生物显微镜技术2-其他常用制片方法和特殊染色方法.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一节 其他常用制片方法,一、冰冻切片法,冰冻切片法是以水为包埋剂，将已经固定或新鲜的组织块借助低温冷冻使其达到一定的硬度，然后在切片机上切片的一种方法。,在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。,不经过脱水和透明步骤，组织没有收缩，易保持生活的原有形态，尤其在免疫组织化学染色中，能较好的保存细胞抗原的免疫性，所以是保存脂肪组织、神经组织特别是酶的活性十分理想的切片方法。,（,一）,冷冻切片的种类,半导体冰冻切片机,低温恒冷箱冰冻切片法,二氧化碳冰冻切片法,甲醇循环制冷冰冻切片法等,这些方法，随着时代的变迁，科技的发展，许多年前被认为是非常重要的技术，现在也逐步被淘汰了。当然有些技术，如,低温恒冷箱冰冻切片法,，正在受到青睐。,操作方法及步骤：,（1）,取材，未能固定的组织取材，不能太大太厚，厚者冰冻费时，大者难以切完整，最好为24242mm。,（2）速冻：为了较好地保存细胞内的酶活性或尽快制成切片标本的需要，一般在取材后就要立刻对组织块进行速冻，使组织温度骤降，缩短降温的时间，减少冰晶的形成。,常用的骤冷剂有：CO,2,气（78）丙酮干冰冷却的轻石油醚、乙烷和庚烷（80）液氮（190）液氮冷却的丙烷（19）。,液氮适用于组织化学，较安全。缺点：组织块易发生龟裂。,如组织块小可适量加OCT包埋剂,（,3,）切片：,取出组织支承器，放平摆好组织，周边滴上包埋剂，速放于冷冻台上，冰冻。小组织的应先取一支承器，滴上包埋剂让其冷冻，形成一个小台后，再放上细小组织，滴上包埋剂。将冷冻好的组织块，夹紧于切片机持承器上，启动粗进退键，转动旋钮，将组织修平。,调好欲切的厚度，根据不同的组织而定，原则上是细胞密集的薄切，纤维多细胞稀的可稍为厚切，一般在,5,10um,间。,调好防卷板。制作冰冻切片，关键在于防卷板的调节上，这就要求操作者要细心，准确地将其调较好，调校至适当的位置。,切片时，切出的切片能在第一时间顺利地通过刀防卷板间的通道，平整地躺在持刀器的铁板上。,这时便可掀起防卷板，取一载玻片，将其附贴上即可。,应视不同的组织选择不同的冷冻度。,冷冻箱中冷冻度的高低，主要根据不同的组织而定,适宜温度,样品名称,0,-15,脑、淋巴结、甲状腺、肝脏、脾脏、骨髓,-15,-30,舌、肌肉、肠、胰腺、前列腺、子宫、卵巢,-30,-60,脂肪、网膜,（4）染色：切好的冰冻切片，室温下自然晾干12h后，入4丙酮固定10min，待干燥后便可根据需要进行不同染料染色或用锡纸包好封存于-20冰箱。,方法：切片固定30秒1分钟。水洗。染苏木素35分钟,。,分化。于碱水中返蓝20秒。伊红染色1020秒。脱水，透明，中性树胶封固。,冰冻组织12分钟，切片1分钟，固定1分钟，染色共五分钟。总共在10分钟内完成快速制片过程，结果与石蜡切片不相上下。,（,5,）冰冻切片时的注意事项：,防卷板及切片刀和持刀架上的板块应保持干净。组织块不须经各种固定液固定，尤其是含水的固定液，在未达到固定前，更不能使用。临床快速冰冻切片，不须要预先固定，一是为了争取时间，二是固定了的组织，反而增加了切片的难度。如果使用未完全固定的组织做冰冻切片，就会出现冰晶。这是因为含水的固定液在组织未经固定前，其中的水份也可渗入到组织中去，当冰冻发生时，这些水份就存留于组织中，形成了冰晶。,当切片时，如果发现冰冻过度时，可将冰冻的组织连同支承器取出来，在室温停留片刻，再行切片，或者用口中哈气，或者用大拇指按压组织块，以此来软化组织，再行切片。用于附贴切片的载玻片，不能存放于冷冻处，于室温存放即可。因为当附贴切片时，从室温中取出的载玻片与冷冻箱中的切片有一种温度差，当温度较高的载玻片附贴上温度较低的切片时，由于两种物质间温度的差别，当它们碰撞在一起时，分子彼此间发生转移而产生了一种吸附力，使切片与载玻片牢固地附贴在一起。,（,三）冰冻切片的优缺点：,优点：,1,、简便，可以不需要对组织固定、脱水、透明、包埋等手续即可进行切片，减少了一些中间环节。,2,、快速，用时短。,3,、组织变化不大。,4,、能很好保存脂肪，类脂等成分。,5,、能够比较完好地保存各种抗原活性及酶类，特别是对于那些对有机溶剂或热的温度耐受能力较差的细胞膜表面抗原和水解酶保存较好。,缺点,：,1,、不容易做连续切片。,2,、切取的组织不能过大，组织过大不容易冻结或者组织冻结不均，影响切片及染色效果。,3,、不容易制作较薄的切片。,4,、组织块在冻结过程中容易产生水的结晶而影响细胞的形态结构及抗原物质的定位，并且组织结构也不如石蜡切片清晰。,（四）主要应用,1,、用于有些水解酶的定位的组织化学方法以及免疫组织化学方法等。,2,、用于证明脂肪及类脂和神经组织髓鞘的染色时的切片。,3,、用于临床手术的快速病理诊断。,二、火棉胶切片,火棉胶是一种硝化纤维，由浓硝酸和浓硫酸作用于脱脂棉而得，易溶于纯酒精和乙醚的等量混合液中。,火棉胶制片的过程大体与石蜡切片法相似,1,、取材相同，在,FAA,液,中固定,24,小时。可在此液中保存。,2,、脱水 从低浓度至高浓度乙醇，每级需要,1,2,天，接着过渡到,1/2,乙醇,+1/2,乙醚中（至少,1,小时）,1,2,天,3,、浸火棉胶 浸胶时间根据材料大小和厚薄而定，,5,毫米厚的组织需要,1,2,周，大块组织需要,1,2,个月。,4,、包埋 凝固后取出放入等量的,95%,酒精及甘油中，可长期保存。放入,18%,火棉胶溶液中包埋。让酒精和乙醚慢慢挥发，一般,2,3,周。,5,、修块、切片 材料周围保留,3,6,毫米的火棉胶，修好好放入,70%,的酒精保存，有继续硬化火棉胶的作用。,85%,的酒精则有软化火棉胶的作用。滑动切片机切片，切片放在,70%,的酒精中。,6,、染色 染色可将带有火棉胶的切片进行染色，也可以用,1/2,乙醇,+1/2,乙醚溶去火棉胶后，再染色。,独特的滑动式切片机，具有自动步进马达进样功能。切片厚度范围1-100m，样本大小最大可至15590mm。极其平滑的刀架运动确保舒适、无疲劳的操作。智能化和现代的电子控制配合高精度的机械性能确保最佳的切片效果。,优点：火棉胶制片包埋不用二甲苯及石蜡，不经高温，可避免组织收缩及变脆，,适用于精细材料（脑）的切片,，火棉胶有韧性，切片不至于有折卷或破裂，,适用于大块组织、多空洞组织（脑、眼球）,、,硬度较高组织（骨、肌腱），,在制作较大结构（如眼球、睾丸等）的切片时，常用火棉胶包埋法；骨和牙等坚硬的组织，可用弱酸（稀硝酸）脱钙后，用石蜡或火棉胶切片,缺点：手续麻烦、费时间，切片不能切薄，起码在,10m,以上，不能作连续切片，因此，在生物制片技术上已经不经常采用。,三、涂片法,涂片法是将材料均匀地涂布在载玻片上的一种制片方法,可在载玻片上涂成单层细胞进行观察，涂片材料有单细胞生物、小型藻类、血液、细菌培养液、动植物的疏松组织、精液、花药等。,其中血涂片的显微检查是血液细胞学检查的基本方法，临床上应用极为广泛，制备厚薄适宜，分布均匀，染色良好的血涂片是血液学检查的重要基本技术之一。步骤：消毒取血推片染色观察。,染色,瑞氏染色或姬姆萨氏染色,瑞氏染料：由碱性染料美蓝和酸性染料黄色伊红。用 甲醇作瑞氏 染料溶剂，即成瑞氏染液,姬姆萨染料：为天青色素、伊红、次甲蓝的混合物，本染色液最适于血液涂抹标本、血球、疟原虫、立克次体以及骨髓细胞、脊髓细胞等的染色,注意事项,玻片的清洗：新玻片常有游离碱质，因此应用清洗液或,10%,盐酸浸泡,24h,，然后再彻底清洗。用过的玻片可放入适量肥皂水或合成洗涤剂的清水中煮沸,20min,，再用热水将肥皂和血膜洗去，用自来水反复冲洗,必要时再置,95%,乙醇中浸泡,1h,，然后擦干或烤干备用。,使用玻片时只能手持玻片边缘，切勿触及玻片表面，以保持玻片清洁、干燥、中性、无油腻。,一张良好的血片，要求厚薄适宜，头体尾分明，分布均匀，边缘整齐，两侧留有空隙。血片制好后最好立即固定染色，以免细胞溶解和发生退行性变化。,血膜未干透，细胞尚未牢固附在玻片上，在染色过程中容易脱落，因此血膜必需充分干燥。,四、磨片法,骨，牙齿等组织，不经脱钙和切片，直接在磨石上用手工磨成大约50微米左右的薄片，然后再进行染色封固在载玻片上的标本。,1、取材和磨片,2、磨片脱脂和脱水,3、封固,4、,染色：骨磨片可以经染色后再封固，这样结构可以清晰地显出。染色方法很多，如镀银、酸性品红、茜素红、大丽紫和结晶紫等。如用大丽紫染色后，骨小管呈蓝紫色,五、整体封藏法,一种是将胚胎或小动物经前期固定后整体封藏于盛满固定剂的透明容器中。,另一种是将发育至某一阶段的鸡胚整体取出，经固定、染色、脱水、透明后封固于载玻片上的标本。,六、铺片,将需要观察的薄片组织用手工的方法直接铺于载玻片上，然后经过固定、染色等程序制成的标本。例如蛙的肠系膜铺片，大白鼠的皮下组织铺片等。,第二节 特殊染色技术,特殊染色法是为了达到某些特殊的要求，或是为了观察特殊的组织结构，例如：观察间质的结构变化，需要作胶原纤维染色，弹力纤维染色或网状纤维染色。又如，要观察组织内某些物质的状况，例如糖，脂肪和粘液、纤维素等时，均需特殊显示的染色方法。,特殊染色的方法繁多，显示不同的物质需要不同的方法，显示相同的物质也有不同的方法。,随着科学的发展，目前在生物制片中，所应用的染色剂种类越来越多。,一、结缔组织染色法,结缔组织的组成,光学技术切片的结缔组织染色是指胶原纤维，弹力纤维和网状纤维染色，而通常所说的结缔组织染色多指胶原纤维染色。,（一）胶原纤维染色法,1,、,Ven Gioeson,氏苦味酸复红法（,1889,）,此法是用来区分胶原纤维和肌纤维的经典染色方法，习惯称之为,V,G,染色法。,染液是苦味酸和酸性复红的混合液,操作方法：切片脱蜡常规至水，蒸馏水洗；,Weigent,氏铁苏木素液染核；水洗（用自来水充分冲洗）；,1,酸盐酸酒精分化；流水冲洗；,Ven Gieson,氏苦味酸复红染色,15,分钟；滤纸稍印干或用,95,酒精迅速脱色与脱水；无水酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封盖。,结果：胶原纤维红色，肌纤维黄色，核褐色。,2.Masson,三色染色法,Masson,三色染色法是由,Mallory,氏苯胺蓝菊黄,G,发展改良而来，但对于固定液有一定的选择性，虽然任何固定液固定后的组织可进行染色，但最好是用,Zenker,氏固定液或,Bouin,氏固定液固定组织。福尔马林固定的标本切片在染色前以,3%,升汞作第二次固定一小时以上，则可增强着色效果。,操作方法：略,结果：胶原纤维绿色（或蓝色），肌肉、纤维素红色，红细胞橘黄色，核蓝黑色。,（二）网状纤维染色法：,网状纤维染色，人医常作用于某些肿瘤的鉴别诊断，如癌与肉瘤的鉴别。还可作为恶性肿瘤的发生以及预后的观察。,网状纤维的染色方法很多，但都是嗜银浸染法，虽然各法操作步骤及染液的配制有所不同，其基本原理还是相同的。由于组织内的蛋白质与银化合物的结合，再经过还原而成为金属银，沉积于组织内及其表面，因此得以着色。,操作方法：（,Gomri,氏染色法）,结果：网状纤维黑色，胶原纤维黄色,桔黄色，细胞核呈灰黑色。,（三）弹力纤维染色法,弹力纤维较细，直径,0.2-1,微米，且坚固，弹性大，容易伸展，纤维分枝连接成网，没有原纤维，量少时不易与胶原纤维区分，量多时才可识别。,HE,染色与胶原纤维着色相似，若用弹力纤维染色法，则可分辨的很清楚。例如，观察血管弹力层的异常。,弹力纤维具强嗜酸性，用升汞，酒精固定染色较佳，适于福尔马林固定。,1.Weigert,氏弹力纤维染色法：,试剂配制：盐基性复红（碱性品红）,1g,间苯二酚（雷锁辛）,4-5g,蒸馏水,200ml 29%,三氯化铁水溶液,25ml 95%,酒精,200ml,浓盐酸,4ml,结果：弹力纤维呈暗蓝色，细胞核呈蓝色，胶原纤维呈红色，肌纤维呈黄色。,2.Verhoeff,氏弹力纤维染色法：,试剂配制：,将,1,克苏木素加热溶于,20ml,的无水酒精，冷却后，加,1%,三氯化铁水溶液,8ml,搅拌；再加入,8ml,的,Lugoi,碘液（碘,1,克，碘化钾,2,克，蒸馏水,100ml,）搅拌混合而成。染液仅可存放,2-3,周。,结果：,弹力纤维蓝黑色，其它组织视复染而定。,注意事项：,这种染色法染液配制简单，但对微细弹力纤维不如,Weigert,氏效果好。,二、肌肉组织染色法,Mallory,氏磷钨酸苏木素染法,(,简称,P,、,T,、,A),试剂成分,Mallory,氏磷钨酸苏木素 磷钨酸,2g,苏木素,0.1g,蒸馏水,100ml,结果：神经胶质和肌胶质均染蓝色，纤维蛋白亦染蓝色，而细胞间结缔组织纤维则染浅红色或不染色；胶原多呈粉红色，粗弹力纤维有时呈紫蓝色。,三、神经组织染色,神经组织用常规,HE,染色，对细微结构不易显示，对神经纤维，髓鞘则无法区别。常用的特殊显示神经组织的染色有：,（一）,Roger,氏神经原纤维法：,结果：,神经原纤维呈黑色。,重氨银溶液配法,：,在,20ml120%,硝酸银中滴入氨水，待至所产生的沉淀溶解为止，后加入,10,滴氨水和,20ml,蒸馏水。,（二）尼氏小体染色,尼氏小体位于神经细胞的胞浆内，固定后由粗细不等的小粒集聚成大小不等的多角形小块或不规则的长形小体。尼氏小体是嗜碱颗粒，易被碱性染料如美蓝、硫堇、结晶紫等所染。,1,、,Pischinger,氏缓冲美蓝法,切片入染液,10min,：,1N,冰醋酸,1.0ml,，,1N,醋酸钠,1.0ml,，美蓝,0.064g,，蒸馏水,100ml,，此液,pH4.6,。,以,4%,钼酸铵水溶液固定染色数分钟。,2,、硫堇染色法,切片脱腊、复水至蒸馏水，入,1%,硫堇水溶液染色,20-60,分钟；蒸馏水洗，入,90%,酒精分色至尼氏小体清晰显出；速经无水酒精脱水、二甲苯透明、树胶封片。,结果：尼氏小体深蓝色，细胞核浅蓝色。,四、单种细胞,1,、肥大细胞染色法（甲苯胺蓝染色法）,试剂配制：,甲苯胺蓝液：甲苯胺蓝，蒸馏水加至,100ml,。,冰醋酸液：冰醋酸，蒸馏水。,操作方法：,略,结果：,肥大细胞颗粒呈红紫色，胞核蓝色。,2,、嗜银细胞染色法,嗜银细胞是柱状细胞，数目较少，大都单独分布于肠腺之间。细胞质含有嗜弱蛋白银颗粒。,Masson,氏银浸法示肠嗜银细胞：,（,1,）用,Bouin,氏液固定、水洗、滴氨水再洗,24h,。,（,2,）于稀氨银溶液中浸,24h,：取,20%,硝酸银水溶液,12.5ml,，滴加氨水至产生沉淀恰好溶解为止。再加,20%,硝酸银数滴。至该液呈乳白状而无氨之气味时为佳。,（,3,）水洗、入,Cajal,氏液调色。,硫氰化铵,3,克、硫代硫酸钠,3,克、蒸馏水,100ml,、,1%,氯化金水溶液,1ml,。,（,4,）蒸馏水洗数小时，脱水，石蜡或火棉胶切片。,结果：嗜银细胞颗粒呈黑色，细胞核褐色。,3,、色素染色法,色素是代谢的产物。在哺乳动物的细胞中最常见的是黑色素，存在于表皮的基底细胞、真皮的成色素细胞或载色素细胞。,黑色素主要在基底细胞内成黄色、棕色或深棕色的颗粒。,DOPA氧化酶反应作用液配置：0.1M磷酸盐缓冲液（pH7.4）溶入0.0056M的Dopa。在此反应液中37孵育1小时。,结果：Dopa氧化酶活性部位为黑棕色颗粒。,五、染色体染色法,染色体是一种具有特殊结构，特殊的个体性及特殊功能的核成份。通过相继的细胞分裂而复制，并且能够保持其形态和生理的性质。,染色体只有在细胞分裂的时期是可以看到的，它们象染得很浓的微小棍棒一样。染色体检测只是检查染色体是否发生了染色体变异（染色体变异是一种严重的遗传病）。,（一）染色体银染法（核仁形成区-NOR的银染显色法）,1、实验原理,当核仁形成区(NOR)在间期转录时，产生一种与转录活动有关的酸性蛋白，此蛋白可保留至中期，并能将染液中的Ag+还原为Ag的颗粒，从而在活性的核仁形成区镀上银，呈现为黑色的区域。,应用这种技术使人类、哺乳动物、两栖类、植物等的核仁形成区(NOR)特异性染为黑色。这种银染色阳性的NOR称为Ag-NOR。,2、,实验方法和步骤,把大培养皿放入水浴中，升温至6570，同时用烧杯预热蒸馏水。,将标本片平放在预热的培养皿垫枕上，用50硝酸银溶液与2明胶溶液以2：1混匀后，立刻滴加到染色体制片上，复以盖片（或擦镜纸）。,待反应液由无色透明变黄，最后变成棕褐色后（约24分钟），立即取出载片，用预热的蒸馏水彻底冲洗，晾干后镜检。,染色适度的片子，染色体为金黄色，NORS为黑色。,有转录活性的区域NOR显示黑色，无转录活性的区域无色。,3、,注意事项：,(,1,)用于Ag-NOR染色的染色体标本，最好是新鲜制备的，以一周以内的制片为好，同时片内要求有众多的分裂相。,(,2,)银染用的两种反应液最好新配，一时用不完可装棕色瓶中，冰箱保存，但不得超过10天。,(,3,)配制和使用硝酸银溶液时要格外小心，不要滴洒在地上、桌上及手上等处，氧化为黑色的污点极难除去。,(,4,)在明胶中添加甲酸可促进反应过程（2克明胶99毫升蒸馏水1毫升甲酸）。,（二）,Ehrlich-Biondi氏染色法,1、组织固定于含升汞及冰醋酸混合液最佳，石蜡或火棉胶。,2、入以下混合液染10-15分钟至24小时。,Biondi氏法：橘黄G饱和溶液10ml，酸性复红饱和水溶液1ml，甲基绿饱和水溶液3ml,3、入0.1-0.5%冰醋酸水洗短时。,4、以70%酒精鉴别，至切片显出红色为止,结果：染色体蓝绿色，中心小体及核仁红色，肥大细胞颗粒篮紫色。,附：,LTS,液基薄层细胞制片方法,LTS,液基薄层细胞制片方法沉降分离与电荷捕获技术的相结合而产生的新一代高科技制片技术。,工作原理沉降分离技术,利用,LTS,特殊沉降液进行细胞的自然沉降。由于病变细胞核浆比增大使得比重变大，沉降速度快，能先沉降到玻片上，优先被玻片上大量的电荷层所捕获，而其他细胞和杂质沉降速度慢，利用这一特性就能有效的分离病变细胞与其他非诊断成分，提高诊断率。,电荷捕获技术,LTS,应用了最前沿的电荷捕获技术，经过这种特殊工艺处理后的载玻片能在表面富集大量的正电荷，形成一层致密的电荷涂层，能够快速、有效地捕获沉降中带负电的细胞及微生物，形成稳固的结合。能有效防止脱片和白片，提高病变细胞的捕获能力和诊断率。,LTS,制片系统的用途,由于技术上的改进，可同时做,HPV-DNA,、免疫组化等检测。,LTS,制片系统试剂盒组成：,LTS,细胞收集液（,10ml,）；,LTS,载玻片；,LTS,细胞处理基液（,200ml,）；标本采集刷；自然沉降桶；离心管（,10ml,）；,LTS,制片系统优点,改良的细胞收集液和细胞处理基液，使细胞收集更轻松，标本处理更迅速；利用一步离心技术，收集诊断信息，去掉影响诊断的成分，通过自然沉降涂片技术结合电荷捕获技术，更好的吸附细胞，并保证细胞形态不改变且无重叠。制片结束经固定即可直接染色，更快捷，防止交叉污染，更去除外来因素的影响，使制片效果达到最佳。,复习思考题,1、列出各制片方法的特点，并比较其优缺点2、,冰冻切片、,火棉胶制片法,各,适合于哪些组织和器官的制片？,3、血涂片的常用染色剂是哪两种？成分主要是什么？,4,、与HE染色法比较，其他特殊染色法的特点是什么？,5、染色体银染法（,Ag-NOR）,的原理？,