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单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式文本样式文本,样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,生化实验2 电泳,实验,思路,蛋白质的理化性质有哪些?,蛋白质的分离方法有哪些?,本次实验利用了哪个性质?,生物化学教研室 朱欣婷,生物化学教研室 朱欣婷,生物化学教研室 朱欣婷,电场强度越大或支持物越短,电流将随之增加,产热也增加,影响分离效果。,离子强度如果过低,缓冲液的缓冲容量小,不易维持pH恒定,生物化学教研室 朱欣婷,I越大,电动电势越小,u越小;,生物化学教研室 朱欣婷,1球蛋白,血清蛋白依次分为清蛋白,,离子强度如果过低,缓冲液的缓冲容量小,不易维持pH恒定,生物化学教研室 朱欣婷,生物化学教研室 朱欣婷,2.缓冲溶液:,pH值:(pH-pI)越大,Q越多,u越大,离子强度(I):,I越大,电动电势越小,u越小;,I越小,电动电势越大,u越大,但样品易扩散。,离子强度如果过低,缓冲液的缓冲容量小,不易维持pH恒定,0.2之间。,生物化学教研室 朱欣婷,电场强度:电泳支持物上每厘米的电位降,也称电势梯度。,3.电场强度(X),X越大,u越快。,支持物越短,X越大,u越快。,电场强度越大或支持物越短,,电流将随之增加,产热也增加,影响分离效果。,在进行高压电泳的时候必须用冷却装置,否则可引起蛋白质等样品发生热变性而无法分离。,生物化学教研室 朱欣婷,4.支持介质:,目前常用的电泳支持物:,纤维薄膜(玻璃纤维薄膜,醋酸纤维薄膜),凝胶(琼脂糖凝胶,聚丙烯酰胺凝胶),生物化学教研室 朱欣婷,负极,正极,表面带负电荷,带正电荷的水层携带粒子向负极移动,如果样品原本是移向负极的,则泳动的速度加快;,如果样品原本是,移向正极的,则泳动的速度减慢。,电渗作用,:,电渗:,在电场作用下液体对固体支持物相对移动的现象。,生物化学教研室 朱欣婷,以纸电泳为例:,(一)按支持物的物理性状不同,区带电泳可分为:,1滤纸及其它纤维(如玻璃纤维、醋酸纤维、聚氯乙烯纤 维薄膜)电泳,2粉末电泳:如纤维素粉、淀粉电泳;,3凝胶电泳:如琼脂、琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶电泳;,4丝线电泳:尼龙丝、人造丝电泳。,三、区带电泳的分类,生物化学教研室 朱欣婷,(二)按支持物的装置形式不同,区带电泳可分为:,1平板式电泳:支持物水平放置;,2垂直板式电泳:聚丙烯酰胺凝胶可做成垂直板式电泳;,3垂直柱式电泳:聚丙烯酰胺盘状电泳,生物化学教研室 朱欣婷,(三)按pH 的连续性不同,区带电泳可分为:,1连续pH 电泳:即整个电泳过程pH 保持不变,如常用的纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳等。,2非连续pH 电泳:缓冲液和电泳支持物间有不同的pH 的电泳,如聚丙烯酰胺凝胶盘状电脉,等电聚焦电泳等。,生物化学教研室 朱欣婷,(二)血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳,生物化学教研室 朱欣婷,【实验原理】,血清蛋白质,等电点,分子量,占总蛋白的,清蛋白,4.64,69,000,57,72,1,球蛋白,5.06,200,000,2,5,2,球蛋白,5.06,300,000,4,9,球蛋白,5.12,90,000,150,000,6.5,12,球蛋白,6.85,7.3,156,000,950,000,12,20,缓冲液,pI,pH,血清蛋白,带负电荷,在电场中向正极移动,生物化学教研室 朱欣婷,血清蛋白依次分为清蛋白,,球蛋白的,1,、,2,、五个区带,请预测血清蛋白电泳区带图,清蛋白,1,2,生物化学教研室 朱欣婷,膜条经过氨基黑10B染色后显出清晰色带。,生物化学教研室 朱欣婷,各色带蛋白质含量与染料结合量基本成正比。,可将各色带剪开,分别溶于碱性溶液中。,用分光光度法计算各种蛋白质的百分数。,3.,血清蛋白电泳结果的临床意义:,生物化学教研室 朱欣婷,临床上还可用A/G比来表示清球蛋白的量的关系:,可能相关疾病,清蛋白,1,球蛋白,2,球蛋白,球蛋白,球蛋白,骨髓瘤,*,肾病综合症,*,*,肾炎,*,肝硬化,*,急性肝坏死,*,传染性肝炎,*,*,急性感染初期,*,*,*,慢性炎症/感染后期,*,低,球蛋白血症,*,1准备与点样,:,取两条2.58cm的膜条,充分浸透在巴比妥缓冲液中,取出膜条,滤纸吸去多余的缓冲液,点样器下端粘上薄层血清,垂直,点样,生物化学教研室 朱欣婷,放置,膜条,平衡5,分钟,通,电,关闭,电源,2电泳,点样面向下,点样端置于阴极,膜条贴,紧滤纸,拉直膜条,电压:160v,时间:60 min,生物化学教研室 朱欣婷,通 电,完 毕,浸于染色液(氨基黑10B)中,取出,膜条,浸于漂,洗液,3染色、脱色,取出,膜条,5min,浸于漂,洗液,2min,5min,浸于漂,洗液,滤纸吸,干薄膜,5min,直至,漂净,生物化学教研室 朱欣婷,取试管6支,编号16,(两人的膜条共用),试管编号,A,1,2,0,0.4mol/LNaOH,6.0ml,3.0ml,3.0ml,3.0ml,3.0ml,3.0ml,蛋白条带,清蛋白,1,球蛋白,2,球蛋白,球蛋白,球蛋白,无蛋白区,充分振荡,脱净染料,比 色,定 量,生物化学教研室 朱欣婷,1计算出各部分蛋白质占总蛋白质的百分数。,清蛋白(2A/,T)100,1,球蛋白(,1,/,T)100,2,球蛋白(,2,/,T)100,球蛋白(/T)100,球蛋白(/T)100,光密度总和T2A,1,2,2计算出清蛋白与球蛋白之比值(2A/G),G=,1,2,生物化学教研室 朱欣婷,I越大,电动电势越小,u越小;,2非连续pH 电泳:缓冲液和电泳支持物间有不同的pH 的电泳,如聚丙烯酰胺凝胶盘状电脉,等电聚焦电泳等。,4mol/LNaOH,1在本实验电泳过程中,正负电极各发生什么反应?电极附近的缓冲液有什么变化?,电泳后各区带应明显分开,如分离不清或不整齐,试分析其可能存在的原因。,简单绘制血清蛋白电泳后的谱图。,血清蛋白电泳结果的临床意义:,4丝线电泳:尼龙丝、人造丝电泳。,pH值:(pH-pI)越大,Q越多,u越大,在进行高压电泳的时候必须用冷却装置,否则可引起蛋白质等样品发生热变性而无法分离。,球蛋白的1、2、五个区带,蛋白条带,层析技术的分类及各自的原理。,生物化学教研室 朱欣婷,90,000150,000,(一)按支持物的物理性状不同,区带电泳可分为:,球蛋白,1.,点样面为不光滑面,勿用手触摸感知;,2.,点样量适中,垂直点样;,3.,点样端接电泳仪负极;,4.,膜条与滤纸需贴紧,拉直;,5.,谨防触电。,生物化学教研室 朱欣婷,1在本实验电泳过程中,正负电极各发生什么反应?电极附近的缓冲液有什么变化?,2.电泳时,点样端置于电场的正极还是负极?为什么?,3.除利用电泳法分离蛋白质以外,还有哪些分离方法?,4.,简单绘制血清蛋白电泳后的谱图。,5.电泳后各区带应明显分开,如分离不清或不整齐,试分析其可能存在的原因。,思考与练习,生物化学教研室 朱欣婷,1.蛋白质的理化性质?,2.蛋白质的盐析?,3.蛋白质的显色反应有哪些?,4.分离蛋白质的方法有哪些?,5.层析技术的分类及各自的原理。,6.透析的原理?,下次课预习内容,生物化学教研室 朱欣婷,感谢观看,
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