微生物考研微生物的生长.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,微生物考研微生物的生长,二,.,以数量变化对微生物生长情况进行测定,三,.,以生物量为指标测定微生物的生长,一,.,微生物生长概述,要求：掌握微生物生长的概念及常规测定方法,（原理和操作）,第一节 微生物生长的测定,生长,growth,：有机体的细胞组分与结构在量方面的增加。,表现为细胞质的量不断增加，体积加大。,繁殖,reproduction,由于细胞分裂而引起的个体数目的增加,。,单细胞微生物如细菌，生长往往伴随着细胞数目的增加。,多细胞微生物（如某些霉菌）细胞数目的增加（菌丝细胞的不断延长或分裂）如不伴随着个体数目的增加，只能叫生长。只有通过形成无性孢子或有性孢子使得个体数目增加的过程才叫做繁殖。,一般情况下，当环境条件适合时，生长与繁殖始终是交替进行的。从生长到繁殖是一个由量变到质变的过程，这个过程就是发育,development。,一,.,微生物生长概述,微生物在自然界总是混杂地生活在一起，要想研究某一种微生物，必须把研究对象从混杂群体中分离出来。,获得纯培养的方法,稀释倒平板法,pour plate method,涂布平板法,spread plate method,平板划线分离法,streak plate method,利用选择培养基分离,单细胞（单孢子）分离法,纯培养技术,纯培养(,pure culture),微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养.,1、稀释倒平板法,2、涂布平板法,操作较麻烦，对,好氧菌、热敏感,菌效果不好！,使用较多的常规,方法，但有时涂,布不均匀！,3,、平板划线分离法,（,Streak Plate）,特点：快速、方便。,分区划线（适用于浓度较大的样品）,连续划线（适用于浓度较小的样品）,4,、选择培养分离,抑制大多数其它微生物的生长，使待分离的微生物生长更快,数量上升,直接挑取待分离的微生物的菌落获得纯培养。,为了从混杂的微生物群体中分离出某种微生物，可以根据该微生物的特点，包括营养、生理、生长条件等，采用选择培养的方法进行分离。,利用选择培养基进行直接分离,富集培养,利用选择培养基分离,根据所要分离的菌种的特性选用培养基：,分离真菌用马丁氏培养基，,pH,偏酸；,分离放线菌用高氏1号，,pH,中性偏碱。,根据不同菌对化学试剂的敏感性：,分离放线菌，培养基中加10%酚，抑制细菌、真菌；,从土壤中分离真菌，加链霉素，抑制细菌生长。,根据分离对象的营养特征：,分离能发酵纤维素的菌株，培养基以,纤维素,为唯一碳源。,分离固氮菌，用,无氮培养基,。,5,、单细胞（单孢子）分离法,采用显微分离法,在显微镜下,从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。,毛细管法：,用毛细管提取微生物个体，适于较大微生物,显微操作仪：,用显微针、钩、环等挑取单个细胞或孢子,小液滴法：,将经过适当稀释后的样品制成小液滴，在显微镜下选取只含一个细胞的液滴来进行纯培养物的分离。,第一节 微生物生长的测定,二,.,以数量变化对微生物生长情况进行测定,1、培养平板计数法,2、膜过滤培养法,3,、显微镜直接计数法,三,.,以生物量为指标测定微生物的生长,1、比浊法,2、重量法,3、生理指标法,在微生物学中提到的“生长”，一般均指群体生长。,1、培养平板计数法,二,.,以数量变化对微生物生长情况进行测定,测定微生物,的,活菌数,viable count,稀释平板测数法,dilute plate count,以,CFU(colony forming units),表示,稀释培养测数法,（又称最大概率法,，,MPN most probable number,）,（参见实验教材）,2、膜过滤培养法,测定含菌较少的空气和水中的微生物数目,水中的细菌总数：124个/100,ml,将定量的样品通过滤膜过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。,菌数低的样品（如水）,膜过滤 培养,菌落计数,（二）以数量变化对微生物生长情况进行测定,3,、显微镜,直接计数法,采用细菌计数板或血球计数板，在显微镜下对微生物数量进行直接计数（计算一定容积里样品中微生物的数量）。,缺点：,不能区分死菌与活菌；,不适于对运动细菌的计数；,需要相对高的细菌浓度；,个体小的细菌在显微镜下难以观察。,三,.,以生物量为指标测定微生物的生长,1、比浊法,在一定范围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度成正比，菌数越多，光密度越大。因此，在一定波长下测定菌悬液的光密度，就可反映菌液的浓度。,2、重量法,细胞干重测定：单位体积的培养液中的微生物细胞的干重。,3、生理指标法,总氮量：用化学分析方法测出微生物细胞中蛋白质或氮元素的含量。,DNA,含量：用荧光法测定微生物细胞中,DNA,含量。,代谢活性：根据微生物生命活动的强度来估算生物量。,如单位体积培养物在单位时间内的,O,2,消耗、糖消耗或产酸产,CO,2,量等。,特点：快速、简便；但易受干扰。,细菌生长繁殖的规律（标准生长曲线）,及控制技术（连续培养的概念与方法）,第二节 细菌的群体生长繁殖,一、生长曲线,一条典型的生长曲线至少可以分为,迟缓期，对数期，稳定期和衰亡期,等四个生长时期,迟缓期,lag phase,（滞留适应期）,菌种初接入新鲜培养液内，微生物细胞需要通过自身生理机能的调节逐步适应新环境。表现为细胞数量不增加了但细胞个体体积增大，代谢活跃,菌种：繁殖速度较快的菌种的延迟期一般较短,菌龄：,用对数生长期的菌种接种时，其延迟期较短，甚至检查不到延迟期,接种量：,一般 接种量增大可缩短甚至消除延迟期（发酵工业上一般采用1/10的接种量）,培养基成分：,在营养成分丰富的天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上生长时短；,接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。,影响延迟期长短的因素：,认识延迟期的特点及原因对实践的指导意义：,在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期；,采取的,缩短,lag phase,的,措施有：,增加接种量；,（群体优势-适应性增强）,采用对数生长期的健壮菌种；,调整培养基的成分，在种子基中加入发酵培养基的某些成分。,选用繁殖快的菌种,在食品工业上，尽量在此期进行消毒或灭菌,对数期,logarithmic growth phase,细菌生长旺盛，代谢活力强。分裂速度快，菌数以指数级数增加，代时稳定。,应用意义：,由于此时期的菌种比较健壮，生产上用作接种的最佳菌龄；,发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度,食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期,是生理代谢及,遗传研究或进行染色、形态观察等,的良好材料,。,在对数生长期内，细菌数目的增加是按,指数,级数增加的，即 2,0,2,1,2,2,2,3,2,n,这里的指数,n,为细菌分裂的次数或者增殖的代数，也就是一个细菌繁殖,n,代产生2,n,个细菌。,如果在对数期开始时间,t,1,的菌数为,x,1,，,繁殖,n,代后到对数期后期,t,2,的菌数为,x,2,，,则,代时,(Generation time,，,G),（,即每增加一代所需要的时间）,G=（t,2,-t,1,）/n,先求代数,n,由于,x,2,=x,1,2,n,lgx,2,=lgx,1,+nlg2；,n=（lgx,2,-lgx,1,）/lg2,n=3.3 lg(x,2,/x,1,),G=（t,2,-t,1,）/3.3 lg(x,2,/x,1,),例如：,在一细菌培养液中第一次测得的细菌数为 10,4,/,ml，,经过培养 4,h,后，又测得菌液中的细菌数为 10,8,/,ml，,求此菌的世代时间和在此时间内繁殖的代数。,根据公式：,G=（t,2,-t,1,）/3.3 lg(x,2,/x,1,),t,2,-t,1,=（4-0）60 min=240 min,x,2,=10,8,x,1,=10,4,lg(x,2,/x,1,)=lg10,8,lg10,4,=8-4=4,代入上式,G=240/3.3 4=240/13.2=18 min,即在上述培养液中，世代时间为 18,min。,细菌繁殖代数,n=(t,2,-t,1,)/G=240/18=13.3,繁代。,稳定期(,stationary phase),又称恒定期或最高生长期。处于稳定期的微生物，新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等，整个培养物中二者处于动态平衡，此时生长速度，又逐渐趋向零。,在一定容积的培养基中，细菌为什么不能按对数期的高速率无限生长呢?,这是由于对数期细菌活跃生长引起周围环境条件条件发生了一系列变化，某些营养物质消耗，有害代谢产物的积累，以及诸如,pH、,氧化还原电位、温度等的改变，限制了菌体细胞继续以高速度进行生长和分裂。,稳定期的细胞内开始积累贮藏物，如肝糖、异染颗粒、脂肪粒等，大多数芽孢细菌也在此阶段形成芽孢。如果为了获得大量菌体，就应在此阶段收获，因这时细胞总数量最高。,这一时期也是发酵过程积累代谢产物的重要阶段，某些放线菌抗生素的大量形成也在此时期。,稳定期的微生物，在数量上达到了最高水平，,对于发酵生产来说，一般在稳定期的后期产物积累达到高峰，是最佳的收获时期。,应用意义：,1）发酵生产形成的重要时期（抗生素、氨基酸等），生产上应尽量延长此期，提高产量，措施如下：,补充营养物质（补料）,调,pH,调整温度,2）稳定期细胞数目及产物积累达到最高。,衰亡期(,decline phase),细菌死亡率逐渐增加，群体中活菌数目急剧下降，出现了“负生长”。其中有一段时间，活菌数呈几何级数下降，故有人称之为“对数死亡阶段”。,这一阶段的细胞，有的开始自溶，产生或释放出一些产物，如氨基酸、转化酶、外肽酶或抗生素等。菌体细胞也呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有的细胞内多液泡，革兰氏染色反应的阳性菌变成阴性反应等。,不是所有细胞均处于完全相同的生理状态，因此，在细菌生长的整个周期，细菌数和培养时间，往往是一条缓慢上升以后又逐渐下降的曲线。,认识和掌握细菌生长曲线，对发酵生产的指导意义：,1,）计算生长速率和代时；,2,）不同生长期的细胞在结构和生理上可能有很大差别，了解生长曲线，就能根据需要进取样和收获；,3,）不同的生长期理化因子对微生物的影响可能不同。对数生长期的细胞较为一致，因此常用于研究细胞的新陈代谢。,三、连续培养,（,continuous culture）,分批培养,（,batch culture）,：将微生物置于一定容积的定量的培养基中培养，培养基一次性加入。不再补充和更换，最后一次性收获。,连续培养,（,continuous culture）,：在微生物培养的过程中，不断供给新鲜的营养液，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期。,连续培养,理论基础：基于对典型生长曲线中稳定期形成原因的认识，采取相应有效措施推迟其来临，从而发展出连续培养技术。,原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。,单批培养,恒浊法,恒化法,单批培养连续培养时间,连续流入,新鲜培养液,lg,细胞数（个/,ml）,连续培养,连续培养原理,概念：,通过调节培养基流速，使培养液浊度保持恒定的连续培养方法。,原理：调节新鲜培养基流入的速度和培养物流出的速度来,维持菌浓度不变,即浊度不变,。采用,光电装置检测培养容器中的浊度,，,当浊度高时，使新鲜培养基的流速加快，浊度降低，则减慢培养基的流速。,特点：基质过量，微生物始终以最高速率进行生长；但工艺复杂，烦琐。,连续培养技术恒浊连续培养,使用范围：用于生产大量菌体、生产与菌体生长相平行的某些代谢产物，如乳酸、乙醇等。,连续培养技术,恒化连续培养,概念：以恒定流速使营养物质浓度恒定并保持细菌生长速率恒定，,使微生物始终在低于其最高生长速率下进行生长繁殖,的方法。,原理：通过控制某一种营养物浓度（如碳、氮源、生长因子等），使其始终成为生长限制因子，而达到控制培养液流速保持不变，,细菌的生长速率将取决于限制性因子的浓度。,特点：维持营养成分的,亚适量,，控制微生物生长速率。菌体生长速率恒定，菌体均一、密度稳定，产量低于最高菌体产量。,应用范围：实验室科学研究,装置,控制对象,培养基,培养基流速,生长,速率,产物,应用范围,恒浊器,菌体密度（内控制）,无限制生长因子,不恒定,最高,大量菌体或与菌体形成相平行的产物,生产为主,恒化器,培养基流速（外控制）,有限制生长因子,恒定,低于最高,不同生长速率的菌体,实验室为主,恒浊器恒化器的比较,连续发酵（,continuous fermentation,）,连续培养在生产上的应用，相对于单批发酵而言。,优点：,缺点：,连续发酵的生产时间受以上因素限制，一般只能维持数月 1年。,缩短发酵周期，提高设备利用率；,便于自动控制；,降低动力消耗及体力劳动强度；,产品质量较稳定。,杂菌污染,菌种退化,营养物利用率低于单批培养,在分批培养中，各个细胞的生理状态、代谢活动并不完全一样。为了解决这一问题，就必须设法使群体处于同一发育阶段，使群体和个体行为变得一致，因而发展了单细胞的同步培养技术。,同步培养法,synchronous culture,：能使培养的微生物处于比较一致的生长发育阶段上的培养方法,。,同步生长的概念：一个细胞群体中各个细胞都在同一时间进行分裂的状态，称为同步生长,（,synchronous growth）,，进行同步分裂的细胞称为同步细胞。,同步细胞群体在任何一时刻都处在细胞周期的同一相，彼此间形态、生化特征都很一致，因而是细胞学、生理学和生物化学等研究的良好材料。,四、同步培养,获得同步生长的方法：,获得同步生长的方法主要有两类：,环境条件诱导法：变换温度、光线、培养基等，造成与正常细胞周期不同的周期变化。,选择法：选择性过滤、梯度离心。物理方法，随机选择，不影响细胞代谢。,机械法又称选择法,微生物的子细胞与成熟细胞，通过机械法就可使它们在一定程度上分开来。然后用同样大小的细胞进行培养便可获得同步培养物。,离心沉降分离法,过滤分离法,硝酸纤维薄膜法,机械法同步培养物是在不影响细菌代谢的情况下获得的，因而菌体的生命活必然较为正常。,局限性：,有些微生物即使在相同的发育阶段，个体大小也不一致，甚至差别很大，这样的微生物不宜采用这类方法。,Helmstetter-Cummings,法,原理：一些细菌细胞会紧紧粘附于硝酸纤维微孔滤膜上。,步骤：菌悬液通过微孔滤膜，细胞吸附其上；反置滤膜，以新鲜培养液通过滤膜，洗掉浮游细胞；除去起始洗脱液后就可以得到刚刚分裂下来的新生细胞，即为同步培养。,调整生理条件的同步法（诱导法）,温度调整法 将微生物的培养温度控制在亚适温度条件下一段时间，使细胞的生长在分裂前不久的阶段稍微受到抑制，然后将培养温度提高或降低到最适生长温度，大多数细胞就会进行同步分裂。,营养条件调整法 即控制营养物的浓度或培养基的组成以达到同步生长。例如限制碳源或其他营养物，使细胞只能一次分裂而不能继续生长，从而获得了刚分裂的细胞群体，然后再转入适宜的培养基中，它们例进入了同步生长。,用最高稳定期的培养物接种,抑制,DNA,合成法,利用代谢抑制剂阻碍,DNA,合成相当一段时间，然后再解除其抑制，也可达到同步化的目的。试验证明：氨甲蝶呤,、5-,氟脱氧尿苷、羟基尿素、胸腺苷、脱氧腺苷和脱氧鸟苷等，对细胞,DNA,合成的同步化均有作用。,机械法对细胞正常生理代谢影响很少；而诱导同步分裂虽然方法多，应用广，但对正常代谢有时有影响，而且对其诱导同步化的生化基础了解很少。,必须根据待试微生物的形态、生理性状来选择适当的方法。,同步生长的时间，因菌种和条件而变化，由于同步群体的个体差异，同步生长不能无限地维持，往往会逐渐破坏，最多能维持23个世代，又逐渐转变为随机生长，即非同步化。,第三节 真菌的生长,一、菌丝的生长繁殖,菌丝的生长是顶端生长，菌丝各个部分都有极性之分，即位于前端的为幼龄菌丝，位于后面的为老龄菌丝。,菌丝生长与营养有关，营养丰富则分支点与菌丝生长顶端的距离短，即分支多而频繁；营养贫乏分支点同菌丝生长顶端距离长，即分支少。菌丝在固体培养基或在液体培养中静止培养时形成菌落，在液体培养中振荡培养时则形成菌丝球。,二、孢子生长,无性孢子繁殖,孢子的生长包括:,孢子肿胀（外源肿胀，不需营养；内源肿胀，需要营养）,萌发管形成,菌丝生长。,有性孢子繁殖,第一阶段是质配（,plasmogamy）,第二阶段为核配（,karyogamy）,第三阶段是减数分裂（,meiosis）,丝状微生物的群体生长,丝状微生物的纯培养采用孢子接种，在液体培养基中震荡培养或深层通气加搅拌培养，菌丝体通过断裂繁殖不形成产孢结构。可以用菌丝干重作为衡量生长的指标，即以时间为横坐标，以菌丝干重为纵坐标，绘制生长曲线。,可分为三个阶段：,1、生长停滞期,2、迅速生长期,3、衰退期,1、生长停滞期:造成生长停滞的原因一是孢子萌发前真正的停滞状态，另一种是生长已经开始，但还无法测定。,2、迅速生长期:菌丝体干重迅速增加，其立方根与时间呈直线关系，菌丝干重不以几何级数增加，没有对数生长期。生长主要表现在菌丝尖端的伸长和出现分支、断裂等，此时期的菌体呼吸强度达到高峰，有的开始积累代谢产物。,3、衰退期:菌丝体干重下降，到一定时期不再变化。大多数次级代谢产物在此期合成，大多数细胞都出现大的空泡。有些菌丝体还会发生自溶菌丝体，这与菌种和培养条件有关。,丝状微生物的群体生长,微好氧菌,适于2030生长，如土壤微生物、植物病原微生物。,细胞膜中饱和脂肪酸含量高，使膜在高温下能保持其稳定性并具正常的功能。,测定微生物的活菌数viable count,将定量的样品通过滤膜过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。,采用对数生长期的健壮菌种；,菌体细胞也呈现多种形态，有时产生畸形，细胞大小悬殊，有的细胞内多液泡，革兰氏染色反应的阳性菌变成阴性反应等。,对数生长期的细胞较为一致，因此常用于研究细胞的新陈代谢。,光复活现象：经紫外线照射的微生物，在可见光下，光可以激活DNA修复酶，该酶能修复DNA上的损伤，使微生物的突变率或死亡率下降。,在日常生活中常用烘干、晒干和熏干等方法来保存食物。,如果在对数期开始时间 t1的菌数为 x1，繁殖 n 代后到对数期后期t2的菌数为 x2，则,氧化蛋白质活性基团，酶失活,以数量变化对微生物生长情况进行测定,此法的缺点是灭菌比较费时，一般只用于不耐热的药品、营养物、特殊培养基等的灭菌。,原理：当微生物在单批培养方式下生长达到对数期后期时，一方面以一定的速度流进新鲜培养基并搅拌，另一方面以溢流方式流出培养液，使培养物达到动态平衡，其中的微生物就能长期保持对数期的平衡生长状态和稳定的生长速率。,第四节 微生物生长繁殖的控制,控制（有害）微生物的生长速率或消灭不需要的微生物，,在实际应用中具有重要的意义。,抑制(,Inhibition)：,生长停止，但不死亡；,死亡(,Death)：,生长能力不可逆丧失；,防腐(,Antisepsis)：,防止或抑制霉腐微生物在食品等物质上的生长；,化疗(,Chemotherapy)：,杀死或抑制宿主体内的病原微生物；,消毒(,Disinfection)：,杀死或灭活病原微生物（营养体细胞）；,灭菌(,Sterilization)：,杀死包括芽孢在内的所有微生物；,防腐,antisepsis,一种抑菌作用，利用某些理化因子，使物体内外的微生物暂时处于不生长繁殖但又未死亡的状态。这是一种防止食品腐败和其他物质霉变的技术措施。如低温、干燥、盐腌、糖渍等等。,消毒,disinfection,是指杀死或消除所有病原微生物的措施，可达到防止传染病传播的目的。例如将物体煮沸,10 min，,就可杀死病原菌的营养体，但绝非杀死所有的芽孢，常用于牛奶、食品以及某些物体表面的消毒。利用消毒剂,（,disinfectant），,也可进行皮肤、体膜或体内的处理。,灭菌,sterilization,是指用物理或化学因子，杀灭物体中的所有活微生物，包括最耐热的细菌芽孢。这是一种彻底的杀菌措施。通过灭菌的物品不再存在任何有生命的有机体。,化学治疗,chemotherapy,是指利用某些具有选择毒性的化学药物(如磺胺)或抗生素，对生物体的深部感染进行治疗，可以有效地消除宿主体内的病原体，但对宿主却没有或基本上没有损害。,一、控制微生物的化学物质,化学物质的抗微,生物能力的测定,液体培养法,最低抑制浓度（,minimum inhibitory,Concentration （MIC）,实验,平板培养法,抑菌圈（,zone of inhibition）,试验,微生物生长繁殖的控制,一、控制微生物的化学物质,抗微生物剂,抑菌：,抑菌剂(,Bacteriostatic agent),杀菌,杀菌剂(,Bactericide),溶菌剂(,Bacteriolysis),待测化学物质 对数生长培养物,定时测定总菌数和活菌数,类型,名称及使用方法,作用原理,应用范围,醇类,70%,75%乙醇,脱水、蛋白质变性,皮肤、器皿,醛类,0,.5,%,10%甲醛,2%,戊二醛（,pH=8,）,36%甲醛溶液（6,ml/m,3,）,高锰酸钾适量产气熏蒸,蛋白质变性,房间、物品消毒（不适合食品厂）,酚类,3%,5%石炭酸,0.5,1%,2%来苏儿,3%,5%来苏儿,破坏细胞膜、蛋白质变性,桌面、地面、器具,皮肤消毒,皮肤,地面、器具,氧化剂,0,.1,%,高锰酸钾,3%过氧化氢,0,.2,%,0.5%过氧乙酸,氧化蛋白质活性基团，酶失活,皮肤、尿道、水果、蔬菜,皮肤、物品表面,皮肤、塑料、玻璃、人造纤维、水果、蔬菜等,常用的消毒防腐剂及其应用,常用的消毒防腐剂及其应用,类型,名称及使用方法,作用原理,应用范围,重金,属盐,类,0.05%0.1%,升汞,2%红汞,0.1%1%硝酸银,0.1%0.5%硫酸铜,蛋白质变性、酶失活,变性、沉淀蛋白,蛋白质变性、酶失活,非金属器皿,皮肤、粘膜、伤口,皮肤、新生儿眼睛,防治植物病害,表面,活性,剂,0.05%0.1%新洁尔灭,0.05%0.1%杜灭芬,蛋白变性、破坏细胞膜,皮肤、粘膜、器械,皮肤、金属、棉织品、塑料,卤素及其,化合物,0.20.5,mg/L,氯气,10%20%漂白粉,0.5%1%漂白粉,2.5%碘酒,破坏细胞膜、蛋白质,饮水、游泳池水,地面和厕所消毒,水、空气及饮水消毒,皮肤,染料,2%4%,龙胆紫,与蛋白质的羧基结合,皮肤、伤口,酸类,0,.1%,苯甲酸,0,.1%山梨酸,食品防腐,食品防腐,（一）抗代谢类药物（生长因子类似物）,:,概念：,有些化合物在结构上与生物体,所必需的代谢物,很相似，以致于可以和特定的酶结合，从而阻碍酶的功能，干扰代谢的正常进行，这些物质叫抗代谢物，用于疾病治疗，称抗代谢类药物，如：磺胺类药物。,机理：作为细菌细胞基本生长因子的竞争性抑制剂（与相应酶竞争性结合）而阻止微生物对生长因子的利用，因而可以抑制微生物的生长。只有当正常代谢产物的量少或不存在时，抗代谢物才有用。,种类：磺胺药,对氨基本甲酸,；,6-,巯基嘌呤,嘌呤；,5-,甲基色氨酸,氨基酸；,异烟肼,吡哆醇。,上次课知识点回顾,1、微生物生长量的测定,2、细菌纯培养生长曲线,3,、分批培养与连续培养（恒化法与恒浊法）,4,、微生物生长的控制。,例如限制碳源或其他营养物，使细胞只能一次分裂而不能继续生长，从而获得了刚分裂的细胞群体，然后再转入适宜的培养基中，它们例进入了同步生长。,接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长，所以发酵工业上尽量使发酵培养基的成分与种子培养基接近。,丝状微生物的纯培养采用孢子接种，在液体培养基中震荡培养或深层通气加搅拌培养，菌丝体通过断裂繁殖不形成产孢结构。,3 lg(x2/x1),将定量的样品通过滤膜过滤，菌体被阻留在滤膜上，取下滤膜进行培养，然后计算菌落数，可求出样品中所含菌数。,核糖体和其他成分对高温也具较大的抗性；,局限性：有些微生物即使在相同的发育阶段，个体大小也不一致，甚至差别很大，这样的微生物不宜采用这类方法。,以数量变化对微生物生长情况进行测定,连续培养技术恒浊连续培养,其中有一段时间，活菌数呈几何级数下降，故有人称之为“对数死亡阶段”。,如此反复三次，可杀灭所有芽孢和营养细胞，以达到灭菌的目的。,连续培养（continuous culture）：在微生物培养的过程中，不断供给新鲜的营养液，同时排除含菌体及代谢产物的发酵液，让培养的微生物长时间地处于对数生长期。,Helmstetter-Cummings 法,36%甲醛溶液（6 ml/m3）高锰酸钾适量产气熏蒸,涂布平板法spread plate method,第三节 微生物生长繁殖的控制,一、控制微生物的化学物质,抗微生物剂,非选择性,（对所有细胞均有毒性）,有选择性,（对病原微生物毒性更强）,消毒剂(,Disinfectant),防腐剂(,Antisepsis),抗代谢药物,抗生素,中草药有效成分,（化学治疗剂）,二,.,化学治疗剂对微生物的作用,能直接干扰病原微生物的生长繁殖并可用于治疗感染性疾病的化学药物。,它能选择性地作用于病原微生物新陈代谢的某个环节，使其生长受到抑制或致死。,抗代谢药物,抗生素,中草药有效成分,化学治疗剂,种类,（一）抗代谢物,磺胺药物是最早发现，也是最常见的化学治疗剂，抗菌谱广，,能治疗多种传染性疾病。,大多数革兰氏阳性细菌（如肺炎球菌、溶血性链球菌等）,某些革兰氏阴性细菌（如痢疾杆菌、脑膜炎球菌、流感杆菌等）,对放线菌也有一定的作用。,1934年，德国,I.G.Farben,染料厂的,G.Domagk,prontosil,在体内转化成了具有抑菌作用的磺胺,G.Domagk,因发明第一种治疗微生物疾病的“神药”获得了,1939,年的诺贝尔生理和医学奖,一种红色染料（,prontosil），,白鼠静脉注射可治疗因链球菌引起的感染，但在体外却无作用。1935年，进一步证明,prontosil,对人的链球菌病也有效。,二氢蝶啶,+,对氨基苯甲酸 二氢叶酸 四氢叶酸,磺胺药 核酸合成,二氢叶酸合成酶,二氢叶酸还原酶,磺胺药作用机理：,细菌需要利用对氨基苯甲酸合成生长所需的叶酸：,磺胺对人体无毒性，因为人缺乏从对氨基苯甲酸合成叶酸的,相关酶-二氢叶酸合成酶，不能用外界提供的对氨基苯甲酸自行,合成叶酸，而必须直接利用叶酸为生长因子进行生长。,磺胺是对氨基苯甲酸的结构类似物，在一定条件下它们竟争性地与二氢叶酸合成酶结合，阻止或取代了,PABA,进入叶酸分子中，从而阻止了叶酸的合成。,（,PABA,）,抗代谢物与抗代谢类药物,有些化合物在结构上与生物体,所必需的代谢物,很相似，以致可以和特定的酶结合，从而阻碍酶的功能，干扰代谢的正常进行，这些物质叫抗代谢物，用于疾病治疗，称抗代谢类药物。,机理：作为细菌细胞基本生长因子的竞争性抑制剂（与相应酶竞争性结合）而阻止微生物对生长因子的利用，因而可以抑制微生物的生长。,（二）抗生素,概念：,微生物在其生命过程中产生的一类,低分子量,代谢产物，在,很低浓度下,就能抑制或杀死其它微生物的生长。,最小抑制浓度,（,Minimal Inhibitory Concentration,MIC,）,表示抗生素的抗菌活性，单位是,g/ml.,抗菌谱：抗生素的作用范围。,广谱,抗生素,：对多种微生物有作用（如土霉素、四环素）,窄谱,抗生素,：仅对某一类微生物有作用（如多粘菌素）,抗生素的作用机理,1,）作用于细胞壁,青霉素类、头孢菌素类、杆菌肽、环丝氨酸、万古霉素；多氧霉素,2,）干扰细胞膜功能,多粘菌素、短杆菌素；制霉菌素、两性霉素；缬氨霉素、莫能菌素；杀螨素。,3,）作用于蛋白质合成,卡那霉素、链霉素、四环素等主要作用于30,S,亚基；,氯霉素、林可霉素、红霉素等则作用于50,S,亚基。,4,）抑制核酸复制与转录,丝裂霉素,C(,自力霉素)、博莱霉素(争光霉素)、放线菌素,D(,更生霉素)、蒽环类；,新生霉素,、,香豆霉素；喹诺酮类；利福霉素,5,）作用于能量代谢系统,抗霉素、寡霉素,微生物的抗药性：,使抗生素向无活性的形式转化；抗生素作用靶位的修饰；,微生物对抗生素通透性的改变；主动外排系统的产生。,二、控制微生物的物理因素,杀灭或抑制微生物的物理因素,温度,辐射,过滤,渗透压,干燥,超声波,一、温度对微生物生长的影响,（一）微生物生长的温度类型,低温型微生物,psychrophiles,可分为专性嗜冷和兼性嗜冷两种。冷藏食物的腐败往往由这类微生物引起。,分布：,地球两极,5左右的海洋中,12的海洋深处,冷泉,机理：,细胞内的酶在低温下仍能有效地发挥作用；,细胞膜中,不饱和脂肪酸,含量较高，细胞膜在低温下仍保持半流动状态，从而能进行,活跃的物质代谢。,中温型微生物,mesophiles,又可分为室温性微生物和体温性微生物。,室温性微生物,适于2030生长，如土壤微生物、植物病原微生物。,主要为腐生或植物寄生，存在植物或土壤中。,体温性微生物,多为人及温血动物的病原菌，最适生长温度与其宿主体温相近，在2540之间，人体寄生菌为37左右。,高温型微生物,themophiles,适于在4550以上的温度中生长，常见类群有,Bacillus,、,Methanobacterium,等，常给罐头工业、发酵工业带来麻烦。,分布：局限于堆肥、温泉、火山等。,耐高温的原因：,菌体内的酶和蛋白质对热更稳定；,核糖体和其他成分对高温也具较大的抗性；,细胞膜中饱和脂肪酸含量高，使膜在高温下能保持其稳定性并具正常的功能。,不同微生物的致死温度不同，同一菌种不同菌株或不同菌龄，其抗热性也可能不同：,一般幼龄的比老龄的对热敏感。,一般原核生物能在比真核生物更耐高温；,非光合微生物能在比光合微生物耐温；,噬菌体较其宿主细胞抗热；,放线菌和霉菌孢子比营养细胞的抗热性强；,细菌芽孢抗热性最强。,高温杀菌,干热灭菌,焚烧灭菌法,此法灭菌彻底，迅速简便，但使用范围有限。常用于接种工具、污染物品以及实验动物尸体等废弃物的处理。,干热灭菌法160170处理2,h,主要在干燥箱中利用热空气进行灭菌,只适用于玻璃器皿、金属用具等耐热物品的灭菌。其优点是可保持物品干燥,。,湿热灭菌,煮沸消毒法,在水中煮沸15,min,以上，可杀死细菌的所有营养细胞和部分芽孢。这种方法适用于注射器、解剖用具等的消毒。,高压蒸汽灭菌法,是实验室及生产中常用的灭菌方法。加压则可提供高于100的蒸汽，热穿透力强，可迅速引起蛋白质凝固变性。所以高压蒸汽灭菌在湿热灭菌法中效果最佳、应用较广。,一般培养基、各种缓冲溶液、玻璃器皿等，常采用1,kg/cm,2,(,121)处理1530,min,即可达到灭菌的目的。,间歇灭菌法,常压下100处理1530,min,，以杀死其中的营养细胞。冷却后，置于一定温度(2837)保温过夜，使其中可能残存的芽孢萌发营养细胞，再以同样方法加热处理。如此反复三次，可杀灭所有芽孢和营养细胞，以达到灭菌的目的。,此法的缺点是灭菌比较费时，一般只用于不耐热的药品、营养物、特殊培养基等的灭菌。在缺乏高压蒸汽灭菌设备时亦可用于一般物品的灭菌。,巴斯德消毒法,即用较低的温度处理牛奶、酒类等饮料，以杀死其中的病原菌如结核杆菌、伤寒杆菌等，但又不损害营养与风味。,如用6263则处理30,min，,若以71，只需15,min。,处理后的物品应迅速冷却至10左右即可饮用。这种方法只能杀死大多数腐生菌的营养体而对芽孢无损害。此法是基于结核杆菌的致死温度6215,min,而规定的。,微生物的致死温度,在一定时间内（如 10,min）,杀死微生物所需要的最低温度称为微生物的致死温度。,生物的致死时间,在一定温度下杀死微生物所需要的最短时间称为微生物的致死时间。温度愈高，致死时间愈短。,D,值,decimus value,在特定温度下使微生物菌数减少 10 倍所需的时间。,影响膜表面电荷的性质及膜的通透性，进而影响对物质的吸收能力。,改变酶活、酶促反应的速率及代谢途径,影响培养基中营养物质的,吸收,或,有,毒物质的毒性。,二、,pH,值与,微生物生长的相互影响,（一）环境,pH,值,对微生物生长的影响,微生物的生长,pH,值范围极广，但是绝大多数种类都生活在之间。,细菌、藻类、原生动物最适,pH,放线菌最适,pH 7.58.0,霉菌、酵母最适,pH 56,（二,),不同微生物对,pH,要求不同,同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理生化过程中，对,pH,值的要求也不同。在发酵工业中，控制,pH,值尤其重要。,微生物 生长最适,pH,合成抗生素最适,pH,灰色链霉菌,红霉素链霉菌,产黄青霉,金霉素链霉菌,龟裂链霉菌,灰黄青霉,（三）生长的最适,pH,值与发酵的最适,pH,值,同一种微生物在不同的生长阶段和不同生理生化过程中，对环境,pH,值要求不同。,例如：丙酮丁醇梭菌,在,pH,值=5.57.0时，以菌体生长为主,在,pH,值=4.35.3时，进行丙酮丁醇发酵,同一种微生物由于环境,pH,值不同，可能积累不同的代谢产物。,例如：黑曲霉,pH,值=2时，,有利于合成柠檬酸,，只产少量草酸,时，以菌体生长为主,pH,值在7左右时，,合成草酸为主，,只产少量柠檬酸,可利用微生物对,pH,要求的不同，控制杂菌的污染。,无机酸如硫酸、盐酸等杀菌力虽强，但腐蚀性大；某些有机酸如苯甲酸可用作防腐剂；酸菜、饲料青贮则是利用乳酸菌发酵产生的乳酸抑制腐败性微生物的生长。,强碱可用作杀菌剂，但由于其毒性大，用途局限于对排泄物及仓库、棚舍等环境的消毒。强碱对,G,+,与病毒比对,G,-,作用强。结核分枝杆菌抗碱力特强。,根据微生物与氧的关系,可把它们分为几种类群:,专性好氧菌,好氧菌,微好氧菌,兼性厌氧菌,耐氧厌氧菌,厌氧菌,专性厌氧菌,三、氧气对微生物生长的影响,专性好氧菌（,strict aerobe,）,必须在有分子氧的条件下才能生长,。,在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得更好，在有氧时靠呼吸产能，无氧时经发酵或无氧呼吸产能,。,微好氧菌（,microaerophilic bacteria,）,只能较低的氧分压下才能正常生长，通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能。,兼性好氧菌（,facultative aerobe,）,耐氧菌（,aerotolerant anaerobe,）,可在分子氧存在下进行厌氧生活的厌氧菌。生活不需要氧，分子氧也对它无毒害。,厌氧菌（,anaerobe,）,分子氧对它有毒害，短期接触空气，也会抑制其生长甚至致死。,在培养不同类型的微生物时，要采用相应的措施保证不同微生物的生长。,培养好氧微生物：,需振荡或通气，保证充足的氧气,或加入氧化剂提高基质中的,Eh,值。,培养专性厌氧微生物：,需排除环境中的氧气，同时在培养基中添加还原剂,如半胱氨酸,、,亚硫酸钠、,Na,2,S,等,。,培养兼性厌氧或耐氧微生物：可深层静止培养。,四、辐射,辐射：,辐射是指通过空气或外层空间以波动方式从一个地方传播或传递到另一地方的能源。它们或是离子或是电磁波。,是能量通过空间传递的一种物理现