为TCA循环，彻底氧化产生二氧化碳和水。一小部分为戊糖磷酸途径，生成4、5、7碳糖和NADPH。,中间产物进入脂肪酸代谢。葡萄糖代谢旺盛，产生大量乳酸，对细胞有毒性。,动物细胞的生理特点,细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象,寿命有限,对周围环境敏感,对培养及要求高,动物细胞蛋白的合成途径和修饰功能与细菌不同,用于动物细胞制药的细胞,原代细胞,传代细胞,有限细胞系,无限细胞系,工程细胞系,转化细胞系,原代细胞培养,原,代细胞（primary culture cell）是指从机体取出后立即培养的细胞。有人把培养的第1代细胞与传10代以内的细胞统称为原代细胞培养。动物组织经胰蛋白酶等消化、分散，获得单个细胞，再生长于培养皿中。大多数组织可以制备原代细胞，但生长的快慢及难易程度不一。肾和睾丸最常用，甲状腺细胞生长较慢，只用于某些特定的病毒如猪传染性肠胃炎病毒的培养。,传代细胞培养,传代培养中的细胞传代培养（,subculture,），当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代（,passage,）或者再培养（,subculture,）。对单层培养而言，,80%,汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。,有限细胞系,概念：生长和寿命有限的细胞系，二倍体。,特点：多次传代培养失去增值能力，老化死亡。,寿命:取决于细胞来源的物种年龄，器官。,人细胞最高培养次数5060代；鸡胚30代；小鼠；8代。,无限细胞系,生长和寿命不受限制的细胞系，能够连续船代培养。,特点：细胞无限分裂，不具有接触拟制现象不出现一样染色体。,工程细胞系,工程细胞系是指采用基因工程技术或细胞融合技术对宿主细胞的遗传物质进行修饰改造或重组，获得具有稳定遗传的独特性状的细胞系,转化细胞系,通过某个转化过程形成的，常由于染色体断裂变成异倍体，失去正常细胞特点，而获得无限增殖能力。转化细胞系具有长期培养，倍增时间短，对培养条件和生长因子等要求较低的特点，适于大规模工业化生产。在生物制药中，可通过改造宿主细胞特性，如延长细胞周期提高工程细胞原始表达水平等来提高药物的产,动物细胞培养的应用,做为反应器用于制药：EPO，tPA,作为素质细胞用于制药：病毒性疫苗,杂交瘤细胞:单克隆抗体，诊断、治疗,组织再生与器官移植（个体克隆）,本身作为产品：皮肤移植，干细胞治疗,药学研究应用：分子与细胞药理、毒理、代谢,生命科学的研究：器官发生，细胞、分子、遗传学,对培养基的要求,温度,哺乳动物细胞最佳培养温度：37,鸡细胞为：3940,昆虫类细胞为:2528,耐受温度较窄：3537,细胞受伤：3940。一小时但能修复,受伤严重：4142。部分可恢复。,死亡：43以上。,pH,低于6.8或高于7.6会对细胞产生致命影响,机体细胞pH范围为68，而且在体液和血液中变化范围很小。,人体血液pH比较稳定，7.367.44.,低于7.05发生酸中毒，高,7.45碱中毒.,渗透压,正常血浆渗透压为,高渗溶液,低渗溶液,动物细胞对渗透压有一定的耐受性。,立体细胞的渗透压应控制为等渗溶液。,增减Nacl的浓度调节渗透压。每增加1mg/ml渗透压增加32mOsm,动物细胞对培养基的要求,完全培养基，容易利用、相对低分子量的营养物。,12中必需氨基酸,八种以上维生素,多种无机盐和微量元素,多种附加成分:生长类、细胞因子和贴壁因子及激素、结合蛋白质。,能源：单糖、葡萄糖、谷氨酰胺。,氮源:氨基酸单体化合物。,糖类,不能利用：多糖、双糖、寡糖等聚合物。,利用：单糖单体化合物。,主要是葡萄糖,氨基酸,不能利用：多肽、蛋白质等高分子聚合物。,利用：氨基酸等单体化合物。,十二种必需氨基酸：Arg、Cry、His、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Thr、Trp、Tyr、Val。,必须在培养基中添加，才能满足细胞的生长。,谷氨酰胺：重要碳源和能源。,维生素,作用：一类微小的小分子有机物既不是细胞物质的基础，也不是能源的物质，对代谢和生长其调控和控制作用，一般是酶的辅酶或辅酶的成分。,水溶性维生素：B族维生素和维生素C。,脂溶性维生素：维生素A、D、E、K四种。,无机盐类,作用：细胞代谢所需酶的辅基，调节酶的活性，细胞的构成成分;,参与生理电活动；,维持水平衡、保持渗透压和酸碱平衡。,胞外无机盐对维持正常生长环境很重要。,水,必须使用纯净水配制培养基。,水放置时间不能超过两周。,普通水必须除去各类元素有毒物质。,微生物和热源，都达到纯净水标准。,生长因子和激素,作用：对细胞的生长有刺激作用。,贴附因子：细胞贴壁生长所必需。,脂类化合物：必须的类脂及其前提和血清常平衡使用。,铁传递蛋白：离子载体。,常用的培养基,天然培养基,直接取自动物组织提取液活体也作为培养基,种类：血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸出液。,特点：营养价值高，成分复杂，不稳定，来源受到限制，不宜大量生产使用。,应用：许多细胞系和原代基传代细胞培养。,合成培养基,概念：用化学成分明确的试剂配制的培养基,组成：糖、氨基酸、无机盐、维生素及其他成分。,特点：组份稳定，容易配置。,缺点:不能直接使用,血清,血清在动物细胞培养中起着多方面的作用：,提供细胞生存和增殖所必需的生长调节因子。,补充基础培养基中没有或量不足的营养成分。,含有一些可供贴壁细胞型细胞贴壁生长的基质成分。,提供载体蛋白，可结合维生素、脂质、金属离子等。,在一些情况下，中和毒性物质保护细胞不受伤害。,给培养液提供良好的缓冲系统。,提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受死细胞释放的蛋白酶的伤害。,但是血清也存在一些弊端，比如存在不少有害成分（补体、免疫球蛋白和一些生长抑制因子等）；血清成分不明确，影响对结果的分析；不同动物、不同批次的血清成分和活性有很大不同，使得培养结果不稳定。,尽管如此，血清仍然是培养液中最基本的添加物，尤其是在原代培养或细胞生长状态不良时，常常会先使用有血清的培养液进行培养，待细胞生长旺盛后再换成无血清培养液。,无血清培养基,无血清培养基和试剂被广泛的应用于培养哺乳动物和无脊动物细胞以制备单克隆抗体，病毒抗原和重组蛋白等。大多数的无血清产品含有向细胞内转运离子的转铁蛋白和调节葡萄糖摄取量的胰岛素，以及一些蛋白质如清蛋白，纤连蛋白，胎球蛋白等，这些蛋白在细胞培养中发挥各种不同功能，如吸附毒性化合物，抗生物反应器剪切力，提供细胞贴壁所需的基质，作为脂类和其他生长因子的载体等。,第六,章 植物细胞制药,植物组织细胞培养室指在无菌和人工控制的营养（培养基）及环境条件（光照温度）下，研究植物的细胞组织和器官以及控制其生长发育的技术。,植物无菌培养包括：,.,愈伤组织培养,.,悬浮培养,.,器官培养,.,胚胎培养,一,.,细胞的后含物和生理活性物质,细胞中除了含有生命物质原生体外，还有许多非生命物质，细胞的代谢产物：,一类是后含物，储存物质或废弃物质，分布于液泡内，糖类，盐类，生物碱，有机酸，苷，挥发油等,另一类是生理活性物质，对细胞内生化代谢和生理活动起着调节作用。,二、常用的灭菌方法,所,有的细胞都是好气的，但培养不需要很高的气液传质速率，要保持较低的传质水平。,泡,沫的性质不同于发酵，气泡大黏度也大，通常用化学或机械的方法。培养过程也可能粘附于反应器壁上，电极或挡板上。,常,用次氯酸钙，次氯酸钠或氯化汞。,1.,次氯酸钙为工业漂白粉过滤后的饱和溶液，,适用,于草本植物和柔软组织的无菌处理，时间,5-30,分钟。,2,氯化汞灭菌效果好但不宜除去，时间不宜过长，以免杀死植物细胞，用于休眠种子的灭菌剂最为理想。适用浓度为,0.1%,，,2-10,分钟，种子皮较厚的延长,20,分钟。,氯化汞用后如何处理？,用其他用灭菌剂灭菌后用无菌水洗涮,3-4,次即可，用氯化汞残毒较难去除无菌水涮洗,8-10,次，每次不少于,3,分钟，以便除去残毒。,三培养基及其组成,1,、无机盐其中,大量元素,有,钙,Ca,、,磷,P,、,钾,K,、,硫,S,、,钠,Na,、,氯,Cl,、,镁,Mg,，微量元素有,铁,Fe,、,锌,Zn,、,硒,Se,、,钼,Mo,、,碘,I,等,2,、,C,源：碳水化合物，肌醇，甘油，葡萄糖，乳糖和半乳糖,3,、,N,源,:,常用的蛋白质水解产物及氨基酸,4,、维生素,5,、植物生长调节剂：植物激素等,常,用的植物激素：生长素，分裂素，赤霉素，脱落酸，乙烯。,植,物组织和细胞培养物的生长过程主要取决于生长素和分裂素的比例。比例高刺激细胞分裂，比例低刺激细胞生长。,四培养的方法,1,按对象分：原生质体和单细胞培养,2,按培养基：固体培养琼脂培养和固定化培养,液体培养：悬浮培养，成批培养，连续培养，半连续培养,两,步培养法：第一步使用适合的细胞生长培养，营养丰富，第二步使用适于次级代谢产物合成的培养基，较低含量的硝酸盐和磷酸盐，并含有较低的糖分或少量的碳源。,五植物细胞培养实例,西洋,参的工艺流程：西洋参根无菌根愈伤组织悬浮细胞培养物发酵液细胞西洋参细胞干粉成品,第七,章 酶工程制药,药用酶：具有预防和治疗疾病功效的酶。,酶法制药：在一定条件下利用酶的催化作用将底物转化为药物的技术过程。,生,物传感器：用生物活性材料与物理化学换能器结合的一门交叉学科，是发展生物技术必不可少的一种先进的检测方法与监控方法，也是一种物质分子水平的快捷微量分析方法。,生,物传感器：用生物活性材料与物理化学换能器结合的一门交叉学科，是发展生物技术必不可少的一种先进的检测方法与监控方法，也是一种物质分子水平的快捷微量分析方法。,生,物传感器原理,：待测物质经扩散作用进入生物活性材料，经分子识别发生生物学反应，产生的信息被相应的物理或化学换能器转化成可定量和处理的电信号，再经两次仪表放大并输出，便可知道待测物浓度。,酶的生产菌提产方法,1,、添加诱导物。,2,、控制阻遏物浓度。,3,、添加表面活性剂。,4,、添加刺激剂。,5,、添加产酶促进剂。,酶的选择,1,、根据欲生产药物的结构特点选择,2,、根据底物的特点选择,3,、根据副产物的特点选择。,4,、根据产物要求选择没的使用形式。,反,应器类型,1,、间歇式搅拌反应器,2,、连续搅拌反应器,3,、填充床反应器,4,、流化床反应器,5,、循环反应器,6,、连续流动搅拌罐,-,超滤膜反应器,7,、其他反应器,第八,章 微生物,发酵制药工艺,发酵,：通过微生物培养而获得产物的过程。,初级代谢产物,：在初级代谢过程中形成的产物，包括各种小分子前体，单体和多糖蛋白质.脂肪 核酸等生长所必需的 几乎所有生物初级代谢产物都相同。,发酵制药,：利用微生物的生长繁殖，通过发酵，代谢合成药物，然后从中分离提取，精制纯化 获得药品的过程。,发酵制药的基本过程,：孢子制备,种子制备,发酵控制,预处理,分离提取,浓缩纯化,成品检验,包装,原料药,发酵前期特征,：从接种至菌体达到一定临界度时间 包括延滞期 对数期 和减速期,发酵中期,：菌体开始进入合成期 生产速率加快 对外界条件非常敏感,发酵后期,：发酵必须结束 必须在菌体自溶前结束 否则产物被破坏。,诱变育种的流程,：出发,菌种,-,单,孢子悬,液,-,诱变处理,-,稀释,涂,板,-,单,菌落,初筛,-,高产,菌株,复,筛,-,稳定性特征,-,投入,生产,杂交育种,：,1.体细胞重组生殖育种,2.结合育种,3.原生质体融合,培养基成分,：生长因子 前体与促进剂 消泡剂 碳源 氮源 水 无机盐,前体,：加入到发酵培养基中的某些化合物，被直接结合到目标产物中，而自身的结构无多大变化,促进剂,：促进产物生成的物质，但不是营养物，也不是前体的一类化合物 表面活性剂等,消泡剂,：降低泡沫的液膜强度，和表面粘度，使泡沫破裂的化合物。种类:表面活性剂，天然动植物油脂等。,培养剂的分类,1.按发酵过程中所处位置和作用分：斜面或平板 固体 种子 发酵和补料培养基。,2.孢子培养基：营养物质不能太丰富。,控制发酵培养基的质量,1.控制水源质量（加水控制培养基粘度）,2.控制培养基原料的质量（保持稳定的原料来源）,3.控制培养基粘度。（淀粉 黄豆粉等增加培养基粘度，酶水解 大分子物质）,4.控制灭菌操作,制药生产用培养基的配制,1.生物学原则：根据不同微生物营养和反映需要设计,2.工艺原则：不影响通气搅拌，分离精致和废物处理 过程容易控制,3.低成本原则：原料来源方便质量稳定，质优价廉。,4.高效经济原则:满足菌体生长和合成产物的寻求最高得率 最小到产物。,培养基设计基本思路,1.起始培养基,2.单因素实验,3.多因素实验,4.中式放大实验,5.综合考虑各种,因素，确定,适宜配方。,杂菌,：除生产菌以外的任何微生物。,污染,：感染杂菌的培养或发酵体系。,消毒,：杀灭或消除一切病原微生物，达到无害化程度，杀灭率99.9以上。,杀菌,：杀灭或消除一切微生物，达到无活微生物存在的过程，杀灭率99.9999,灭菌,：微生物杀灭率99.999999以上,培养基灭菌的操作方式,1.分批灭菌操作,：,三路进汽,：空气通道 排料管 取料管,凡是罐体与外界相通的管道不进气就排气,所有与外界相通的管道都必须有蒸汽流动。,2.连续灭菌操作,：,配料罐（预热70-90）,泵加热罐（混合.快速升温到130-140）维持罐（维持5-7分钟）冷却罐（40-50）,空气除菌操作工艺,空气质量,：相对湿度小于70，比培养基温度高10-30，洁净度100级。或失败率10,流量比 比如1:0.8 为发酵液量与通入空气量之比,工业制备大量空气的方法,（1）加热灭菌,（2）静电除菌,（3）介质除菌：空气除菌原理：1.离心厂作用，2.直接被截留 3.静电引力,空气过滤（工业用）,空气,总过滤机粗过滤精过滤（聚四氧乙烯膜）,空气灭菌工艺过程,空气预处理,：粗过滤 压缩机 储罐,除去空气中油和水,：冷却器 旋风分离器 丝网分离器,空气过滤,：加热器 过滤器,粗过滤,压缩机,储罐,冷却器,旋风分离器,冷却器,丝网分离器,加热罐,总过滤器,粗过滤器,精过滤,确定种子级数的因素,1.菌种生长特性及菌种繁殖速度,2.发酵罐的容积,3.产物的品种及生产规模,4.所选用的工艺条件,接种方式,1.单种法：一只种子罐接种一只发酵罐,2.双种法：两只种子罐接种一只发酵罐,3.倒种法：从发酵罐取出一定量发酵液接种到另一个发酵罐,高密度培养,：菌体浓度至少达到50g,L以上的一种理想培养，发酵工艺目标和方向明确。,生物学检测主要参数,：1.细胞形态：镜检,2.菌体浓度：干重 鲜重 细胞数目,发酵终点判断原则,1.经济原则：在最大生产率时，终止发酵 发酵周期要短。,2.产品质量原则：对于抗生素生产，放罐前16小时停止补料和消沫，发酵时间短 营养物质残留，发酵时间长 菌体自溶，改变发酵液性质，增加分离纯化的难度。,发酵终点的判断,最低生产成本获得最大生产能力的时间；,产率,:单位体积 单位时间内的产量,得率,：转化率，单位原料生产的产物量。,发酵系数,：但为发酵周期内，发酵体积生成的产物量。,体积产率,：发酵单位除以总发酵时间,第九章 药事法规,药事（药学事业）,包括：药物研究与开发、药品生产、药品经营、药品检验、药品管理、药品使用、药学教育等七个方面。,药品的特殊性,1、主属性：处方药与非处方药,2、两重性,3、药品质量的重要性,4、药品的时限性,处方药与非处方药,处方药:凭执业医师或执业助理医师处方才可调配、购买和使用的药品。,非处方药：不执业医师或执业助理医师处方，消费者可自行判断，购买和使用的药品,药品的质量特征,（1）有效性,（2）安全性,（3）稳定性,（4）均一性,(5,)经济性,药品工业生产特点,（1）原料辅料品种多，消耗大,（2）机械化、自动化程度要求高,（3）卫生要求严格,（4）药品生产的复杂性、综合性,（5）产品质量要求严格、品种规格多、更新换代快,（6）生产管理法制化,GMP的中心指导思想,任何药品的质量形成是生产出来的而不是检验出来的。因此，必须对影响药品生产质量的因素加强管理。,批生产管理,批：在规定限度内，具有同一性质和质量，并在同一连续生产周期中生产出来的一定数量的药品为一批。每批药品均应编制生产批号。,批号：用于识别“批”的一组数字或字母加数字。用以追溯和审查该批药品的审查历史。,