细胞工程-第八章 植物种质保存.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第八章 植物种质保存 第一节 种质资源保存类型 一、概念,种质：是决定生物遗传性状，并将遗传信,息从亲代传递给子代的遗传物质。种质库：是指以种为单位的群体内的全部,遗传物质，它有许多个体的不同,基因所组成。又称基因库。种质资源：具有种质并能繁殖的生物体统,称为种质资源或遗传资源。,二、种质保存的意义 随着经济发展，地球不断开发及生态环境破坏，每年都有多个物种消失或濒临灭绝。各种植物，包括栽培种、野生种甚至杂草，都具有各自独特的优良基因，是植物品种改良乃至农业可持续发展的基础。它们是经过长期进化而来，一旦失去不会再来。因此，世界各国都很重视植物种质资源的收集与保存的研究。,三、种质保存的方法,按保存的地理位置分为原地保存和异地保存。原地保存是在原来的生态环境条件下,就地保存,自我繁殖品种资源,一般野生品种资源采用这种方式保存,如建立自然保护区,天然公园等；异地保存是将种子或植株保存于该品种资源原产地以外的地区,这种保存可采用植物园、种质园、种质库等形式或采用试管保存形式。按照保存的具体方法,品种资源的保存可分为种植保存、贮藏保存、试管保存、基因文库保存。,1,、种植保存 为了保持品种资源的种子或无性繁殖器官的生活力,并不断补充其数量,品种资源材抖须每隔一定时间播种一次,即种植保存。在种植保存时,种植条件尽可能与原产地相似,以减少由于生态条件的改变而引起的变异和自然选择的影响。在种植过程中应尽可能避免或减少天然杂交和人为混杂。播种和收获时取样要有代表性以免因抽样而造成遗传漂移。总之要尽可能地保持原品种或类型的遗传特点和群体结构。此外,对来自自然条件悬殊地区的品种资源,可分别在不同生态地点异地种植保存。,2,、贮藏保存,贮藏保存就是用控制贮藏条件,(,主要是温度和湿度,),的方法,来保持品种资源种子的生活力。长期贮藏保存种子生活力的技术关键是低温和干燥,通过控制种子周围环境中的温湿度,迫使种子处于代谢作用的最低限度。贮藏保存种质资源采用种质库,种质库分三种：长期库、中期库和短期库。,3,、基因文库保存 利用,DNA,重组技术，将种质材料的总,DNA,或染色体所有片断随机连接到载体上，然后转移到寄主细胞中，通过细胞增殖，构成各个,DNA,片断的克隆系。,第二节 试管保存,一、常温下试管保存,可利用试管苗继代培养保存，但需要经常更换培养基。,二、常温抑制生长保存,为了延缓继代时间，可在培养基中添加长抑制剂或提高渗透压等。如脱落酸,(ABA),、矮壮素（,2-,氯乙基三甲基氯化按，简称,CCC,）、二甲氨基琥珀酸酰胺（简称,B,9,）、多效唑（,PP,333,）等都是生长抑制物质，培养基中添加一定量可以延缓生长。一般情况下几个月继代一次，而添加这些物质后，可达到一年甚至以上,。,提高培养基渗透压也可以延缓生长。可用蔗糖或甘露醇，浓度分别调到,10%,左右和,4%6%,。,三、中低温调控生长保存,在试管苗继代培养过程，适当降低温度，也能延缓生长，延长继代时间。一般植物可调到,19,，热带、亚热带植物调至,1020,。,四、常温抑制生长保存与中低温调控生长保存相结合 培养基中添加生长抑制剂或提高渗透压，培养温度降低，使继代时间延长。,第三节 超低温保存,Cryopreservation,一、超低温保存的基本原理和主要环节,在液氮中（,-196,），几乎所有的细胞代谢活动停止，仅保存细胞的活力和形态发生的潜力。当解冻后，能够恢复再生能力。,超低温保存比较复杂，哪一步操作不当，都会使细胞受伤害，失去再生能力。,注：,超低温通常指低于一,80,的低温,，,保存介质或容器有干冰,(,一,79,),、,超低温冰箱,(-80-150,),、液氮,(-196,),和液氮蒸气相,(-140,),等,，,其中液氮最常用。,二、超低温保存技术,1,、保存材料的选择,2,、冷冻前材料预处理,3,、添加冷冻防护剂,4,、材料冷冻的方法（预冷）,5,、材料保存,6,、保存材料解冻,7,、保存材料复苏培养,1,、保存材料的选择 花粉、茎尖分生组织、芽、种胚、小植株、愈伤组织、体细胞胚等均可以作为保存材料。,2,、冷冻前材料预处理 为了使保存材料适应超低温条件，必须进行预处理。预处理方法：将保存材料放在高糖浓度、添加二甲基亚砜（,DMSO,）、脯氨酸，在接近零度下培养数日。,3,、添加冷冻防护剂 为了抵抗冻害，使用冷冻防护剂。常用的冷冻防护剂有：二甲基亚砜（,DMSO,）、甘油、脯氨酸、糖类、乙二醇、二甘醇、乙酰胺、福美氧化硫等。,4,、材料冷冻的方法,材料冷冻保存的原理：冷冻时，细胞外的溶液水分子，先形成冰晶中心，而冰晶形成的速度与溶液成分、降温速度有关。一般在,-20,-60,范围内，晶体中心增长最快，形成大块冰晶体之后，慢慢减速，到,-140,时完全停止增长。,4,、冷冻处理（,1,）快速冷冻将植物材料从,0,或者其它预处理温度直接投入液氮中保存的方法。降温速度为,1000,/min,。,植物体内的水分在降温冷冻过程中，从,-10,-140,范围内是冰晶形成和增长的危险温度区，到,-140,时完全停止增长，关键是利用高速降温越过冰晶增长的危险温度区，不能形成致死的冰晶，细胞内水分固化，不会破坏细胞结构。,（,2,）慢速冷冻法,将植物材料从,0,或者其它预处理温度以降温速度,为,12/min,从起始温度降到,-100,，稳定,1h,后投入液氮中保存或以此降温速度降至,-196,。在这种降温速度下，细胞内水分有充分的时间不断渗入到细胞外结冰，使细胞内水分减少到最底限度，避免细胞内结冰,（,3,）预冷冻法投入液氮前，需经过短暂时间的低温锻炼的方法两步冷冻：慢速冷冻至,-40,，停留一段时间，快速冷冻。,逐级冷冻：材料通过不同温度等级降温至,-40,，停留一段时间，投入液氮快速冷冻。,（,4,）干燥冷冻将材料置于,2729,烘箱内降低植物含水量，在投入液氮中保存。此法可以防止材料冻死。,5,、材料保存,-196,液氮冰箱中或液氮罐中保存。,6,、保存材料解冻 解冻速度是解冻技术关键，一般在,37,的热水浴中解冻。解冻速度慢，细胞内容易发生再结晶，而导致细胞死亡。解冻速度快，来不及再结晶，细胞存活。,（,1,）快速解冻法保存材料直接投入到,3740,水浴中进行解冻的方法。,-50-10,是再结冰的温度区（,2,）慢速解冻先置于,0,解冻，在逐渐升温至室温。可以使水分慢慢渗入细胞内。,7,、保存材料复苏培养 保存材料解冻后，需用液体培养基冲洗几遍，除去冷冻防护剂的残留毒害。然后可以在固体培养基上进行培养，进行正常生长，再生植株。重新生长的细胞（组织）存活率,=100%,解冻的细胞（组织）,A,The shoot tip of papaya(arrows)from plantlet was excised from an,in vitro,plant(bar:1 mm);B,Excised shoot tips utilized for cryopreservation(bar:1 mm);C,After vitrification and warming,shoot tip remained green during culture and resumed growth within 1 week without forming callus(bar:1 mm);D,Shoot tip elongated after 4 weeks(Bar:1 mm);E,Rooting of elongated shoot occurred after 8 weeks(bar:1 cm).,