高二生物选修四基因工程PPT文档.ppt

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,高二生物选修四基因工程课件,（优选）高二生物选修四基因工程课件,真核细胞的基因结构,编码区,非编码区,非编码区,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子,外显子,与,RNA,聚合酶结合位点,编码区,：,非编码区：,外显子：,内含子：,能编码蛋白质的序列,不能编码蛋白质的序列,2025/10/23 周四,3,非编码区,非编码区,编码区,RNA,聚合酶结合位点,外显子,内含子,终止子,启动子,原核,真核,基因的结构,2025/10/23 周四,4,原核细胞,真核细胞,不同点,编码区是,_,的,编码区是间隔的、,_,的,相同点,都由能够编码蛋白质的,_,和具有调控作用的,_,区组成的,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,2025/10/23 周四,5,山西省孝义市第二中学,基因工程的基本操作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,操作过程,目的基因的检测与鉴定,2025/10/23 周四,6,目的基因主要是指,_,编码蛋白质的基因,目的基因的获取,供体生物细胞,取出,DNA,用限制酶剪去多余部分,目的基因,即：将需要的基因从供体生物细胞内提取出来,目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因,（抗病毒、抗细菌,),、,人胰岛素基因等。也可以是一些具有调控作用的因子,2025/10/23 周四,7,获得目的基因的方法,从基因文库中获取目的基因,1.什么是基因文库？,2.怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？,种类：,基因组文库：,部分基因文库：(如cDNA文库),基因的核苷酸序列等,含有一种生物的,全部,基因,含有一种生物的,部分,基因,根据基因的有关信息：如基因的转录产物,mRNA,2.,基因文库的构建方法,鸟枪法：,供体细胞中的,DNA,许多,DNA,片段,运载体,限制酶,与载体连接,载入,受体细胞,产生特定性状,导入,外源,DNA,扩增,目的基因,分离,(,直接分离法,),(,一,),从基因文库中获取目的基因,（一）基因文库的构建,（每个受体菌含有一段不同的,DNA,片段）,（,2,）,cDNA,文库的构建,mRNA,反转录形成,与载体连接,导入受体菌群,mRNA,逆转录酶,杂交双链,核酸酶,H,单链,DNA,DNA,聚合酶,双链,DNA,(,cDNA,),该生物,cDNA,文库,1,、概念：,PCR,全称为,_,，是一项,在生物,_,复制,_,的核酸合成技术,通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因,因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外,DNA,扩增技术。,聚合酶链式反应,体外,特定,DNA,片段,2,、原理：,DNA,复制,（二）利用,PCR,技术扩增目的基因,四种脱氧核苷酸,(dNTP),一对引物：,热稳定,DNA,聚合酶,(Taq,酶）,模板,DNA(,需含有目的基因,),4,、条件：,一对寡核苷酸序列：与目的基因的起始段互补,一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物,3,、前提：,温度控制,PCR,技术扩增过程,a,、,DNA,变性（,90-95,）：双链,DNA,模板,在热作用下，,断裂，形成,_,b,、复性（,55-60,）：系统温度降低，引物,与,DNA,模板结合，形成局部,_,。,c,、延伸（,70-75,）：在,TaqDNA,聚合酶的作用下，从引物的,_,延伸，合成与模板互补的,_,。,氢键,单链,DNA,双链,DNA,链,5,端,3,端,（三）通过,DNA,合成仪用化学方法人工合成,DNA,合成仪,蛋白质的氨基酸顺序,mRAN,核苷酸序列,基因,DNA,的核苷酸序列,目的,基因,推测,推测,合成,当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。,DNA,合成仪,1.用一定的_切割,质粒，使其出现一个切,口，露出_。,2.用_切断目,的基因，使其产生_,_。,核心,3.将切下的目的基因片段插入质粒的_处，,再加入适量_，形成了一个重组,DNA分子（重组质粒）,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA,连接酶,相同,(,二,),基因表达载体的构建,2025/10/23 周四,15,质粒,DNA,分子,限制酶处理,一个切口,两个黏性末端,两个切口,获得目的基因,DNA,连接酶,重组,DNA,分子（重组质粒）,核心,同一种,(,二,),基因表达载体的构建,4.,过程,:,2025/10/23 周四,16,科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。,起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。,然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子,(,抗虫基因首端,),，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子,(,抗虫基因末端,),，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。,资 料,:,基因表达载体的组成：,目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。,a,、目的基因,b,、启动子,c,、终止子,d,、标记基因,2025/10/23 周四,18,2,、基因表达载体的组成：,复制原点,+,目的基因,+,启动子,+,终止子,+,标记基因,它们各自的作用是什么,?,启动子：位于基因的首端的一段特殊的,DNA,片断，它是,RNA,聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出,mRNA,，最终获得蛋白质,终止子：位于基因的尾端的一段特殊的,DNA,片断，能终止,mRNA,的转录,标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将有目的基因的细胞筛选出来,载体与表达载体的区别：二者都有标记基因和复制原点两部分,DNA,片段。表达载体在载体基础上增加了目的基因、启动子、终止子三部分结构,用到的工具酶：既用到限制酶切割载体，又用到,DNA,连接酶将目的基因和载体拼接，两种酶作用的化学键都是磷酸二酯键,启动子、终止子对于目的基因表达必不可少,目的基因不能单独进入受体细胞，必需以表达载体的方式携带进去。,注意,三、将目的基因导入受体细胞,（一）转化：,（二）方法,将目的基因导入,植物细胞,将目的基因导入,动物细胞,将目的基因导入,微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入,_,内，并且在 受体细胞内维持,_,和,_,的过程,受体细胞,稳定,表达,1,、将目的基因导入植物细胞的方法：,（,1,）,农杆菌转化法,农杆菌特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：,Ti,质粒上的,T-DNA,可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的,DNA,上。,过程：,优点,（,2,）,基因枪法,（,3,）,花粉管通道法,2,、将目的基因导入动物细胞,方法：显微注射法,程序：,目的基因表达载体提纯 取卵（受精卵）显微注射 受精卵 新性状动物,3,、将目的基因导入微生物细胞,原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少,方法：,用,Ca,2+,处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收,DNA,分子,高二生物血红蛋白的提取和分离,（优选）高二生物血红蛋白的提取和分离,课题背景,为年老多病的人注射丙种,球蛋白，可以在一定程度上增强,其身体的抵抗力。在动物体内，,丙种球蛋白和许多蛋白质混合,在一起。要获得纯净的丙种球蛋,白制品，就必须进行提取和分离。,电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现了样品中各种分子的分离。,基础自主梳理,一、凝胶色谱法,1,依据,2,概念,3,原理,4,结合,P64,下面和,P65,上面，画出分离方法的表格,5,注意事项,二、缓冲溶液,1,作用,2,配制,3,意义,三、电泳,1,概念,2,原理,3,作用过程,4,方法,核心要点突破,要点一,解读实验原理,1,蛋白质分子在凝胶中的运动情况分析,相对分子质量大,相对分子质量小,直径大小,大于凝胶颗粒空隙直径,小于凝胶颗粒空隙直径,运动方式,垂直向下运动,无规则的扩散运动,运动速度,较快,较慢,运动路程,较短,较长,洗脱次序,先从凝胶柱中洗脱出来,后从凝柱中洗脱出来,要点二,四、实验操作,原则：依据每一种蛋白质的来源和性质,血液、红细胞、血红蛋白的组成,1,样品处理：,(1),红细胞的洗涤,-,离心去除血清,(2),血红蛋白的释放,-,蒸馏水涨破,(3),分离血红蛋白溶液,-,离心处理,思考感悟,1,洗涤红细胞时为什么不能用蒸馏水代替生理盐水？,【,提示,】,生理盐水能保持红细胞的渗透压稳定而不至于破裂。在未洗净血浆中的杂质蛋白前，红细胞如果提前破裂，就可能使血红蛋白与杂质血浆蛋白混在一起，加大了分离的难度。,思考感悟,2,在血红蛋白释放过程中，加入蒸馏水和甲苯的目的是什么？,【,提示,】,(1),加入蒸馏水使红细胞吸水涨破。,(2),甲苯的作用主要是溶解细胞膜。,细胞膜的主要成分为磷脂，易溶于甲苯等有机溶剂，加入甲苯能加速红细胞破裂并释放出血红蛋白。,2,粗分离：即透析,(1),方法,(2),目的：将样品中相对分子质量较小的杂质除去。,(3),原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。,3,纯化：通过凝胶色谱柱将相对分子质量较大的杂质蛋白除去。操作如下：,(1),凝胶色谱柱的制作,取长,40 cm,，内径为,1.6 cm,的玻璃管，两端需用砂纸磨平。,底塞的制作：打孔,挖出凹穴,安装移液管头部,覆盖尼龙网，再用,100,目尼龙纱包好。,顶塞的制作：打孔,安装玻璃管。,组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。,安装其他附属结构。,特别提醒,底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。,(2),凝胶色谱柱的装填,(,本实验使用的凝胶是交联葡聚糖凝胶,),固定：将色谱柱垂直固定在支架上,装填：将凝胶悬浮液一次性装填入色谱柱内,洗涤：用磷酸缓冲液充分洗涤平衡凝胶,12 h,注意事项,:,不能有气泡存在；不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒的现象。,(3),样品的加入和洗脱,a.,准备：加样前，打开流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与,_,平齐，关闭出口。,b,加样：用吸管小心地将,1 mL,透析后的样品加到色谱柱的顶端，注意不要破坏凝胶面。,c,加样后：打开下端出口，使样品渗入凝胶床内,.,洗脱：加入,_,，打开下端出口，进行洗脱。,凝胶面,磷酸缓冲液,特别提醒,(1),滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。,(2),在蛋白质分离过程中，仔细观察红色区带在洗脱过程中的移动情况。如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功。,4,纯度鉴定：判断纯化的蛋白质是否达到要求。在鉴定的方法中，使用最多的是,SDS,聚丙烯酰胺凝胶电泳。,五、操作提示,1,红细胞的洗涤,2,色谱柱填料的处理,3,凝胶色谱柱的装填,4,蛋白质的分离,六、结果分析与评价,【,探规寻律,】,对分离效果的判断,(1),若血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整地随洗脱液缓慢流出，则装填成功，分离操作正确。,(2),若血红蛋白的红色区带歪曲、散乱、变宽，则说明分离效果不好，装填不成功。,【,互动探究,】,(1),凝胶色谱柱的装填应注意哪些事项？,(2),血红蛋白溶液是如何分离的？,【,提示,】,(1),装填前为了加速膨胀，可以加入洗脱液的湿凝胶，用沸水浴加热，优点是：节约时间，除去凝胶中可能带有的微生物，排除胶粒内的空气。,装填时不能有气泡，气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,装填后不能发生洗脱液流干露出凝胶颗粒的现象。,(2),蛋白质的分离是根据离心原理进行的。当含有细小颗粒的悬浮液静置不动时，由于重力场的作用使得悬浮的颗粒逐渐下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液体小的粒子就会上浮。微粒在重力场下移动的速度与微粒的大小、形态和密度有关，并且又与重力场的强度及液体的黏度有关。像红细胞大小的颗粒，直径为数微米，就可以在通常重力作用下观察到它们的沉降过程。,(2011,年聊城高二检测,),有关凝胶色谱法和电泳法的说法正确的是,(,),A,它们都是分离蛋白质的重要方法,B,它们的原理相同,C,使用凝胶色谱法需要使用缓冲溶液而电泳不需要,D,以上说法都正确,【,尝试解答,】,_A_,例,1,