高效液相色谱法培训.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,高效液相色谱法,1,高效液相色谱法,（HPLC）是60年代末以经典液相色谱法为基础，引入了气相色谱的理论与实验方法，流动相用高压泵输送，采用高效固定相和在线检测等手段发展而成的分离分析方法。,与气相色谱法相比具有：,适用范围广，样品预处理简单，分离效率高，流动相选择范围广，检测方法多为非破坏性的，流出组分可回收等优点。,第一节 概述,2,HPLC,液-固吸附,液-液分配,正相色谱,反相色谱,一般反相色谱,离子对色谱,离子抑制色谱,离子交换色谱,一般离子交换色谱,离子色谱,氨基酸分析,空间排斥色谱,凝胶渗透色谱,凝胶过滤色谱,假相色谱,胶束色谱,环糊精色谱,亲合色谱，,手性色谱，毛细管电泳,键合相色谱,3,离子抑制色谱,（,ion suppression chromatography）,调节流动相的,pH,值，抑制组分的解离，增加组分在固定相中的溶解度，改善峰形，以达到分离有机弱酸和弱碱的目的。,离子对色谱,（,ion pair chromatography）,将反离子加入流动相中，与呈解离状态的被测物作用，生成脂溶性的中性离子对络合物，从而增加了被测物在非极性固定相中的溶解度，改善分离效果，达到分离目的。,常用反离子有：,季铵盐,用于酸类,烷基磺酸盐,用于碱类,5,离子色谱法,（,ion chromatography,）,离子色谱是由经典的离子交换色谱发展起来的一种液相色谱技术，利用物质在离子交换柱上迁移的差异而达到分离，用于亲水性阴阳离子的测定。根据是否采用抑制柱，可分为,抑制型,离子色谱和,非抑制型,离子色谱。,6,空间排斥色谱（,steric,exclusion,）,也称凝胶色谱，依据被分离组分分子尺寸与凝胶空径大小之间的相对关系而分离，类似于分子筛作用。在一定分子线团尺寸内，分子越大，保留时间越短。,凝胶渗透,以有机溶剂为流动相,凝胶过滤,以水溶液为流动相,对于相同化学组成的高分子化合物，其分子尺寸大小与分子量成正比，因此凝胶色谱可以研究高分子化合物的分子量分布。,7,胶束色谱,(micellar chromatography),表面活性剂在水中超过某一浓度（临界浓度）时，多余的表面活性剂不再溶解，聚集而成胶束（胶粒）。,以胶束分散体系为流动相的,色谱法称为胶束色谱法。它的流动相为胶束多相分散体系，不是真溶液；流动相中不含有机溶剂。,因胶束色谱法的流动相是多相分散体系，在整个色谱体系中又增加了一相，故也被称为假相色谱（,pseudo phase chromatography）,。,8,第二节 高效液相色谱仪,色谱柱,进样阀,流,动,相,检测器,高压泵,脱气装置,10,12,14,15,16,进样阀,17,1,柱,泵,3,2,4,定量圈,进样孔,6,废液,5,废液,Inject,6,柱,泵,3,2,1,4,定量圈,进样孔,废液,5,废液,Load,18,进样注意点,进样阀的废液出口端高度必须与进样针在同一水平位置，以免虹吸作用，使样品向针筒方向回流，或从废液口流出。,使用前后，要用流动相（不含酸碱等缓冲液）或甲醇或水冲洗针孔，用针孔清洗器）。,20,进样方法,整个定量圈体积进样为获得好的精密度，进样量应大于定量圈量的2-5倍以上。由于,层流影响,，需要有过量的样品液来取代管壁上的流动相（见下图）。,Sample,Mobile phase,21,检测器,紫外检测器,可变波长检测器,光电二极管阵列检测器,荧光检测器,电化学检测器,蒸发光散射,示差检测器,质谱,23,色谱图,min,H,光谱图,nm,A,A-曲线,(定性),A-t 曲线 (定量),24,组分的气溶胶,喷雾,蒸发,检测,N,2,光源,溶剂,泵,色谱柱流出物,注意,：流动相必须是挥发性的，不能含缓冲盐，若调节pH可用氨水、醋酸。,26,质谱检测器,27,UV-VIS,DAD,Flu,Refra,Elec,Conduc,other,Ms,检测器使用统计,28,非极性键合相,表面基团为非极性烃基，,如,C,18,、,C,8,等，主要用于,RP,色谱。,C,18,是最常用的非极性键合相，将,十八烷基氯硅烷,与,硅胶,表面的硅醇基经多步反应而成。,R,1,，R,2,=H，Cl，CH,3,1（2，3）：1,30,根据,R,1,、R,2,基团，含碳量可分为高碳、中碳、低碳型键合相：,高碳,R,1,=R,2,=CH,3,载样量大，吸附性能大；,中碳,R,1,=H,Si,O,Si,(H)C,18,H,37,R,2,=,Cl,Si,O,低碳,R,1,=R,2,=,Cl,SiO,SiO,SiO,SiC,18,H,37,31,中等极性键合相,常见的有醚基键合相，这类键合相根据流动相的极性，可作为正相或反相色谱的固定相，应用较少。,极性键合相,可作正相或反相色谱使用,氨基键合相：,硅胶,-,氨丙硅烷基,Si,(CH,2,),3,NH,2,氰基键合相：,硅胶,-,氰乙硅烷基,Si,(CH,2,),2,CN,键合相色谱pH控制在2-8,32,ZORBAX SB-C18,键合相,使用独特的键合方式，用特殊的二异丁基硅烷对硅氧烷键进行保护，防止了极端pH和高温条件下键合相的水解，这些大侧链阻止了键合相的流失，提高了重现性，延长了柱寿命。,新型固定相,注意,：,pH范围0.8-8.0，最高操作温度90，,缓冲液浓度0.01-0.02M，避免使用磷酸盐与碳酸盐,33,ZORBAX Extend-C,18,色谱柱,采用,C-18,二齿结构,并用特有的步骤进行双基封端。,在,pH,高达,11.5,的,条件下，用于分离碱性、酸性、中性化合物，峰形优良，柱寿命长。,34,色谱柱使用注意点,：,pH,范围,2-11.5,。使用有机缓冲液，浓度以,10-50mM,为好。在中高,pH,下避免使用磷酸盐，碳酸盐缓冲液，,最高操作温度,60,，最佳温度,40,。,分离碱性物质，所用流动相,pH,值应高于被测物,pKa,一个单位。,35,柱 pH范围 最高温度,SB C18,90,C8 60,C3 60,苯基 60,腈基 60,XDB 60,Extend-C18,60,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12,ZORBAX RP-HPLC系列柱的使用条件,36,色谱柱使用与保存,所有色谱柱使用缓冲液后必须用柱体积20-30倍的水冲洗色谱柱,色谱柱 柱体积 冲洗体积,150 4.6mm 2.5ml 50ml,200 4.6mm 3.3ml 65ml,250 4.6mm 4.2ml 80ml,37,保存色谱柱时用100%甲醇或乙腈，柱,两端必须用接头密封。,停用数天后最使用时，应先用,低流速甲醇冲洗1h,左右，然后再换上流动相，否则直接用流动相，柱效会下降，峰形不好。,新柱使用前应用甲醇或乙腈冲洗（0.5ml/min）。,38,色谱,柱失效症状,色谱柱压增高,峰变宽，拖尾，裂峰,塔板数下降，选择性下降，分离度降低,保留值减小或增大,色谱柱失效的,原因,进口滤片堵塞,吸附了样品杂质,柱填充不良，使用久，,机械及热冲击造成空洞,固定相遭化学侵蚀,39,原因 压力 拖尾 塔板数 选择性 保留值,堵塞#,空洞#,吸附样品#,化学冲击#,柱凹陷,出现裂峰现象，填料与色谱柱顶端不齐平，可用相同填料填平凹陷处。,压力影响,应避免突然的压力波动与任何的机械与热力冲击，如色谱柱掉在实验台上或骤然改变柱温等。进样过程中转动进样阀太慢引起压力波动，会使色谱峰产生裂隙。,40,柱压升高原因,强保留样品组分,强吸附组分易聚集在柱进口填料上，严重缩短色谱柱寿命。尤其是生物样品提取物、含油成分等。当严重拖尾峰出现时往往是强保留污染物在柱口处聚集的信号。,解决办法,使用,保护柱,可延长分析柱寿命。,每天实验后应用强溶剂（例甲醇,-,水等，至少,20-30,倍柱体积的量）,冲洗色谱柱,。,并,定期进行保养,，以低流速的强溶剂较长时间冲洗色谱柱。,41,样品纯度差,有微小的颗粒堵塞管路。,可用滤膜过滤样品后再进样。,样品,浓度高,连续进样，造成过载。,如果样品吸收度不是太低，使样品浓度在,1mg/ml,以下较适宜。,流动相中缓冲液浓度过高，有机相比例大,在色谱过程中堵塞管路，析出的盐结晶还磨损泵、进样阀密封圈造成漏液。,缓冲液浓度一般控制在,20mmol,以下较适宜，测定完毕后必须及时用水充分冲洗。,42,注意！,一旦柱压升高，应停止测定，用水,冲洗数小时或更长时间，待压力下降后,再测定，如果不清楚堵在哪一段，则应,逐级检查，换泵头上滤芯，保护柱等。,43,柱效低的原因,频繁更换流动相组成,加速柱效降低。,最好一根色谱柱使用的流动相成分和,pH,值相近，如始终在酸性条件下或碱性条件下工作。,色谱柱的选择不合适,或,使用时间久,更换色谱柱（厂家，型号）,进样操作不当,转动进样阀时应一次转到位，不能过慢或停顿，否则易造成裂峰。,44,样品溶剂与流动相成分不匹配,样品溶剂与流动相成分不匹配，造成前沿峰或倒峰。如样品用纯甲醇作溶剂，而流动相中甲醇比例很低，这样易出现前沿峰，改变样品溶剂成分或比例，使醇-水比例接近于流动相。,前沿峰,倒峰,45,结果不能重现,表现为同一样品溶液连续进样所得峰面积相差大，引起这种情况时，可从以下几方面来查找原因：,泵、进样阀、管路漏液,造成峰面积变化。,检测器灵敏度改变,如果同一样品两次进样峰面积相差,10,倍或更大倍数，则最可能的原因是检测器的灵敏度被无意中改变，软件的灵敏度改变不会影响峰面积的积分数值。,46,色谱软件积分方式是否一致,尤其是对于色谱峰较复杂的，积分时基线稍有变化将造成峰面积大的变化，如果两峰不是基线分离，则峰切割方式对峰面积有很大影响，有时候采用峰高较峰面积误差小。,垂直切割,基线切割,47,样品溶液的稳定性,有些样品在流动相条件下不稳定，放置后会产生杂质峰，应注意。,例如有一样品在流动相溶液中不稳定，配制后于不同时间进样，发现在主峰后会产生一杂质峰，该杂峰随时间而迅速增大。,将流动相中缓冲液换成水后，样品测定液放置,15,h,后仍稳定。,48,HPLC 法在药物分析中的应用,鉴别,采用标准品对照法,检查,中国药典规定了5种测定方法,含量测定,中国药典规定了2种定量方法,在进行HPLC测定时，中国药典规定要进行系统适用性试验,49,系统适用性试验,柱效,n=5.54(tR/W,h/2,),2,分离度,R=,拖尾因子,T=,重复性,取对照品或样品溶液，连续进样,5,次，测得峰面积相对标准差,RSD,应小于,2.0%,2(tR,2,-tR,1,),W,1,+W,2,W,0.05h,2d1,(R 1.5),(T=0.951.05),其中分离度和重复性是更具实际意义的参数(ChP.2005),50,定量分析方法,内标法,内标物要求：,样品中不含有的组分。,保留时间与待测物相近，但分离度,R1.5。（,理化性质相近）,有足够的纯度。,51,外标法,-,标准对照法,C,样,=,A,样,/,A,标,C,标,52,日常维护和常见色谱故障,溶剂及样品的准备,过滤溶剂的目的湿防止固体颗粒损伤仪器或柱头；未经过滤的溶剂或者溶剂瓶中生长微生物，都会降低溶剂入口过滤头的寿命，并影响泵的性能，一般要求两天过滤一次。,注意：过滤水相或有机相应该选用不同的滤膜,聚四氟乙烯几乎可以过滤所有的溶剂、酸和碱,尼龙66可以和大多数的有机物、水相容，但是建议不要用于强酸、二氯甲烷和DMF,纤维素滤膜用于水相,53,溶剂脱气的方法,氦气脱气,真空脱气,回流加热脱气,超身脱气（最为常用）,避免使用的溶剂,卤化物碱金属溶液及相应的酸溶液,高浓度的无机酸如硝酸、硫酸,能形成自由基的试剂及其混合物,四氯化碳和异丙醇或THF混合液,含强络合剂的溶液,54,色谱柱的平衡,为了确保分析结果的再现性，对于反相柱应使用510倍柱体积的流动相平衡色谱柱。,注意：新装到系统的色谱柱需要进行初始化。先断开柱子和检测器间的管路，用流动相将色谱柱中的原有流动相或气泡移出色谱柱，然后再将色谱柱和检测器间的管路接好。,55,保护色谱柱,过滤所有的溶剂和样品,使用保护柱,仪器使用完毕，要冲洗整个系统，移走系统中缓冲液,柱子不使用时，两端密封,注意柱子使用的pH范围,不要高压冲洗柱子，不要高温下过长时间的使用硅胶键合相,56,常见色谱故障基线噪音,可能的原因,检测池脏,检测器灯能量下降,由泵引起的脉冲,检测器上的温度效应,检测池中有气泡通过,57,常见色谱故障基线漂移,可能原因,梯度洗脱引起,流动相脏,柱子没平衡,系统中污染物溢出,RID检测器温度不稳定,58,常见色谱故障鬼峰,鬼峰没有进样就有色谱峰出现,原因流动相脏，尤其是水相,常见色谱故障双峰,柱头塌陷或柱床运动,泵头过滤芯部分堵塞,组分共流出,59,常见色谱故障压力过高,可能原因,柱子进口过滤芯被污染,Purge阀过滤芯被污染,色谱柱被污染,连接管路堵塞,进样器旋转密封阀被堵塞,进样针或者针座被堵塞,可用分段法来检查哪一段发生堵塞,60,常见色谱故障压力过低,溶剂进口过滤芯被堵,连接管路泄漏或其他备件泄漏,溶剂或流速的改变,主动阀失灵,四元比例阀失灵,单向出口阀失灵,柱子失效（固定相流失）,61,常见色谱故障压力波动,可能原因,溶剂进口过滤芯堵塞,溶剂未脱气,泵的密封圈老化,出口单向阀失效,主动阀失效,最常见的原因失泵内有七宝,62,