抗肿瘤药物筛选.ppt

单击此处编辑母版标题样式,编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/3/2,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,2021/3/2,*,大家好,2021/3/2,1,抗肿瘤药物筛选,2021/3/2,2,抗肿瘤药物筛选,是新药发现与开发的重要环节,.,通常是指从样品到活性检测至动物实验疗效各个,阶段的工作,.,一般常用以下几种方法,:,1.,肿瘤细胞组织培养筛选方法,2.,微生物学筛选方法,Antitumor durg screening,。,2021/3/2,3,1.,肿瘤组织细胞培养筛选方法,细胞培养法是筛选抗肿瘤药物比较常用的一种方法,.,它包括人体肿瘤细胞和动物肿瘤细胞,培养方法包括单层细胞培养,、,琼脂平板培养,、,细胞集落培养,、,组织块培养,、,器官培养和悬浮培养等,.,观察药物活性的方法包括细胞形态,、,分裂相计数,、,脱氢酶活性,、,细胞染色,、,呼吸测定,、,荧光显微镜下染色反应,、,核酸蛋白质等生化测定以及同位素技术等,.,2021/3/2,4,当前,体外抗肿瘤活性实验选用人癌细胞株,按常规细胞培养法进行培养,使用四氮唑蓝,(MTT),还原法,磺罗丹明,B,染色法或集落形成法等测定药物抗癌作用,.,本实验除了用于抗肿瘤药物的初步筛选外,还用于了解候选化合物的抗瘤谱,为随后进行体内抗肿瘤实验,(,如剂量范围,.,肿瘤类别等,),提供参考,.,2021/3/2,5,2.,微生物学筛选方法,尽管利用癌细胞体外培养,作为抗肿瘤药物的筛选模型,要比利用微生物模型筛选出的,体内有效的抗肿瘤药物的,命中率更大,但基于微生物,生长与动物细胞代谢有这,不少共同点,加上微生物学,方法简便,适合大量天然产物的,初筛,因此,微生物学方法一直为,国内外试验室所采用,.,2021/3/2,6,噬箘体法,噬菌体,(bacteriophage,phage),是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。本世纪初在葡萄球菌和志贺菌中首先发现。噬菌体具有病毒的一些特性：个体微小。噬菌体基因组含有许多个基因，但所有已知的噬菌体都是细菌细胞中利用细菌的核糖体、蛋白质合成时所需的各种因子、各种氨基酸和能量产生系统来实现其自身的生长和增殖。一旦离开了宿主细胞，噬菌体既不能生长，也不能复制。,2021/3/2,7,2021/3/2,8,噬箘体,2021/3/2,9,噬箘体的两种类型,噬菌体有毒（烈）性噬菌体和温和噬菌体两种类型。侵入宿主细胞后，随即引起宿主细胞裂解的噬菌体称作毒性噬菌体。毒性噬菌体被看作正常表现的噬菌体。,温和噬菌体则是：当它侵入宿主细胞后，其核酸附着并整合在宿主染色体上，和宿主核算同步复制，宿主细胞不裂解而继续生长。这种不引起宿主细胞裂解的噬菌体称作温和噬菌体,.,也即溶原性细菌,.,2021/3/2,10,噬箘体法,包括抗噬箘体法和溶原性菌诱导法两种,.,细菌的噬箘体核酸大部分为双链,DNA,干扰,DNA,代谢的抗生素,(,如放线菌素,.,博来霉素,),常也抑制噬箘体在细菌细胞内的生长,从而出现抗噬箘体现象,.,T4,噬箘体吸附在大肠杆菌细胞,2021/3/2,11,2021/3/2,12,应用诱导溶源性菌前噬箘体的方法筛选,.,溶源性菌的噬箘体,DNA,基因组直接螯合到细菌染色体,DNA,不复制,因为大部分基因功能收到了,“,阻遏物,”,抑制,但当活性,“,阻遏物,”,的量由于细胞内或环境因子,(,物理的化学的,),而降低时,溶源性就不能维持,前噬箘体就与染色体离开,进入自己的生长周期,又产生成熟的具感染性的噬箘体使细胞裂解,这种现象即为诱导作用,.,2021/3/2,13,细菌变种法,利用细菌为材料来筛选抗肿瘤抗生素主要有两种方法,.,一类是人工培养变种,使细菌有一定的代谢特征,.,如使细菌糖酵解代谢增强等,或诱变生化变株,使细菌模仿肿瘤细胞的某种代谢特点或者使其对核酸或蛋白质合成的抑制剂有高度的敏感性,.,另一类是检测突变作用,由于抗肿瘤药物能使某些微生物产生突变作用,例如用依赖链霉素菌株来筛选药物,如果使依赖链霉素菌株诱变为不依赖链霉素,那么就有可能具有抗肿瘤作用,.,2021/3/2,14,抗代谢法,抗代谢物在含无机氮 源的合成培养基中显示抗癌作用,而在普通有机氮源的营养培养基中无抗癌作用,.,利用这个特点,选择无机氮源实验有抗菌作用的物质,作为抗代谢的初筛方法,.,2021/3/2,15,精原细胞法,1.,建立精原细胞法的依据,造精过程可分为下列阶段,:A,型精原细胞,、,B,型精原细胞,、,静止期初级精母细胞,、,初级精母细胞,(,细线期,.,偶线期,.,粗线期,.,双线期,.,终变期,),、,次级精母细胞,、,精子细胞,(,园核精子细胞,.,长核精子细胞,),、,精子,.,在造精细胞系列中,对放射最为敏感的是,B,型精原细胞,其次是,A,型精原细胞,然后依次为精子细胞,、,精母细胞,、,精子,.,2021/3/2,16,精原细胞法阳性和抗肿瘤作用的相关性尤以在抗生素和植物药中较为明显,.,用精原细胞法检测,72,种抗生素,精原细胞法阳性的,13,种抗生素,据已报道资料均属抗肿瘤抗生素,其中,9,种在临床上有一定疗效,.,精原细胞法阴性的,59,种抗生素中,除又霉素,、,灭胞素,、,环己烯亚胺,、,螺旋霉素据报道在动物实验有抗肿瘤活性外,其他,55,种均未见报道有抗肿瘤作用,.,在阴性的,59,种中,全部未见报道对肿瘤有临床疗效,.,表明精原细胞法检测结果与体内实验抗肿瘤作用有较好的相关性,.,2021/3/2,17,抗肿瘤药物筛选的分子靶点、,当前用于抗肿瘤药物筛选的靶点种类繁多,.,主要有细胞周期调控信号转导,、,细胞死亡通路,、,耐药性侵袭转移,、,血管生成等,.,1.,抑制血管生成的筛选模型,在肿瘤发生的过程中,当肿瘤的体积超过,0.2-2.0mm,时,开始建立自己的血液供应系统,即血管生成,为肿瘤的生长提供物质基础,.,肿瘤新生血管的滋养作用可为肿瘤细胞的生长提供营养,.,氧气和代谢交换等,.,而血管内皮细胞可通过旁分泌作用产生各种生长因子和刺激因子,如血小板源生长因子,、,胰岛素样生长因子,、,以及细胞因子白介素,-6.,白介素,-8,等,.,这些因子能够诱导刺激肿瘤增殖和迁移,.,而且,肿瘤细胞与毛细血管形成结构上的密切关系,.,此外,肿瘤细胞和血管细胞具有相互作用,.,一方面血管内皮细胞产生的各种生长因子和细胞因子对肿瘤生长起到生长刺激作用,;,另一方面,肿瘤细胞可分泌血管内皮细胞生存和增殖所需的有丝分裂原和动力原等,.,2021/3/2,18,抑制血管生成药物的筛选方法,如上所述,血管生成与肿瘤有着密切的联系,因此近年来几种体内和体外的分析系统已被用于筛选抑制血管生成药物,.,体外分析系统包括血管内皮细胞的培养技术,、,血管内皮细胞在胶原基质上的迁移,、,血管内皮细胞的体外损伤效应和凋亡分析等,.,目前,肿瘤血管生成体内研究的生物试验模型主要有动物,(,大鼠,兔等,),、,眼角膜囊,(,眼前房,),、,地鼠颊囊,、,裸鼠外耳皮下和鸡胚绒毛尿囊膜等四种动物模型,.,2021/3/2,19,以端粒酶为靶点的药物筛选,癌细胞的永生化是肿瘤生长和转移的关键,.,肿瘤细胞内的端粒,.,端粒酶与此特征有非常重要的关系,.,研究资料表明,端粒酶几乎在人类恶性肿瘤中有不同程度的高表达,其活性检出率为,85-95,而肿瘤周围的正常组织及良性病变中的检出率仅为,4.,而且端粒酶活性与肿瘤的恶性程度,肿瘤的大小,淋巴结的转移,肿瘤的分级和预後密切相关,.,目前,普遍认为端粒酶是一种新的,.,很有价值的肿瘤标志物,.,因此,端粒酶已成为抗肿瘤药物筛选的新靶点,.,2021/3/2,20,端粒和端粒酶,端粒是真核细胞线性染色体末端的一种特殊结构,由一段富含鸟嘌呤,(G),的,DNA,串联重复序列及相关蛋白质组成,.,具有高度保守性的端粒能够保护染色体末端免于化学修饰或被核酶降解,防治染色体复制时末,端粒的长度决定细胞的寿命,随着细胞分裂的进行,端粒的长度逐渐缩短,当端粒缩短到一定程度即不能维持染色体的稳定时,细胞最终死亡,.,故有人称端粒为,”,生命的时钟,”,或,”,有丝分裂的计数器,”,.,而大多数肿瘤的端粒长度不随细胞分裂次数增加而缩短,具有无限分裂的能力,其原因在于端粒酶的存在,.,2021/3/2,21,端粒酶是一种,端粒酶能以自身的,RNA,为模板,逆转录合成端粒,DNA,序列添加到染色体末端,以补偿细胞分裂时端粒,DNA,的缩短,使细胞克服危机期,成为永生细胞,.,RNA,依赖的,DNA,聚合酶,属,于核酸蛋白质复合物,由,RNA,和蛋白质两种组分构成,.,大多数体细胞,端粒酶呈非激活状态,.,而大多数肿瘤细胞,端粒酶呈激活状态,.,2021/3/2,22,以端粒酶为靶点筛选的药物,按药物作用机制可分为直接以端粒酶核心组分,(RNA,部分和催化亚基,),为靶标的药物、以端粒的,DNA,为靶标的药物、以端粒和端粒酶蛋白质组分为靶标的药物等,.,如,:,通过端粒重复扩增法证实玉红霉素及其类似物能抑制人端粒酶活性,.,如,:,茶叶中儿茶酚能够直接强烈地抑制端粒酶活性,.,2021/3/2,23,细胞凋亡通路的靶点,诱导细胞凋亡必要的信号分子是一类丝氨酸蛋白酶,称为,Caspases,家族,.,该家族共有十多个成员,可以彼此之间互相活化形成级联反应,.,Caspasea,活化有多种途径,.,1,细胞膜通路,是由肿瘤坏死因子,(TNF),受体家族介导,2,线粒体通路,由线粒体诱导凋亡,主要靠释放细胞色素,C,实现,.,后者,可形成活化,Caspases,的多蛋白复合体,.,2021/3/2,24,有关细胞周期调控的靶点,肿瘤细胞生长的基本特征是细胞失控增殖,其细胞周期及关卡调控失常,故,细胞周期蛋白依赖性激酶和关卡激酶,可能作为抗肿瘤药物的靶点,.,2021/3/2,25,与侵袭转移相关的靶点,基质金属蛋白酶,(MMP),与肿瘤侵袭,、,转移和血管生成有关,.,正常情况下,MMP,受到内源性物质金属蛋白酶组织抑制物,(TIMP),严格控制,.,但在肿瘤则出现,MMP,与,TIMP,的平衡失控,.,高侵袭转移的肿瘤通常伴有,MMP,含量与活性的升高,.MMP,不仅由肿瘤细胞产生,同时也由反应的间质细胞包括成纤维细胞,、,内皮细胞,、,炎症细胞产生,.,以,MMP,为靶点的药物,其作用点不仅在于肿瘤细胞,也在于肿瘤部位的反映性间质细胞,.,近年来,小分子的,MMP,抑制剂已进入临床研究,.,2021/3/2,26,抗肿瘤药物筛选研究趋向,分子生物学,、,分子药理学与分子治疗学的研究进展推动了分子靶向药物的研制和临床对靶向药物疗效的评价,使得我们可以从以下方面进行研究,:,1.,药物来源的多样性,.,如化学合成的化合物,、,微生物,、,植物,、,海洋生物来源物质及生物制品等,.,2.,药物靶点的多样性,.,既利用直接与肿瘤细胞生长相关的分子靶点,也利用与肿瘤微环境相关的分子靶点,.,利用多种多样的分子靶点,将可能发现具有各种分子作用机制的药物,.,3.,研制靶向性药物,.,包括抗体药物和针对特定分子靶点的小分子抑制剂,.,2021/3/2,27,动物实验疗效评价,动物实验疗效评价是发现新药的依据,.,不管采用何种分子靶点和相应的检测方法进行初筛,都必须经过动物实验疗效评价,.,动物体内实验反映药物疗效与毒性的综合结果,是体外方法与模型不能取代的决定性环节,.,动物实验疗效必须选用三种以上肿瘤模型,.,可选用小鼠肿瘤模型,.,人癌裸小鼠移植瘤模型等,.,2021/3/2,28,谢谢观赏,2021/3/2,29,