第三章基因工程载体.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,具有复制原点，能,自我复制,；,具,多克隆位点,，即有多种限,制酶的切点；,选择时的,遗传标记,，如抗生素,基因；,易,从宿主细胞中,回收,。,pUC,19,质粒,二、作为基因工程载体所必须具备的条件,三、载体的分类,依据用途的不同,克隆载体：以繁殖,DNA,片段为目的的载体。,穿梭载体：既能在真核细胞又能在原核细胞,繁殖的载体。,表达载体：用来将克隆的外源基因在寄主细,胞内表达成蛋白质的载体。,依据受体细胞不同,原核生物载体 真核生物载体,大肠杆菌载体 酵母载体,植物基因工程载体 动物基因工程载体,三、载体的分类,一、,质粒的一般性质,2.质粒DNA的分子特性,质粒DNA具有,3种,不同的构型：,闭合环状,DNA,(closed,circle DNA,，,ccDNA,):,两条多核苷酸链均保持着完整的环状结构。这样的,DNA,通常呈超螺旋结构（,supercoil,）,即,SC,构型,.,开环,DNA,(open,circle DNA,，,ocDNA,):,两条多核苷酸链只有一条保持完整的环状结构,另一条链出现一个或数个切口。,线性,DNA,（,liner DNA,，,lDNA,）：闭合环状,DNA,分子双链断裂成线形,DNA,分子，即,L,构型,。,一、,质粒的一般性质,2.质粒DNA的分子特性,在琼脂糖凝胶电泳中，不同构型的同一种质粒DNA，尽管分子质量相同,但,迁移率,不同,：,SC-DNA：,走在,最前沿,L-DNA：,走在,中间,OC-DNA：,走在,最后,质粒,的大小差异,很大,，,小的,不到,1kb,，,大的,超过,500kb,，每一个质粒,都有一段DNA复制起始位,点的序列，帮助质粒DNA,在宿主细胞中复制。,3.质粒的大小,一、,质粒的一般性质,一、,质粒的一般性质,4.质粒的拷贝数,高拷贝质粒,：有些质粒在每个宿主细胞中可,以有,10-100,个拷贝。,低拷贝质粒,：有些质粒在每个细胞中只有,1-4,个拷贝。,在一个细菌细胞中，质粒,最多,可以占到细菌总DNA的,0.1%-5%,一、,质粒的一般性质,5.质粒的不亲和性,两种或两种以上亲缘关系密切的不同质粒不能在同一宿主细胞中稳定地共存，这种现象称为,质粒的不亲和性,。有时也称为,不相容性,。,亲缘关系密切的不同质粒属于,同一个不相容群,；,来源,不同,的,不相容群,的质粒可在同一细胞中共存,.,一、,质粒的一般性质,6.质粒的宿主范围,窄宿主范围质粒：,有些质粒的复制起点,较特异,，,只能在一种特定的宿主细胞中复制。,广宿主范围质粒：,有些质粒的复制起点,不特异,，,可以在,许多,细菌细胞中复制。,质粒作为一种自主性自我复制的遗传因子，具有携带外源DNA，成为克隆载体的潜在可能。,二、,质粒的类型（质粒家族庞大，种类繁多,）,根据质粒在细胞中拷贝数的多少，将质粒分为：,严紧型质粒：,其DNA的复制与宿主染色体DNA的复,制相,偶联,，受到某种程度的,限制,，,每个细胞仅有,1-2个拷贝,。,松弛型质粒：,其复制是在,松弛状态,下进行的，每,个细胞的拷贝数约,10-200个拷贝,。,实验：,培养基,氯霉素,细胞蛋白质合成被抑制,细胞染色体DNA复制停止,严紧型质粒DNA复制停止,松弛型质粒DNA的复制继续进行,二、,质粒的类型（质粒家族庞大，种类繁多,）,根据质粒是否在细胞间传递，将质粒分为：,自身传递性质粒：,如F因子，除了携带自主复制所必需的遗传信息之外，,还带有,一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此,能,从一个细胞自我转移到另一个细胞中，它们多属于,严紧型质粒,。,非自身传递性质粒：,如ColE1，虽然携带自主 复制所必需的遗传信息，但,不,携带控制细菌配对和质粒接合转移的基因，因此,不能,从一个细胞自我转移到另一个细胞。它们多属于,松弛型质粒。,二、,质粒的类型（质粒家族庞大，种类繁多,）,根据质粒是否在细胞间传递，将质粒分为：,从安全角度考虑：,基因工程所用的载体主要,是非自身传递性质粒.,原因：,自身传递性质粒不仅能够从一个细胞转移到另一个细胞，而且还能转移染色体。,如果自身传递性质粒已经,整合,到细菌染色体的结构上，就会,牵动,染色体发生,高频率,的转移。,此外，自身传递性质粒还,能够促使,与它,共存,的,非自身传递性质粒,发生,转移,。,从安全角度考虑：,因此，,在实验室的研究工作中，如果使用,自身传递性质粒,作,载体,，在,理论上,存在着发生使DNA跨越生物种间遗传屏障的,潜在危险,。基因工程所用的非自身传递性质粒载体缺乏转移所必需的,mob基因,，因此不能发生自我转移。,三、理想质粒载体的基本要求,具有,较小,的,分子质量,和,较高,的,拷贝数,；,具有,若干,限制性核酸内切酶的,单一,酶切位,点，以满足基因克隆的需求；,具有,两种,以上的选择标记基因；,缺失,mob,基因；,插入外源基因的重组质粒,较易,导入宿主细胞,并,复制,和,表达,。,四、重要的大肠杆菌质粒载体,松弛型复制,氯霉素可扩增,拷贝数,500-100/cell,用于基因克隆,pBR322：,pUC,18,：,.,分子量小,，可接受较大外源片段；,.,拷贝数多,，,500个细胞；,.,克隆位点的酶切位点多,，克隆方便；,.具有用于检测重组质粒的,选择标记,（,互补的显色表型）。,四、重要的大肠杆菌质粒载体,四、重要的大肠杆菌质粒载体,pGEM-3Z：,多拷贝,装有多克隆位点（,MCS,）,正选择颜色标记,lacZ,装有两个噬菌体的强启动子,用于外源基因的高效表达,四、对天然质粒载体的人工改造,pSC,134,的构建：,切点,抗性基因,类型,pSC,101,EcoR切点Hind切点,抗四环素,基因,严紧型,ColE,1,EcoR切点,大肠杆菌素基因,松弛型,表3-1 pSC101和ColE,1,的比较,pSC,134,的构建：,四、对天然质粒载体的人工改造,pSC,101,ColE,1,EcoR,酶,切割,共接质粒,pSC,134,既有ColE,1,松弛型易于扩增的优点，,又有pSC,101,抗四环素易于筛选的优点.,质粒,载体,一般,最大,能,克隆,10kb,左右,DNA,片段,第三节,噬菌体载体(,phage vector),一、,噬菌体的生物学特性,噬菌体是大肠杆 菌的一种中等大小、温和噬菌体。,噬菌体由外壳包装蛋白和,-,DNA,组成。,二、,噬菌体的基因组结构和功能,-DNA,全长,48 502,bp,-DNA,上至少有,61,个基因,一半左右的,基因参与噬,菌体生命周,期活动,必要基因,另一部分基,因被取代后,不影响噬菌,体生命功能,非必要基因,二、,噬菌体的基因组结构和功能,-DNA,上有,cos,位点,在,噬菌体,线性,双链,DNA分子的,两端,，各有一条由,12个,核苷酸组成的彼此,完全互补,的,5单链,突出序列，即,粘性末端,。这种由粘性末端结合形成的双链区段称为,cos位点（,略cos，系英语cohesive-end site的缩写，即粘性末端位点之意）。,为了述说方便,人为的将,噬菌体基因组分为3个区域:,如下图所示,左侧区：,包括,外壳蛋白,的全部编码基因。,中间区：,与噬菌斑形成无关，被外源DNA片段,(I/E区),取代后，不影响噬菌体的生命活动，,因此，该区又称为,非必需区,。,右侧区：,包括全部的主要,调节基因,及,复制基因,和,裂解基因,。,三、,噬菌体的生活周期,噬菌体DNA进入细菌细胞后,可有,2种,生活周期:,裂解周期(溶菌周期),和,溶源性周期,何谓裂解周期,(,溶菌周期,)?,在裂解周期中,噬菌体的DNA分子进入宿主细胞后,便可,借助,宿主的复制和转录系统进行复制和外壳蛋白的合成,同时二者组装成完整的噬菌体颗粒,20min后可使宿主细胞发生裂解,释放出大约,100个,噬菌体颗粒,.,如下图所示,噬菌体溶菌周期示意图,噬菌体溶菌周期示意图,三、,噬菌体的生活周期,何谓溶源性周期,?,在,溶源性周期,中，,噬菌体的DNA分子并,不,马上复制，而是在特定的位点,整合,到宿主染色体DNA中，与宿主染色体形成,一体,，并,随着,宿主染色体的,复制,而,复制,，,随,宿主的分裂繁殖而传给其子代细胞。但这种潜伏的,噬菌体DNA在某种,营养条件,或,环境条件,胁迫,下，可以从宿主染色体DNA上,切割出来,，并进入,裂解周期,。,四、,噬菌体载体的构建,1.野生型,噬菌体不适于直接作基因克隆载体,的原因,DNA,基因组大而且复杂,特别是其中具有基,因克隆常用的限制性核酸内切酶的,多个,识别位,点,如,5,个,BamH,位点、,5,个,EcoR,位点、,7,个,Hind,位点。,噬菌体外壳只能接纳一定长度（相当于,基因组大小的,75%-105%,）,的,DNA,分子。,2.对野生型,DNA的改造,四、,噬菌体载体的构建,切除,掉,DNA,的,非必需区段,，,扩充,噬菌体载体的,克,隆容量,。,除去,DNA,必需区段,中的限制性核酸内切酶,识别位,点,，在,非必需区,引入,合适的限制性核酸内切酶,位点,。,引入,适当的,选择性标记,以方便重组子的,筛选,。,通过在某些,必需基因,中,引入,无义突变,使之成为,安全,载体，以利于生物学防护。,四、,噬菌体载体的构建,3.,构建,噬菌体载体的基本内容,野生型,DNA包装的,上限,为,51kb,本身长度为,48.5kb,只有当插入的外源DNA片段,不大于,2.5kb,时,才能被包装成有感染能力的噬菌体颗粒.,因此,缩短野生型,DNA的长度,可以,提高,装载量.其实野生型,DNA上约有,40%-50%,的片段是复制和裂解所,非必需,的.,缩 短 长 度,插入型载体,:,只有,1,个,限制性核酸内切酶的酶,切位点可供外源,DNA,插入的,噬菌体派生载体,.,取代型载体,:,具有,2,个,限制性核酸内切酶的酶,切位点,它们之间的,DNA,区段可被外源,DNA,区段,所取代的,噬菌体派生载体,.,根据切除的多少,可将,DNA分成两大类载体:,四、,噬菌体载体的构建,3.,构建,噬菌体载体的基本内容,缩 短 长 度,如下图所示,四、,噬菌体载体的构建,3.,构建,噬菌体载体的基本内容,四、,噬菌体载体的构建,3.,构建,噬菌体载体的基本内容,四、,噬菌体载体的构建,3.,构建,噬菌体载体的基本内容,删 除 重 复 酶 切 位 点,野生型,DNA链上有,5个EcoR,位点和,7个Hind,位点,不利于重组操作,必须删除至,1-2个,.,同时为了各种来源DNA片段的可隆,还需,增加,一些,单一,的酶切位点.,除了简单的切割外,还需要采用定点突变技术去除或增加酶位点.,与质粒不同,野生型,-DNA上,缺少,合适的选择标记,因此,加装,选择标记是,-DNA克隆载体构建的重要内容.,加 装 选 择 标 记,四、,噬菌体载体的构建,3.,构建,噬菌体载体的基本内容,-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类:,免疫功能类标记,颜色反应类标记,Imm434,基因,编码一种,阻止,-噬菌体进入,溶菌循环,的阻遏物。含有完整标记基因的,-载体进入受体细胞后,建立,溶源状态,细菌生长缓慢,形成,浑浊斑,；当外源DNA,插入,到标记基因中,标记基因失活,-重组分子便进入,溶菌状态,形成,透明斑,。,四、,噬菌体载体的构建,3.,构建,噬菌体载体的基本内容,加 装 选 择 标 记,Imm434,lacZ基因,编码,-半乳糖苷酶,能催化,无色,的X-gal生成,蓝色,化合物.当外源基因,插入,到lacZ基因中,基因,失活,不能,合成,蓝色,化合物;而,空载体,-DNA则产生,蓝色,透明斑.,加 装 选 择 标 记,四、,噬菌体载体的构建,3.,构建,噬菌体载体的基本内容,lacZ,琥珀型突变,是指由,CAG,向,UAG,的突变.大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因,其编码产物-校正tRNA能专一性地纠正这一突变.,将,野生型,DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的,CAG,突变成,UAG,.当这种,DNA进入一般的,Ecoli.,后,不能,合成有活性的头部蛋白,也就,不能,被包装和裂解细菌,这样就可以,阻止,有害重组体的生物污染及扩散,而基因工程实验中使用受体则是,具有,琥珀型突变校正功能的菌株.,构 建 琥 珀 密 码 子 的 突 变 体,四、,噬菌体载体的构建,3.,构建,噬菌体载体的基本内容,五、,-DNA作为载体的优点,-DNA,可在体外包装成噬菌体颗粒,能,高效,转,染大肠杆菌,不易,引起生物危害,.,-DNA,载体的装载能力,15-20kb,远远,大于,质,粒,的装载量,.,重组,-DNA,分子的,筛选,较为方便,.,重组,-DNA,分子的,提取,较为简便,.,-DNA,载体,适合,克隆,和,扩增,外源,DNA,片段,但,不,适合,表达,外源基因,.,第四节,柯斯质粒,载体(,cosmid,vector),一、柯斯质粒载体的结构,柯,斯质粒,(又称,粘粒载体,),是一类人工构建的含有,-DNA 的,cos,序列,和,质粒复制子,的特殊类型的载体。,噬菌体,cos,序列,细菌质粒复制原点,抗生素抗性标记,多个单克隆位点,二、柯斯质粒载体的特点,1.具有,噬菌体的体外包装、高效感染等特性。,柯斯质粒载体本身,不能,在体外被包装成噬菌体颗,粒，只有在克隆了,合适长度,的外源,DNA,片段，才能被,包装成噬菌体颗粒。,这种噬菌体颗粒可以,高效感染,对,噬菌体,敏感,的大肠,杆菌细胞。,柯斯质粒的重组子,DNA,分子进入宿主细胞后，便按,照,噬菌体同样的方式,环化起来。,由于柯斯质粒载体,不含有,噬菌体的全部基因，因,此，它,不能够,形成子代噬菌体颗粒。,二、柯斯质粒载体的特点,2.具有质粒载体的易于克隆操作、选择及高拷贝等特性,.,柯斯质粒载体具有,质粒的复制起点，,在宿主细胞内,象质粒一样进行复制，并且在,氯霉素,作用下，可进,一步扩增。,柯斯质粒,载体通常具有,抗菌素抗性选择标记,，其中有,一些还带有引起插入失活的克隆位点。,柯斯质粒载体的分子质量,较小,，易于克隆操作。,二、柯斯质粒载体的特点,3.具有高容量的克隆能力。,柯斯质粒载体的分子,较小,，一般为,5-10kb,。,按,噬菌体的包装限制，一般可插入,35-40kb,的,外源基因。,柯斯质粒载体用于克隆,DNA,大片段,特别有效。,4.,具有与同源序列的质粒进行重组的能力。,当该载体与一种带有,同源序列,的,质粒,共存于,同一个,宿主细胞中时，它们之间会通过,同源重组,形成,共合体,。,第五节,其他,载体,一、YAC载体,YAC,是酵母人工染色体（,yeast artificial chromosome,）的缩写，是目前能容纳最大外源DNA片段的载体。,1.,YAC,载体构建的知识背景,着丝粒,（,centromere,，,CEN,）,端粒,（,telomere,，,TEL,）,自主复制序列,（,autonomously,replicating sequence,，,ARS,）,真核生物染色体的关键部分,TEL,TRP1,ARS1,CEN,URA3,TEL,核,基,因,组,降解,2.,YAC,构,建,示,意,图,pYAC,4,特点：,1.,两个可在酵母菌中利用的,选择基因,，,URA,3,和TRP,1,（色氨酸合成基因）；,2.,酵母菌着丝粒,序列,（,CEN,4,）；,3.一个,自主复制序列,（ARS,1,）；,4.两个嗜热四膜虫,末端,重复序列（TEL）,保持重组YAC为线状结构；,5.在两个末端序列中间，有一段,填充,序列,（His,3,）,使,pYAC,4,在细菌细胞,中能稳定扩增；,6.,Amp抗性,及细菌质粒复制原点；,7.一个,Eco,R I,克隆位点,，位于酵母菌,Sup,4,tRNA基因内。,酵母菌人工染色体,pYAC4,在克隆外源,DNA,时，用,Bam,HI,和,Eco,R,I,双酶切，得到二个人工,染色体臂，与,Eco,R I,酶切的外源,DNA,片段连接，构成重组的酵母,人工染色体，用于转化酵母菌。,2.YAC,构 建 示 意 图,一、YAC载体,3.,YAC,载体的优缺点,优点：,可容纳更长的DNA片段,每个YAC可装进,1001000kb,的,外源DNA片段.,缺点：,用其克隆外源基因易出现,嵌合体,（约,40-60%,）。,某些克隆不稳定,有从插入序列,丢失,其内部区段的倾向,.,YAC,克隆,不容易,与酵母自身染色体相分离。,1996,年完成了酵母菌,全基因组序列的测定。,二、细菌人工染色体,1.,细菌人工染色体的构建,细菌人工染色体是以F因子为基础构建的细菌克隆载体.,F因子是一种细菌,接合型质粒,，因此野生型F因子,能够从一个细胞转移到另一个细胞。,F因子的特性：,细菌人工染色体构建原理：,除去,F,因子转移区及整合区等复制,非必需区,；,引入,多克隆位点及选择标记。,二、细菌人工染色体,2.,细菌人工染色体的特点,细菌人工染色体的拷贝数低；,细菌人工染色体较稳定；,细菌人工染色体比,YAC,易分离；,细菌人工染色体克隆容量为,300kb,；,细菌人工染色体可用国电穿孔导入细菌细胞。,三、动物病毒,动物病毒作为载体可用于外源基因向,真核,细胞的转入.,具有动物病毒的复制起始部位及启动子.,可使外源基因能有效的转染动物细胞,以及提供,必要的转录信号.,具有可供选择的标记基因.,因为重建的病毒转染力很低,一般仅为10,5,-10,7,只有利用标记基因才能选出转化细胞株.,具有适当的多种单一内切酶位点供外源基因插入.,1.作为基因介导的动物病毒,必须具备以下条件:,2.目前常用的作为基因转移载体的动物病毒有:,三、动物病毒,猴空病毒,(simian virus,简称,SV40),腺病毒,(adenovirus),乳头状病毒,(,papilloma,virus),逆转录病毒,(retrovirus),牛痘病毒,(,vaccinia,virus),牛疣病毒,(bovine,papilloma,virus),等,猴空病毒(SV40),1.为什么SV40被广泛用于载体的构建?,基因组是由,5224bp,构成的双链、共价闭合的DNA,小分子,，整个核苷酸序列和基因结构已,分析清楚,.,关于它的复制和转录也了解地较为,透彻,.,感染率,高,，几乎,100%,的寄主细胞能被感染，每细,胞感染病毒的数量也,很多,.,DNA复制的量,大,，重组DNA在细胞内的拷贝数逐,渐加大，转录物积累，因而能产生,大量,外源基,因所编码的,蛋白质,.,SV40能提供完整的真核基因转录所需的成分，包,括,启动子、RNA拼接信号和多聚腺苷酸化位置,。,猴空病毒(SV40),1.为什么SV40被广泛用于载体的构建?,因此只要将,外源,DNA插入,SV40,的,启动子,和,拼接信号,之间,就能使,外源,基因得到,表达,。如果外源基因,本身,带有,启动区,、,内含子,和3端的,调控序列,(即完整DNA),插在SV40基因下游的,任何,位点,都可获得,表达,表达的,强弱,与外源基因本身的,启动子,有关.,猴空病毒(SV40),2.SV40的侵染对寄主的特异性,对于受体细胞,(permissive cells):,如猴细胞,病毒可在其中增殖,导致细胞裂解.,对于非受体细胞,(non permissive cells):,如鼠细胞,病毒不能在其中增殖,细胞不发生裂解,但可被SV40DNA转化.,通常在这种转化的细胞中,SV40 DNA序列已经整,合到寄主染色体上,并得到了扩增和重排.,猴空病毒(SV40),3.SV40的对猴细胞的侵染周期,SV40的对猴细胞的裂解侵染可分为3个时期:,早期:,接着,4个h,称为早期,合成早期mRNA和早期蛋白,质,寄主细胞DNA的合成也受到病毒诱导和刺激.,晚期:,早期后,36h,称为晚期,在这期间合成病毒DNA、,晚期mRNA和晚期蛋白质,以病毒的组装和寄主,的瓦解而告终.,初早期:,在侵染的,最初8h,病毒颗粒去掉外壳,DNA向寄,主细胞核移动.,猴空病毒(SV40),3.SV40病毒颗粒的包装,SV40病毒颗粒对其内含DNA的包装具有严格限制,如果在其DNA上插入的外源基因,过大,则,无法,包装.因此,用它作载体,需要,去掉,一部分,自身,DNA,通常有,两种,方法:,用外源,DNA,取代,T,-,抗原基因区,:,利用,SV40,的,早期,启动子,用外源,DNA,取代,VP,结构基因区,:,利用,SV40,的,晚期,启动子,四、植物基因工程载体,植物基因工程载体,主要是指,转化载体。,包括,质粒转化载体,、,病毒转化载体,等。其中Ti,质粒转化载体,是最主要的，也是最常用的。,Ti质粒转化载体,是适合于,植物,的载体系统,，可以,将,重组DNA,运载到植物细胞中,，使,目的基因,表达,。,Ti,质 粒 转 化 载 体,土壤农杆菌,（,Agrobacterium,tumefaciens，,革兰氏阴性菌）,是一种宿主非常广泛的,土壤细菌。,Ti质粒,就存在于该细菌,细胞中，可诱导植物产生,瘤细胞,(tumor-inducing,Ti,),最终导致植物产生,冠瘿瘤,（grown galltumors）。,Ti,质 粒 转 化 载 体,1.Ti质粒的来源,农杆菌,感染产生,冠瘿瘤,Ti,质 粒 转 化 载 体,2.T-DNA的特性,1977年Chilton等在研究农杆菌侵染形成的植物肿瘤细胞时,用分子杂交方法发现在冠瘿瘤细胞中存在农杆菌,Ti质粒,的一个片段,称为,转移DNA,(transfer DNA,T-DNA,).,当农杆菌感染植物伤口细胞时，,T-DNA便转移并整合到植物染色体上得以表达，诱导冠瘿瘤,，并能合成冠瘿（opine）,作为农杆菌碳源和氮源。,3.,Ti质粒特点,：,(,1),具有,五个主要功能区域,：,T-DNA,：,LB,与,RB,间,T-DNA,序列整合到植物基因组,；,质粒转移,区,（,PT,）；,冠瘿碱,（opine）,代谢区,；,复制,原点；,毒性,区。,Ti,质 粒 转 化 载 体,(2),T-DNA中直接参与,转移并整合,的序列：T-DNA两端与其它序列交界处的,25bp,不完全直接重复，右端的这段序列称为,右界（RB）,，左端的序列称为,左界（LB）,。,(3),V,区的,毒性基因：,T-DNA转移所必需，毒性基因以顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。,3.,Ti质粒特点,：,Ti,质 粒 转 化 载 体,.双元载体（binary vectors）：,具有两个质粒：,.,用于克隆外源基因片段的克隆质粒,：在,E.coli,和农杆菌中复制，容易操作，并可在二者间转移，是一种穿梭质粒；,.非致病质粒,：具有毒性基因，没有T-DNA序列。,将两个质粒分别导入农杆菌，经农杆菌介导，克隆质粒中的外源DNA转移到植物染色体中。,4.,Ti质粒是200-500kb环状DNA分子，有两套载体系统,Ti,质 粒 转 化 载 体,.共整合载体（integrated vectors）：,也,包括两个质粒，一个用作克隆外源基因，另一个具有毒性基因，但,这两个质粒具有一段同源序列,，在农杆菌中重组整合成一个载体。,4.,Ti质粒是200-500kb环状DNA分子，有两套载体系统,Ti,质 粒 转 化 载 体,Ti,质 粒 转 化 载 体,5.Ti质粒作为植物基因工程载体的原因,当,T-DNA,转移并整合到植物基因组上时,不仅能够表达,而且整合进植物基因组的T-DNA片段,能够通过减数分裂传递给子代,这是自然界存在的,天然基因工程,.,由此可见,以,Ti质粒,为,载体,可将插入到T-DNA中的,外源基因,通过T-DNA转移到植物细胞中.,T-DNA,能够,高频率,的转移植物基因组,Ti质粒,可以插入大到,50kb,的,外源DNA,因此,Ti质粒是植物基因工程最理想的转化载体之一,.,