第七章-外源基因在真核细胞中的表达与调控.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,基因工程的基本程序,载体,外源DNA片段,外源DNA插入,剪切,引入宿主细胞,选出含有重组DNA的细胞,a,b,b,A,A,b,重组DNA的扩增或表达,基因重组的,主要目的,是要使目的基因在某一细胞中能得到高效表达，即产生人们所需要的高产目的基因产物，如蛋白质、多肽类生物药物。,基因工程技术的,核心,是,基因表达技术,。,基因表达,是指结构基因在调控序列的作用下转录成mRNA，经加工后在核糖体的协助下又转译出相应的基因产物蛋白质，再在受体细胞环境中经修饰而显示出相应的功能。从基因到有功能的产物这整个转录、转译及所有的加工过程就是基因表达的过程，它是在一系列酶和调控序列的共同作用下完成的。,一、概 述,（一）几个重要的概念,1、表达系统（gene expression system)：,基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括表达载体的构建、受体细胞的建立及表达产物的分离、纯化。,（二）原核表达系统的局限性,1.缺乏翻译后加工修饰系统，不能进行糖基化、甲基化的修饰，影响某些蛋白的活性。,2.在原核细胞中表达的真核蛋白不稳定，易被细菌蛋白酶降解。,3.很难实现真正的分泌出胞，其产量很低，而且容易出现信号肽不被切割，或不在特异位置上切割。,4.表达产物常以包涵体（防止蛋白酶的水解）的形式存在，后期需要经过变性（盐酸胍或尿素）复性（二硫苏糖醇、巯基乙醇等还原剂），并且复性效率低。,5.内毒素的污染,真核基因组结构复杂庞大,:,形成复杂的染色质或者染色体,基因不连续性,:,内含子、外显子,3.,含有大量的重复序列：低度、中度或高度,4.,存在许多基因家族（有一定同源性而又不完全相同的基因簇）：如珠蛋白基因家族、,ras,基因家族等。,5.,没有原核细胞的操纵子，不产生多顺反子,mRNA,:,即,一个编码基因转录生成一个,mRNA,分子，经翻译生成一条多肽链,(,单顺反子,mRNA,）。,6.,基因表达调控复杂,（三）真核基因组结构特点,(a)原核生物mRNA为多顺反子,(b)真核生物mRNA为单顺反子,（四）真核基因表达调控特点,多方面、多层次,1.转录前（基因组水平）调控：基因结构改变，持久且不可逆,2.转录水平调控：,3.转录后修饰：,4.翻译水平的调控：,5.翻译后修饰：,转录前调控,1.基因丢失：,目前认为这种调节方式主要是在较低等的真核生物中。,2.基因扩增：,是指某些基因的拷贝数专一性大量增加的现象。,3.基因重排：,是指某些基因片段改变原来存在的顺序而重新排列组合。,4.甲基化修饰：,DNA甲基化是一种重要的基因组表观遗传修饰，参与调控许多细胞过程，包括胚胎发育、转录、染色质结构、X染色体失活、基因组印迹以及染色体稳定性。,5.染色质结构对基因表达的调控：,细胞分裂时松开分散在核内的染色质称为常染色质，常染色质的基因可以转录。染色体中的某些区段到分裂期后，仍保持紧凑折叠的结构，在间期核中可以看到其浓集的斑块，称为异染色质，基因不能转录表达。,转录水平调控,1.RNA聚合酶:I,II,III,2.顺式调控因子（cis-acting factor),3.反式作用因子（trans-acting factor),酶,主要转录产物,RNA聚合酶,rRNA，大多数snRNA,RNA聚合酶,mRNA前体，部分snRNA,RNA聚合酶,tRNA、部分snRNA,真核细胞中RNA聚合酶的种类,顺式调控因子,顺式调控因子（cis-acting factor)：是与结构基因串连的、对基因转录的精确起始和转录活性具重要调控作用的特定DNA序列。包括正性调控元件（启动子、增强子）和负性调控元件（沉寂子、加尾和转录终止信号）,启动子,启动子（,Promoter,）,:,位于基因的,5,端与基因转录起始有关的核苷酸序列。一般包括转录起始点及其上游,100-200bp,序列,作用特点：近距离作用、具有方向性、空间位置较恒定,分类：,核心启动子元件,（,转录起始点上游,-30bp,区的,TATA-box,）：,决定基因转录精确起始。,上游启动子元件,(,包括：,-70,至,-80bp,区域的,CAAT,盒及其两侧的,GC,盒,):,协同决定转录基础效率。,组织特异性元件,:,如肝细胞特异性启动子元件,HP1,，与白蛋白、,AFP,等基因在肝细胞中的特异性表达有关。,诱导性启动子元件：如,cAMP,反应元件（,CRE,），介导对,cAMP,、生长因子等信号的反应。,启动子结构模式图,SP1,NF1,SP1,TBP,表1哺乳类RNA聚合酶启动子中 常见的元件,元件名称,共 同 序 列,结 合 的 蛋 白 因 子,名称,分子量,DNA长度,TATA,TATAAA,TFIID,30,000,10bp,GC,GGGCGG,SP-1,105,000,20bp,CAAT,GGCCAATCT,CTF/NF1,60,000,22bp,kB,GGGACTTTCC,NFkB,44,000,10bp,ATF,GTGACGT,ATF,?,20bp,Octane,ATTTGCAT,Oct-1,76,000,10bp,增强子,增强子,(Enhancer):,是一类本身不具备启动子活性但能够促进转录活性的顺式调控元件。,构成：由单拷贝或多拷贝组件串连构成，长,100-200bp,，,核心组件,8-12bp,。,作用特点：,远距离作用,无方向性,有启动子依赖性，但对启动子无严格专一性，因而无基因特异性。,组织特异性,相位性,负性调控元件,沉寂子（,silencer),或衰减子,(,dehancer,),：,是一类抑制基因转录的顺式调控元件，作用方式同增强子。,转录终止信号：,加尾信号：,AATAA,polyA,上游,10-20bp,G/T,簇：能形成发夹结构的反向重复序列,反式作用因子,反式作用因子（,Trans-acting factor,）,:,由位于不同或相同染色体上相距较远的基因所编码的蛋白质因子，通过与顺式调控元件和,RNA,聚合酶的相互作用而调节基因转录活性。,转录信号1,P,Trans-acting factor,Trans-acting factor(DNA结合蛋白）,Cis-acting factor,A gene,mRNA of A,Protein A,B gene,mRNA of B,Protein B,反式作用因子可以分为3类：,（1）普通转录因子（通用转录因子）：主要识别启动子的核心启动成分，如TATA盒结合因子TFIID；,（2）组织特异性转录因子：是特殊组织与细胞中的反式作用因子，如淋巴细胞中的Oct-2；,（3）诱导性反式作用因子：与,反应性元件,（response elements）相结合的反式作用因子。,如,HSRE,（热休克反应元件，heat shock response element）,GRE,（糖皮质激素反应元件，glucocorticoid response element）,CRE,（cAMP反应元件，cAMP response element）,反式作用因子的结构,DNA结合域,转录激活域,TF,富含谷氨酰胺结构域,酸性,-螺旋结构域,富含脯氨酸结构域,同源结构域,锌指结构域,亮氨酸拉链,螺旋-环-螺旋,螺旋-转角-螺旋,螺旋转角螺旋,锌指结构,亮氨基拉链,螺旋环螺旋,同源结构域,SP1,OCT-2,AP-1,myc,1、RNA加工成熟：,无论是rRNA、tRNA、mRNA，转录后都必须经过加工，才能成为有功能的分子。,rRNA：前体是45S，成熟的rRNA是18S、28S、5.8S，还要经过化学修饰-核糖甲基化。,tRNA：首先经过核苷的修饰，生成4.5S前体tRNA，再剪接成为成熟的tRNA。,mRNA：5加帽子，3加poly(A)，还要经过剪接以及核苷酸的甲基化修饰。,转录后水平的调控,真核生物的基因可以分为两大类：一类是简单的转录单位；另一类是复杂转录单位。转录后加工方式是不同的。,（1）简单转录单位：编码产生一个多肽，转录后加工有3种形式。,a、基因没有内含子，转录后无需加工，也没有poly(A),如组蛋白基因。,b、没有内含子，无需剪切，但需要加poly(A)尾，如-干扰素基因。,c、有内含子，需要加工，及加poly(A)尾，但它们只产生一个有功能的mRNA，如,-珠蛋白基因,。,2、转录后加工的多样性,初级转录产物可通过不同的方式加工成两个或两个以上的mRNA。,a、利用多个转录起始点或剪接位点产生不同的蛋白质。,b、利用多个加多聚（A）位点和不同的剪切方式产生不同的蛋白质。,c、虽无剪接，但有多个转录起始位点或加poly(A)位点。,（2）复杂转录单位,利用多个转录起始点或剪接位点产生不同的蛋白质,利用多个加多聚（A）位点和不同的剪切方式产生不同的蛋白质,虽无剪接，但有多个转录起始位点或加poly(A)位点,翻译水平的调控,对可溶性蛋白质因子的修饰：如,eIF-2,磷酸化后可抑制蛋白质的合成。,对,mRNA,稳定性的调节,反义,RNA,对翻译的调控作用,反义,RNA(anti,-sense),：一段含有与被调控基因所产生,mRNA,互补的碱基序列的小分子,RNA,。,与,mRNA,结合，形成双链,RNA,。影响,mRNA,的模板效率；可能参与,mRNA,的拼接。,1.多肽的切割：切去前端的信号肽,2.多肽的有限水解：蛋白质（酶原）必须经过有限的酶和化学水解才能变成有活性的物质。,3.多肽的化学修饰：蛋白质磷酸化、糖基化（糖蛋白）、乙酰化。,4.多肽的剪接：多肽被剪接成数个片段，再以一定的顺序结合起来，形成有活性的蛋白质。,翻译后的调控,二、真核表达系统,真核表达系统（Eukaryotic expression system)：指在真核细胞中表达外源基因的体系。,组成：真核表达载体,受体细胞,基因转移方式,（一）真核表达系统的必要性和优势,1.具有转录后加工系统：剪除内含子,2.具有完善的翻译后加工系统：对表达蛋白进行修饰，具有天然构型。,3.可实现分泌表达:将表达产物分泌至细胞外培养液，简化了纯化工艺。,4.有助于深入了解真核基因表达调控机制,实现基因治疗。,（二）真核表达载体,真核表达载体：适用于在真核细胞中表达外源基因的载体。,真核载体根据受体不同，可分为：酵母表达载体、哺乳动物表达载体、昆虫杆状病毒表达载体。,真核表达载体包括在大肠杆菌中起作用的复制起始位点、抗生素抗性基因、多克隆位点等。,真核表达载体中还具有：,真核表达调控元件：包括启动子、增强子、转录终止序列、,poly A 加尾信号等,真核细胞复制起始序列,真核细胞药物抗性基因,真核表达载体带有的,polyA 加尾信号可保证新转录的mRNA能有效地加上poly A。,真核表达载体的基本组成,Ori,Pro,：原核复制起始序列；,P：启动子；MCS：多克隆位点；TT：转录终止序列；,ori,euk,：真核复制起始序列。注：不是所有真核表达载体都有整合序列,PolyA,（三）真核表达系统,1.酵母表达系统：利用酵母表达载体，在酵母细胞中表达外源基因,2.哺乳动物细胞表达系统：利用重组质粒或病毒载体，在哺乳动物细胞内表达外源基因,3.昆虫细胞表达系统：利用昆虫杆状病毒表达载体，在昆虫细胞内表达外源基因,酵母表达系统,特点及优势,酵母菌是单细胞真核生物，其遗传背景清楚,培养简单，生长周期短，经济,生物安全性高,可分泌表达，简化纯化工艺,（一）,酵母载体,在酵母细胞中复制、扩增和表达的载体，包括克隆载体和表达载体。,主要组成元件：,筛选标记：如抗生素抗性基因,-,Zeocin,(,博来霉素,属于争光霉素家族的成员）,营养缺陷标记基因,-,Leu(,异丙基苹果酸脱氢酶,参与丙酮酸向亮氨酸的转化,),Leu-作为酵母载体的选择标记基因,用于酵母载体中的调控序列,ARS,（,Auto Replication Sequence),：自主复制序列，为酵母复制起始区,(,点,),。,2M,质粒：酵母核质中的小的环状,DNA,，可以独立复制并转录。,酵母启动子：常用的有,GAP,（,3,-,磷酸甘油醛脱氢酶）、,AOX1,（,醇氧化酶,-,1,）、,ADH(,乙醇脱氢酶,),、,SUC(,蔗糖酶,),、,PGK(,磷酸甘油酸激酶,),、,Apase,(,碱性磷酸酶,),启动子。,酵母着丝粒区段,(CEN),：增加转化子稳定性。,酵母载体的种类,酵母克隆载体：不含酵母启动子，不能在酵母中表达外源基因，如YIP、YRP、YEP,酵母表达载体：酵母克隆载体+酵母启动子,若引入信号肽序列，则成为分泌型载体,YAC：酵母人工染色体（yeast artificial chromosome)-,可插入,200800kb,的外源基因片段，,因而特别适合高等真核生物基因组的克隆与表达研究。,1.YIp(酵母整合型质粒)：,细菌质粒DNA+酵母遗传标记，通过同源重组整合入酵母染色体，转化子稳定，但转化率极低。,2.YRp(酵母复制型质粒)：,细菌质粒DNA+酵母遗传标记(YIp)+酵母复制序列(ARS),可自主复制，但稳定性差。,3.YEp(酵母附加子型质粒)：,细菌质粒DNA+酵母标记基因(YIp)+酵母2,M,质粒，游离于核外存在并自主复制。,I.,酵母克隆载体,酵母克隆载体的构建,II.酵母表达载体,含酵母启动子,穿梭载体,(shuttle vector),：既可以携带外源基因在原核细胞中复制增殖,，,又可以在真核细胞中表达外源基因的载体。,种类：,酿酒酵母表达载体,毕赤酵母表达载体,分泌型表达载体：引入酵母的信号肽基因，如,因子信号肽,酿酒酵母表达载体,Leu2编码异丙基苹果酸脱氢酶，作为筛选标记。,带有此质粒的酵母菌在不含有亮氨酸的培养基中能生长。,毕赤酵母表达载体-整合型,HIS4编码组,氨醇脱氢酶基因，作为筛选标记,。,HIS4区的整合方式为位点特异性单交换引起的基因插入，整合后使营养缺陷型宿主恢复野生型，在不含组氨酸的培养基上能生长。,5AOX1,启动子片段含有,AOX1,启动子，在甲醇的诱导下可启动外源蛋白的表达；,-,因子信号肽序列为约,89,个氨基酸的信号肽序列，能使外源蛋白分泌到发酵上清中，更利于外源蛋白的纯化；,多克隆位点含多个酶切位点，为外源基因的插入提供位点；,TT,序列提供有效的转录终止和,polyA,修饰信号；,HIS4,为营养缺陷型筛选标志；,3AOX1,基因片段能够与基因组,AOX1,基因属同源重组；,抗,Amp,基因和,pBR322,能使空载体和构建的表达载体在,E.coli,中筛选和复制。,以应用于毕赤酵母表达系统的pPIC9载体为例解释载体的构件,毕赤酵母分泌型表达载体,启动外源基因的启动子：P,GAP,P,TEF1,P,EMT，,MCS：多克隆位点,鉴定的标记：6,His，myc.终止子：AOX1TT，CYC1TT,抗生素筛选标记：zeocin.复制起始位点：pUC ori,III.酵母人工染色体（YAC）,YAC:利用酵母的着丝粒序列（CEN）、酵母复制起始区（ARS）及 端粒重复序列（TEL）构建的人工染色体,结构：,左臂：TEL、选择标记、ARS、CEN,右臂：TEL、选择标记,特点：容量大（200-800kb），稳定性差,作用：构建基因组文库,YAC,载体,中最常用的是 pYAC4,筛选标记:,His3:组氨酸合成缺陷性标记,URA3:尿嘧啶合成缺陷性标记,SUP4:,赭石突变,(ade 2-1)抑制基因 sup4,（二）受体细胞,1、酿酒酵母：,它具有作为宿主菌必须具备的许多条件，是最早应用于外源基因克隆和表达的酵母菌。,目前已表达了诸如乙型肝炎疫苗、人胰岛素、人粒细胞集落刺激因子等多种外源基因产物。其缺点是在发酵过程中会产生乙醇，影响酵母的生长代谢和基因产物的表达。,此外，酿酒酵母在蛋白质的加工过程中会发生过度糖基化作用，其分泌表达能力也有待提高。,表1-3 在酿酒酵母中表达的重组蛋白,种 类,名 称,疫苗,乙肝病毒表面抗原，疟原虫环子孢子蛋白，HIV1外壳蛋白,诊断试剂,丙肝病毒蛋白，HIV1抗原,人类治疗用蛋白药物,上皮生长因子，胰岛素，类胰岛素生长因子，血小板源生长因子，胰岛素前体，成纤细胞生长因子，集落刺激因子，1抗胰蛋白酶，凝血因子Xa,2、毕赤酵母：新发展的酵母受体细胞,高表达（12mg/L）：AOX1启动子或GAP启动子,高稳定性：载体为整合型,高分泌（10mg/L）：,因子信号肽基因,在毕赤酵母中得到表达的重组异源蛋白有乙型肝炎表面抗原、人肿瘤坏死因子、人表皮生长因子、链激酶等几十种。毕赤酵母的分泌表达能力比酿酒酵母强，但对其遗传背景了解还比较少，且发酵周期也比较长。,（三）转化,锂盐法；PEG法；,原生质球法；电穿孔法。,电穿孔法：效率较高,应用最广,整合型载体转化前要酶切线性化,（四）外源基因在酵母菌中的表达,1、胞内表达：直接表达外源基因,2、分泌表达：在MCS前加入信号肽序列,pGAPZ,利用因子分泌表达,人,Endostatin,基因的克隆、表达,中国人胎肝,总RNA,Endostatin cDNA,pGEM-T载体,T-A克隆,RT-PCR,重组endostatin克隆载体,pGAPZaA载体,重组endostatin表达载体,电转化,GS115毕赤酵母菌,Zeocin,SDS-PAGE,阳性重组子,重组Endostatin的初步纯化与抑制作用研究,阳性重组子,大量扩增、表达endostatin蛋白,培养上清,超滤浓缩,Sepharose,G25去盐,Heparin亲和层析,初步纯化的重组endostatin蛋白,浓缩液,透析,抑制作用研究,体外作用,ECV304,细胞,HepG2.2.15细胞,体内作用,裸鼠人肝癌模型,兔角膜新生血管,（五）高表达的策略,1.利用诱导型强启动子,2.提高整合拷贝数,3.控制蛋白酶降解活性,4.分泌表达,（六）缺 点,不能实现全部的翻译后修饰功能,哺乳动物细胞表达系统,优 点,进行完全的翻译后修饰,可表达产生有功能的膜蛋白,用途：表达大量的外源蛋白,研究基因的功能,基因治疗,有效选择转化细胞，要求载体具备明显的标记基因,（一）几种常用的哺乳动物表达系统的选择标记基因,1、胸苷激酶(tk)基因,2、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因,3、新霉素抗性基因(neo)、,4、氯霉素乙酰转移酶基因检测系统,5、,黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶（,XGPRT,）基因,1、胸苷激酶（tk）基因,胸腺嘧啶核苷激酶简称胸苷激酶（thymidine Kinase,TK）在所有真核细胞中都有表达,是嘧啶生物合成补救代谢途径中的一个关键酶,它可催化胸苷磷酸化转变成为dTMP,继续磷酸化生成dTTP,参与DNA的生物合成。,tk+细胞中：胸苷(,T,)胸苷-磷酸TTP,二氢叶酸,二氢叶酸还原酶,四氢叶酸,TTP,dCTP,dATP,氨基喋呤(Aminopterin),tk,阻断,补加次黄嘌呤（,H,）,死亡,存活,补救合成,胸苷激酶(tk)基因-HAT选择法原理,携带外源基因的载体连接有tk基因，可以表达胸苷激酶,以tk细胞为受体细胞,在HAT（,次黄嘌呤氨基喋呤,胸苷）选择培养基中，只有外源基因转化成功的tk+细胞存活，tk-细胞死亡,则阳性重组子在HAT中筛选出来,2、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因,二氢叶酸,二氢叶酸还原酶,四氢叶酸,TTP,dCTP,dATP,氨基蝶呤,氨甲喋呤,阻断,二氢叶酸还原,酶基因筛选法原理,携带外源基因的载体连接有,dhfr,基因，可以表达,二氢叶酸还原,酶,以dhfr-细胞为受体：CHO细胞,dhfr-细胞无法在普通培养基中存活，而转化入dhfr基因后可以存活，并表达外源基因。,若在培养基内加入氨甲蝶呤，进行加压筛选，可以提高外源基因表达量。,3、新霉素抗性基因(neo),新霉素的类似物G418（gentamycin）对原核、真核细胞均有毒性。,携带外源基因的载体连接有neo基因，neo编码的磷酸转移酶可灭活G418，因而，只有转化入neo基因的细胞才能够在含有G418的培养基中存活。,此种筛选方法要求载体携带neo基因，而对受体细胞无要求，应用更为简便。,4、,氯霉素乙酰转移酶基因检测系统,氯霉素乙酰转移酶（Cat）是由大肠杆菌转座子Tn9编码的。,Cat可催化氯霉素发生乙酰化作用，使其实去活性。,虽然真核细胞不含有内源性的Cat酶活性，但真核细胞的启动子可引发外源性Cat基因的表达。,以Cat基因作为选择标记的原理,将带有Cat基因的质粒载体转化到哺乳动物细胞后，就会合成Cat。,哺乳动物细胞本身不能合成Cat，所以只要在转化的细胞中检测到Cat的活性，即可肯定它是来自外源的Cat质粒。,特别适用于瞬时表达的研究。,5、,黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶（XGPRT）基因,XGPRT是由大肠杆菌Ecogpt基因编码的一种核苷酸代谢酶，哺乳动物细胞无XGPRT酶，不能利用黄嘌呤形成黄嘌呤核苷酸（XMP），但有鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT），可催化黄嘌呤形成次黄嘌呤核苷酸（IMP）。,哺乳动物细胞可通过IMP生成GMP。当用IMP脱氢酶抑制剂霉酚酸，抑制了GMP的合成，使细胞失去合成DNA能力而死亡。,黄嘌呤-鸟嘌呤转移酶（XGPRT）基因筛选法原理,将含XGPRT基因的重组体导入真核细胞后，在转化细胞中就能表达XGPRT酶，可在含有黄嘌呤的培养基中通过XMP中间体补救合成GMP，使DNA合成正常进行。,加入霉酚酸后，阳性克隆因不受霉酚酸的抑制而存活，而未转化的阴性细胞则受霉酚酸的抑制而死亡，以此可用来筛选阳性细胞。,（二）外源基因导入哺乳动物 细胞的载体,质粒型(非病毒型)载体,病毒型载体,启动子,：,病毒来源的：,SV40,、,CMV,、,RSV,细胞来源的：,HSP,、,MCK,（肌酸激酶）,增强子,:,来源于,SV40,、,RSV,、,CMV,（在不同种属细胞中都有极强的促进转录能力）,筛选标记,原核序列：复制子及筛选标记,真核复制起始点：提高外源基因表达水平,转录终止信号和多聚腺苷酸化信号,哺乳动物细胞表达载体的主要元件,1.质粒型载体,由真核复制信号、启动子、转录单位及质粒片段组成,不需要包装细胞。,如：pcDNA3、pVAX1、pEGFP-N1等。,BGH：Bovine Growth Hormone,pVAX1的特点,不仅具有在大肠杆菌中高拷贝复制和在多数哺乳类动物细胞中高效表达蛋白的特点,而且pVAX1 具有卡那霉素抗性,在人体内产生变应反应者较少。,pVAX1是由美国食品和药品管理委员会（FDA）推荐的唯一可以应用于人体实验的载体质粒。迄今为止，关于pVAX1的研究已涉及动物和临床试验。,pEGFP-N1载体具有以下几方面特点：,从结构上看，该质粒具有很强的复制能力，可以满足随宿主细胞分裂时跟随胞质遗传给新生的子细胞，这是保证目的基因稳定表达的因素之一；含有高效的功能强大的启动子SV40和PCMV，可以使目的基因在增殖的细胞中稳定表达；具有多克隆位点，便于目的基因的插入；该载体具有neo基因，可以采用G418来筛选已成功转染了该载体的靶细胞。这些特殊的结构可以实现目的基因在靶细胞内的稳定表达。,GFP的相关知识：,绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein，GFP)基因来源于Jellyfish Aequorea Victoria，是Shimomura等于1962年发现的蛋白质，由238个氨基酸组成，分子量约为27Kd。GFP在包括热、极端PH和化学变性剂等苛刻条件下都很稳定，用甲醛固定后会持续发出荧光，但在还原环境下荧光会很快熄灭。,与以往常用的报告基因相比，GFP具有以下优点：,在荧光显微镜下，用波长约490 nm的紫外线激发后，即可观察到绿色荧光，直接、简捷、便于检测；无需任何的作用底物或共作用物,检测的灵敏度不受反应效率的影响，保证了极高的检出率；蛋白本身性质稳定；可在多种异源生物中表达且无细胞毒性；其基因片段长度较小(约717 bp)，易于构建融合蛋白，且融合蛋白仍能保持荧光激发活性，为研究其他基因表达产物的分布提供了方便。,EGFP是一种优化的突变型GFP，使其产生的荧光较普通GFP强35倍，大大增强了其报告基因的敏感度。,EGFP与其他蛋白的融合表达已有很多成功的例子，而且其N及C端均可融合，并不影响其发光,。,2.病毒型载体,外源DNA插入病毒DNA或取代病毒基因某一片段，重组DNA随病毒颗粒而复制(多需辅助病毒或包装细胞的存在)。,如：逆转录病毒载体、腺病毒载体等,病毒型载体的类型,整合型,整合入宿主染色体，随染色体复制而复制,可持续表达外源基因,安全性低：插入诱变,SV40载体，逆转录病毒载体，慢病毒载体，,腺相关病毒载体,游离型,不整合,生物安全性高,瞬时表达,腺病毒载体，痘苗病毒载体,SV40(猴空泡病毒40)载体,dsDNA,病毒，基因组约,5.2kb,基因结构清楚,含有整套基因表达调控序列,早期区：,T,、,t,抗原（肿瘤蛋白质或抗原）,T,抗原是细胞转化的启动所必须的。,t,抗原,对于细胞的转化不是必需的，但可起加强作用。,晚期区：产生病毒衣壳蛋白（,VP1,，,VP2,及,VP3),，包装病毒颗粒所必需,复制起始位点：早、晚区基因之间,特 点,载体构建：早期取代 晚期取代,天然SV40载体宿主范围窄，容量小（2.5kb）,易形成野生型病毒,溶源生长：导致宿主细胞裂解死亡,故较少使用，做瞬时转染用（转化COS细胞），或利用其调控元件。,pSV系列-由SV40派生的一系列质粒型载体,逆转录病毒载体(RV),基因组结构：ssRNA(9.2kb),LTR,gag pol env,LTR,LTR,（,long terminal repeat,）,:,长末端重复序列,含启动子和,poly A,信号,介导病毒整合。,包装信号：是包装病毒颗粒时所必须的非编码序列。,结构蛋白：核心蛋白,(gag),、逆转录酶（,pol,),、衣壳蛋白,(,env,),。,逆转录病毒穿梭载体-pLXSN,MCS,载体元件：,LTR,、,标记基因及质粒部分组成,逆转录病毒载体系统包括：,一个含有目的基因的表达载体；,一个编码,VSV-G,（疱疹性口腔炎病毒糖蛋白,G,，是一种包膜蛋白，具有广泛的宿主范围）的辅助质粒；,表达,gag/,pol,的辅助质粒；,293T,（人胚肾细胞）包装细胞。,优点：,宿主范围广，能感染多种动物和人类的不同类型的细胞而无严格的组织特异性；,逆转录病毒载体能够高效地感染分裂的宿主细胞，感染细胞后能够将载体基因组稳定整合到宿主基因组的随机位点上，使目的基因长期稳定表达。,逆转录病毒的免疫原性较低。,缺点：,只能感染分裂细胞，而不能感染非分裂细胞；,能够插人的外源基因较小,(7,8kb),，难以满足较大基因的转移；,载体,DNA,整合人宿主染色体是随机的，并因随机整合使原癌基因激活或抑癌基因失活，从而具有引发癌症的风险；,目的基因,RV穿梭载体,包装细胞系,重组RV载体,Ecoli,大量扩增病毒,载体DNA,重组逆转录病毒颗粒,受体细胞,表达蛋白，研究宿主细胞性状,克隆,共转染,感染,转化,辅助质粒,筛选、扩增,慢病毒载体,（,lentivirus,）,属逆转录病毒亚属，是一类非鼠源性逆转录病毒，以人类免疫缺陷病毒（HIV）为代表。,慢病毒源性载体,（,lentivirus-based vector，LV,）,：能将外源基因整合入非分裂细胞的基因组内。,无明显免疫反应，长期的转基因表达。,具有严格的宿主范围、滴度低及HIV-1独特的致病性，限制了它作为转基因载体的应用。,主要应用于转染神经元，效果好于腺相关病毒载体和逆转录病毒载体。,腺相关病毒载体（AAV）,腺相关病毒：,Adeno-Associated Virus，AAV,线状单链,DNA,病毒,，4.7kb，,缺陷型非病原性人类细小病毒，,只有与腺病毒、单纯疱疹病毒等共感染时才能进行有效复制。,感染细胞范围广，可感染分裂期与分裂后期细胞,野生型病毒可定点整合,人类19 号染色体长臂，基因表达稳定;,缺点,外源基因插入容量小（5kb以下）,感染效率比逆转录病毒低,制备滴度低,存在一定的免疫反应,主要应用于转染骨骼肌、视网膜、肝细胞、神经元细胞等,腺病毒（Ad）载体,基因结构：,dsDNA,线性，,36kb,E1A,E1B,L1,E3,E2A,E2B,E4,：包装信号,E1E4:结构蛋白,载体构建：取代结构基因,特点：安全性高(人为自然宿主，不整合),滴度高（10,11,pfu/ml）,容量大（-36kb),可感染非分裂细胞,可直接体内应用，原位感染组织,是目前基因治疗的最常用载体,缺点：免疫原性高，表达时间短,无组织特异性,真核细胞内筛选复杂，费时,AdEasy-1 system,AdEasy-1 system,具有以下优点：,1.效率高：可以感染分裂期与静止期细胞,2.筛选方便：带有目的基因的穿梭载体与病毒骨架质粒的同源重组发生于原核细胞（如细菌）内。,3.生物安全性高：不整合,4.插入容量大,AdEasy-1 system,包括：,腺病毒穿梭载体：可连接外源基因,骨架质粒：含有腺病毒大部分结构基因的质粒，pAdEasy-1,受体细胞：E.coli BJ5183,包装细胞：转入E1或E4基因区的HEK293（人胚肾细胞）或911细胞（人胚视网膜细胞）,穿梭载体,痘苗病毒载体,容量大,安全性好：长期用作预防天花的疫苗,可用来构建多价疫苗,常用的病毒载体的特点：,（三）受体细胞,1、CHO细胞（中国仓鼠卵巢癌细胞）,-可稳定表达外源基因，并可大规模生产药物、抗体及诊断试剂，被美国FDA确认为基因工程受体细胞。,2、COS细胞（猴肾细胞系）,-能瞬时大量表达外源蛋白，是进行外源基因瞬时表达时用途最广的宿主细胞。,3、其他细胞：如肿瘤细胞Hela(人宫颈癌细胞）等。,（四）重组载体导入细胞的方法,1.,病毒感染：借用病毒的感染方式，将外源基因事先插入到病毒的基因组中，并用适当的方式包装成有感染活性的重组病毒颗粒，用于感染细胞，从而将外源病毒导入到相应的细胞中。,常用：逆转录病毒；腺病毒；疱疹病毒等。,优点：整和效率高,可使外源基因在宿主细胞中长期表达,适用于难以转染的原代细胞。,缺点：重组病毒建立有一定难度；存在潜在的安全危险性。,目的基因,AdV穿梭载体,包装细胞HEK293,重组AdV载体,Ecoli,BJ5183,同源重组阳性的腺病毒基因组载体DNA,重组rAd病毒颗粒,受体细胞,表达蛋白，研究宿主细胞性状,克隆,转染,感染,骨架质粒共转染,转化,Ecoli,扩增,转化Ecoli扩增,图1：复制缺陷型重组腺病毒载体制备原理图,图2 辅助病毒依赖型腺病毒载体制备示意图,2.转染：外源DNA导入到细胞中的非病毒方法，通常称为转染。分化学方法和物理方法。,理想的转染方法：操作简单、高效、低毒、对细胞正常生理状况影响小、重复性好、成本低。,磷酸钙共沉淀法,阳离子脂质体转染,受体介导的基因转移,电穿孔,显微注射,基因枪,A typical mammalian expression vector for high-level protein expression,磷酸钙共沉淀法,磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面结合,氯化钙+DNA+磷酸缓冲液按一定的比例混和,形成极小的磷酸钙-DNA复合物沉淀黏附在细胞膜表面,借助内吞作用进入细胞质。沉淀颗粒的大小和质量对于转染的成功至关重要。,磷酸钙共沉淀法的优缺点,优点：能用于任何,DNA,导入哺乳类动物,瞬时转染和稳定转染。,缺点：,转染效率低：进入细胞的,DNA,只有可以进入细胞核,其中只有不到的,DNA,可以与细胞,DNA,整合,在细胞中进行稳定表达。,重复性不佳：,pH,值、钙离子浓度、,DNA,浓度、沉淀反应时间、细胞孵育时间乃至各组分加入顺序和混合的方式都可能对结果产生影响。,脂质体介导基因转移法,中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA,借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。,带正电的阳离子脂质体,DNA并没有预先包埋在脂质体中,而是带负电 的DNA自动结合到带正电的脂质体上,形成DNA-阳离子脂质体复合物,从而吸附到带负电的细胞膜表面,经过内吞被导入细胞。,脂质体介导方法的优缺点,优点：,适用于把转染入悬浮或贴壁培养细胞,可用于瞬时转染和稳定转染；,转染效率高,比磷酸钙法高,5-100,倍；,能够把和转染到各种细胞,转染的稳定性好,可重复性高,转染时最好不加血清和,抗生素,。,缺点：阳离子脂质体,细胞毒性,相对较高,对部分细胞可能会干扰细胞的代谢。,受体介导的基因转移,配体寡肽,E5-,针对细胞表面受体（IGFRI，II）,HA20-,流感病毒血凝素功能域20肽，作为内吞小体释放寡肽,多聚阳离子多肽 PCP-多聚赖氨酸（PL）,携带外源基因的质粒DNA,质粒DNA,E5-PCP-PL,HA20-PCP-PL,HA20,：,破坏溶酶体膜,E5,：,特异性导入肝癌 细胞,吞噬溶酶体,电穿孔介导基因转移法,靠脉冲电流在,细胞,膜上打孔而将,核酸,导入细胞.,电穿孔法的优缺点,优点：转染效率较高,缺点：需要昂贵的仪器（电穿孔仪）；对细胞的损伤较大,每次转染需要更多的细胞和DNA；每种细胞电转的条件都需要进行多次优化.,其它方法,显微注射：借助显微注射器直接把,DNA,注入核内,使之整合入受体细胞,基因组,中,.,优点：转染效率高,可用于瞬时转染和稳定转染。,缺点：导入,DNA,时需要一个细胞一个细胞注射,不适合大量转染。,基因枪：依赖携带了核酸的高速粒子将核酸导入细胞内,.,基因体内治疗方法,ex vivo,途径：即体外细胞介导法，通过移植携带靶基因的工程细胞完成目的基因转移，是基因转移技术和脑内移植技术的结合。特点：经典、安全，效果较易控制，但是存在操作步骤多、技术复杂、难度大及若采用人类胚胎细胞则涉及伦理学问题。,in vivo,途径：即体内直接转染法，是体内基因治疗的直接途径，,操作简便、易推广，但方法尚不成熟、未能解决疗效短、免疫和安全问题。,包括非病毒介导途径与病毒载体介导途径。,目的基因,靶细胞,体外扩增,工程细胞或,基因修饰的细胞,筛选鉴定,脑内靶区,Minipump,分泌营养因子，神经递质，酶,移 植,基因的体内直接转移方法,非病毒类载体介导途径：通过物理法、化学法或融合法直接将目的基因导入体内。,1）裸DNA,2）脂质体(,Liposome,)介导：,Lipid/DNA complex,3）,基因枪：,基因枪是一种专门用于基因转移的高压枪,可以把平均直径约为,4 m,的钨等金属粒子射入细胞中,若将目的,DNA,附着在金属粒子表面,就可以实现基因的直接转移。,4,）电转移法：,体内电转移是适用于向各种组织和器官转运基因的一种物理方法,而且成本低、最易实现、安全性高,其效率还可通过改善靶组织的生物扰动性、质粒DNA的结构和编码蛋白的设计来提高。,病毒类载体介导途径：,将无复制能力含外源基因的重组病毒直接应用于患者体内,。,虽然病毒载体作为基因传递的工具已广泛采用,但病毒性载体仍存在着不少的局限性:如均可诱导机体产生某种程度的免疫反应,具有插入突变致瘤、致毒的风险,载体的容量有限,制备滴度不高等。,瞬时转染：外源基因导入到哺乳动物细胞后14天，就可以检测到基因的表达情况。表达完全由导入的质粒来执行，绝大多数质粒没有整合到染色体上而被降解或随细胞分裂而丢失。,永久转染：导入的基因整合到细胞的染色体DNA中。,（五）外源基因在哺乳动物细胞中的表达方式,（六）哺乳动物细胞表达系统的缺点,需要组织培养,筛选时间长,价格昂贵,昆虫细胞表达系统,优 点,具有真核细胞的翻译后修饰功能；,正确的蛋白折叠、二硫键形成，使重组蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白；,高表达量，最高表达量可达昆虫细胞蛋白总量的50%；,可表达非常大的外源性基因（200kD）；,具有在同一个感染昆虫细胞内同时表达多个基因的能力；,对脊椎动物是安全的。,(一)昆虫杆状病毒载体,1、昆虫杆状病毒,许