第四节-蛋白质的合成过程1.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第四节 蛋白质的生物合成,本节的主要内容,1、原核生物以及真核生物蛋白质生物合成过程：包括起始，延伸，终止；,2、保证蛋白质正确合成的机理；,植物细胞中蛋白质合成的部位,More than 20,000 proteins,50-100,30-40,一、蛋白质合成的一般特征：,蛋白质生物合成的方向：,N,端,C,端；,mRNA,的转录方向：,53,蛋白质合成除需要,aa,，,核糖体，,mRNA,，,tRNA,外,，还需要,ATP,、,GTP,，,一系列,辅助因子。,二、蛋白质合成的过程,1、氨基酸的,活化,；,2、蛋白质合成的,起始,；,3、蛋白质合成的,延伸,；,4、蛋白质合成的,终止,；,（一）、氨基酸的活化：,1、E.Coli氨基酸的活化,:,由高度特异的氨酰-tRNA合成酶,(aminoacyl-tRNA synthetase)催化，反应分两步：,第一步：,生成的氨酰tRNA的空间构象,（二）、蛋白质合成的起始：,（1）、多肽链合成起始需要专一的,tRNA：,1、大肠杆菌蛋白质合成的起始：,A、起始密码子是AUG，与之相对应的tRNA为起始tRNA（,记为,tRNA,fMe,t,），这,种,氨酰,-tRNA,通常,被,缩写,为,fMet-tRNA,fMe,t,。而与基因中密码子AUG相对应的tRNA是另外一种tRNA，记为,tRNA,m。,（2）、多肽链合成起始需要甲酰甲硫氨酸：,tRNA,fMe,t,通,过,两,步,反应,获得,被,修饰,的氨基酸。,A,、,tRNA,fMe,t,与,Met,相连得到,Met-tRNA,fMe,t,；,B,、,N10,甲酰,FH4,为甲基供体，,甲酰基封锁了,Met-tRNA,fMe,t,上的,Met,上的,NH2,得到,fMet-tRNA,fMe,t,；,甲酰基的作用：,甲酰化并不是必不可少的,，因为没有甲酰化的Met-tRNA,fMe,t,也能行使起始的功能，但甲酰化后,能提高fMet-tRNA,fMe,t,的,起始,效率,。,起始tRNA由甲硫氨酰-tRNA甲酰化,tRNA,fMe,t,Met,Met-tRNA,fMe,t,甲酰基转移酶,N,10,甲酰FH,4,FH,4,（fMettRNA,fMe,t,）,甲酰基,AARS,N甲酰甲硫氨酸,Met,ATP/Mg,2+,+,tRNA,m,Met,tRNA,f,Met,Met-tRNA,m,Met,Met,-,tRNA,f,Met,fMet,-,tRNA,f,Met,N,10,-ormyltetrahydrofolate,Transformylase,AMP/Mg,2+,PP,i,No way,AMP/Mg,2+,PP,i,Met-tRNA,m,Met,只,识别内,部,的,AUG,密码子，它的,甲硫,氨酸,不,能,被,甲,酰,化,（3）、起始Met的水解：,几乎所,有蛋白质合成的,起,始,氨基酸,都,相同，但,并不是所有的蛋白质第一个氨基酸是甲酰甲硫氨酸,；,A、对于末端是甲硫氨酸的蛋白质：是,由,专,一的,去,甲,酰,化,酶,(Deformylase),催化,去掉甲酰基团,；,B、对于末端不是N甲酰甲硫氨酸的蛋白质：在,第一步,的基础上，,末,端,的,甲硫,氨酸会,被,一,种称为,氨肽,酶,(Aminopeptidase),的,酶去掉,；,细菌,中,新,合成的蛋白质以,甲,酰甲,硫,氨酸,开始,，,但,在蛋白质,合成,期,间,甲,酰基被去掉，有,时,甚至,甲硫,氨酸也,被除,掉,。,（4）、大肠杆菌对起始密码子的利用：,原核生物的,起始密码子为AUG 或GUG(偶尔也识别UUG)。,起始密码子,被,识别的程度,不,同，若,将,AUG,替换,为,GUG,，,则,起,始的效率,将会,降低,大,约一半,，若替换,为,UUG,，,则效率,将会,在这个基础,上又,降低,大,约一半。,AUG,和,GUG,是,兼职密码子,，它们既可以作为起始密码子，作为肽链合成的,起始信号,，这时与之对应的氨基酸是,甲酰,Met,。,另外也可作肽链内部相应,aa,的密码，这时,AUG,编码,Met,GUG,编码,val,。,（5）、mRNA上,核糖体结合位点,序列特点：,A、起始序列的确定方法：,核糖体结合到mRNA上,阻止肽链的延伸，加核酸酶消化未被保护的mRNA,对获得的序列进行分析,B、mRNA上核糖体结合位点（RBS）序列的特点：,AUG(,或,偶尔,GUG,或,UUG),起,始,密码子,总,是位于,被,保,护,的,序,列中。,在,AUG,上,游,10,个,核苷酸,以,内,有一,段,序,列,接,近,或,同下,面,的,序,列完全相同,：,5,AGGAGG,3,这,段多,嘌呤,的,序,列,被,称为,SD,(Shine-Dalgarno),序,列。它与,16S rRNA,上,靠,近,3,一,段保守,序,列,配,对,：,3,UCCUCC 5,SD,序列的意义：,对,SD,序,列进,行点突变,，,发,现,mRNA,无法,被,翻译,。,说明,SD,序列是原核生物蛋白质翻译所必须的。,（6）、原核生物中,起始辅助因子,：,IF-1 9.5kd 与 30S,亚,基结合，成,为,起,始,复合,物,的一,部,分,，促进IF-2的释放,；,IF-2 95kd-117kd 与,GTP结合,活化，促使,fMet-tRNA,fMe,t,选择性的 结合在,30S亚基上,IF-3 20kd 促使,30S亚基,结合于mRNA起始部位,;,因 子,大 小,作 用,inactive 70S ribosome,SD sequence,30S initiation complex,（7）、30S起始复合物的形成：,IF2与GTP结合,70S initiation complex,GDP+Pi,（8）、70S起始复合物的形成,起始复合物形成过程的特点：,A、,通,过与,fMet-tRNA,fMe,t,专,一结合，,IF-2,使,起,始,tRNA,而,不是其他,的,Met,-tRNA,参,加,起,始,反应,。,B、,IF-2,具,有,依赖,核糖体,的,GTPase,活性,：,当,50S,亚,基,连,接上,，,形,成完,整,的核糖体,时,，,GTP,被,水,解。,GTP,的,水,解,对,核糖体结,构,的,改变,有,所,帮,助，使,70S,核糖体成,为,有活性的结合体,。,C、,fMet-tRNA,fMe,t,是进入核糖体的,P位，而不是A位。,2、真核生物起始复合体的形成：,（1）、真核生物mRNA的特点：,每,个,真,核,生物,的,mRNA,都是,单,顺,反子,，,但每分,子的,mRNA,通常,都比,编,码蛋白质,所,必需,的,长,度,长,。,真,核,生物细胞质,中,mRNA,的,平,均,长,度,为,1000-2000,个,碱,基,，在,5,端,有一个,甲,酰,化,帽,子，在,3,端带,有,100-200,个,碱,基的,poly(A),。,有,时,AUG,起,始,密码子,位于,mRNA 5,末,端,40,个,碱,基以,内,，使,帽,结,构和,AUG,都位于,核糖体结合的,范,围,之,内,。,但,最,远,可,达,到,1000,个,碱,基。并且有,二级发卡结构。,（2）、真核生物起始tRNA的特点：,A、真核生物起,始tRNA为,tRNAi,，延伸中负责运转Met为,tRNAm,，二者携带的氨基酸均为Met。,B、在,酵母,中，,起,始,tRNAi,至,少,有,两,个,独特,的,特点,：,它,具有,特,殊,的,三,级,结,构,；,在,64,号,碱,基的,2,羟基,被,磷,酸,化,，,如,果,不,存,在这一,修饰则,tRNAi,可,用,于,延伸。,（3）、真核生物蛋白质合成的,起始因子：,i,eIF2-A 65kd 促使Met-tRNAi与40S亚基结合,eIF1 15kd 促使40S亚基与mRNA结合,eIF3 500kd 与eIF4e有高亲和力，促使40S亚基与mRNA 起始位点结合,eIF5 150kd 水解GTP，释放eIF2,eIF3,促使核糖体大小亚基之间的结合,eIF4e (eIF4f 的亚基)促进40S核糖体小亚基与mRNA5端帽子结合,因子,大小,作 用,eIF4a 50kd 使 mRNA发卡二级结构解开,eIF4b 80kd 协助 eIF4a解开发卡二级结构,eIF2,结合GTP而活化，协助40S亚基形成三元复合物（,Met tRNAi，mRNA，40S亚基,）,真核生物蛋白质合成的起始因子的作用,（5）、40S起始复合物对mRNA上转录起始位点的寻找：,滑动模型,40S,起始复合物只,有在含有,序,列,GCC,（,A/G,）,CC,AUG,G,位,置上停止移动；,在,AUG,上游第三个,位,置,上,的,嘌呤,(,A,或,G,),和,随,后,的,G,是,最,重,要,的，它,们,以,10,倍,的,关,系,影响,着,翻译,的,效率,；,mRNA翻译起始位点的序列特点：,（6）、80S起始复合物：,Translation domain,Exit domain menbrane,Exit site,P,site,A,site,mRNA site,60 Nt,（7）、真核生物起始复合物的特点：,A、18S序列上没有与mRNA上互补的序列；,B、mRNA 3,端,的,poly(A),尾,的,存,在,可,刺激,5,端起,始,复合,物,的,形,成，从而提高翻译效率。这一过程,需要,poly(A),结合蛋白；,C、40S小亚基与mRNA5端帽子结构的结合需要起始tRNA（tRNAi)的协助。,D、40S起始复合物对向蛋白质合成起始位点滑动的过程中需要解开发卡二级结构。移动的过程需要,ATP提供能量,。,E、起始MettRNAi位于起始80S复合物的,P位点,。,二、多肽链的延伸：,（一）、原核生物多肽链的延伸,1、氨酰tRNA进入核糖体A位点,（1）、,三,元,复合,物的形成,：,二元,复合,物,EF-Tu,-GTP,与氨酰,-tRNA,结合,形,成,三,元,复合,物,：,氨酰,-tRNA-EF-Tu-GTP,。,（2）、三元复合物进入A位点：,A、反密码子的尾部结合到30S 亚基的A位点上。,B、密码-反密码的,识别,引发EF-Tu 结构的变化，促使tRNA 的CCA 尾部移入50S 亚基的A 位点内。然后GTP被水解为GDP，二元复合物EF-Tu-GDP 被释放。,（3）、EF-Tu-GTP的再生：,唯,一,不,能,被,EF-,Tu,-GTP,识别,的氨酰,tRNA,是,N-,甲,酰,甲硫,氨酰,tRNA,，,这,种,排,斥,作用,保,证,了,fMet-tRNAf,不,能与,内,部,密码子,AUG,或,GUG,结合。,EF-,Tu,-GDP,是在,EF-Ts,的帮助下实现再生的。,（4）、GTP水解对肽键形成的影响：,肽键的形成需要,GTP,水解为,GDP,：,为,研究,GTP,在,三,元,复合,物,中的作用，有人用,不,能,被,水,解的,GTP,类,似,物,GMP-PCP,代,替,GTP,。,在,GMP-PCP,存,在的,条件,下，,三,元,复合,物,（,AA,tRNA,-EF,Tu,-,GMP-PCP,）,可,以,形,成，氨酰,-,tRNA,也,能,进入到,核糖体,A,位点,。,但,肽键,不,能,形,成。,肽键的形成需要,EF,Tu,GDP,从,A,位点的释放：,黄色霉素,(,Kirromycin,),是,一,种,能,抑,制,EF-,Tu,功,能的,抗,生,素,。,当,EF-,Tu,被,黄色霉素,结合,时,，它,仍,保,留,与氨酰,-,tRNA,结合,并,使,之,进入,A,位点,的,功,能。,但,EF-,Tu,-GDP,复合,物不,能,从,核糖体,上,释放,。这使肽酰,-,tRNA,和,氨酰,-,tRNA,之间,的,肽键,无法,形,成,。,（5）、EFTuGDP的释放对肽键形成的影响：,氨基酸进位需延伸因子：Ts、Tu，还要 消耗GTP。EF-Tu与GTP和氨酰-tNRA首先形成三元复合物，才能进入A位。,总结：,原核生物氨酰-tRNA进入核糖体的A位的过程：,通,过,把,与,P,位点上,的,tRNA,结合的,多,肽链,转,移到,A,位点上,的,氨酰,tRNA,上可,使,多,肽链延伸（羧基结合到A位点上的氨基酸的氨基上，形成肽键。），在这一过程中，核糖体,停,在,原,处,。这个,催化,活性,可,能,是,50S,亚,基的,核糖体,RNA,的性质,。,2、肽键的生成（转肽反应）：,肽键,形,成,于,P,位点,的肽酰,tRNA,所,携带,的,多,肽链与,A,位点,氨酰,-tRNA,所,携带,的氨基酸,之间,。,转位,：,是肽酰,tRNA,从,核糖体的,A,位进入,P,位，,同时，,mRNA,向,前移动,三,个核,苷,酸。,转,位,的结,果,使,空,载,tRNA,离,开,P,位点,，,从,而,使,新,的肽酰,-,tRNA,可,以进入,P,位，这,时,核糖体,A,位点,空,出，从而使下一个,aa,tRNA,进入,A,位。,转,位,作用使氨基酸,不,断,的,加,到,生,长,的肽链,上,，,3、转位：,（1）、转位的过程：,EF-G,是细胞,中的一,种,主,要,成,分,；,达,到,每,核糖体,1,拷贝,(,每细胞,20,000,分,子,),。,EF,G,帮助转位,需要水解,GTP,。但,GTP,水解并不是转位所必须的，,EF,G,离开核糖体,需要水解,GTP,核糖体,不,能,和,EF-,Tu,、,EF-G,这,两,个因子同,时,结合。,（2）、转位需要在延伸因子：EFG的帮助下实现：,EF-G的特点：,总结：转位的过程,转位包括三种运动:,空载的,tRNA,离开,P,位。,肽基,tRNA,由,A,位移到,P,位,核糖体沿,mRNA,的,53,方向移动一个密码子的距离。,该过程也,需要,EF-G,GTP,。的帮助。,总结：原核生物肽链的延伸,（二）、真核生物肽链的延伸,1、,进位,：进位因子,eEF-1,负责,携带,氨酰,-tRNA,进入核糖体，这个反应同,样,涉,及,到,GTP,中,高,能键的,裂,解,。它与它在,原,核,生物,中的,对,应蛋白质,(EF-Tu),有同,源,性。,当,eEF-1,GTP,被,水,解,后,，在因子,eEF-1,的作用下,，,eEF-1,又,会,变为,活性,形,式,。,3、,转位,：在,真,核,生物,中与,EF-G,对,应的,是,eEF-2,，它的,功,能是,依赖,GTP,水,解,的移,位,酶,(Translocase)。,2、,转肽,：该过程与原核生物类似。,三、肽链合成的终止,UAG,称为,琥珀,密码子,(Amber,codon,),；,UAA,称为,赭,色,密码子,(Ochre,codon,),；,UGA,称为,蛋白石,密码子,(Opal,codon,),。,（一）、原核生物肽链合成的终止：,1、三个终止密码子：,在,细菌,基因中，,UAA,是,最,常,用的,终止,密码子,，,UGA,比,UAG,常,用。,（,UAAUGAUAG),；,UAA,的终止效率是最高的。,2、,释放,因子,：RF1；RF2；RF3：,RF-1,识别,UAA,和,UAG,；,RF-2,识别,UAA,和,UGA,。,发挥作用条件,：这些因子作用,于,核糖体,A,位点,，,并且,需要,P,位点,的,多,肽酰,-,tRNA,存,在。,RF3,帮助,RF1,和,RF2,从,核糖体,上,解离下,来,。,RF3,是,一,种,GTP,结合蛋白,。,UAA,RF,1,or RF,2,终止密码子,3、终止过程：,RF1,和,RF2,识别终止,密码子,并,激活,核糖体的水解酶活性，,使,之,水,解肽酰,-tRNA,。,将,多,肽链,从,tRNA,上,剪,切,下,来,。,真核细胞多肽合成的终止只有一种释放因子,eRF,，,可识别,3,种终止密码子。,（二）、真核生物蛋白质合成的终止：,蛋白质合成总结,需很多酶和辅助因子参加。,需很多酶和辅助因子参加。,折叠和加工,终止密码,eRF,GTP,终止密码,RF-1,RF-2,RF-3,GTP,肽链的终止和释放,EF-1，EF-1r，GTP,肽酰转移酶,EF-2，GTP,EF-Tu，EF-Ts,GTP,K,+,肽酰转移酶,EF-G，GTP,肽链的延长,（1）氨酰tRNA的结合,（2）肽键的形成,（3）位移,起始密码,Met-tRNA,i,Met,eIF-1eIF-6,GTP,ATP,起始密码，SD序列fMet-tRNA,IF-1,IF-2,IF-3,GTP,肽链起始,氨酰tRNA合成酶，ATP，Mg,2+,氨酰tRNA合成酶，ATP，Mg,2+,aa的活化,真核生物所需因子,原核生物所需因子,过程,蛋白质生物合成所需的能量：,若要合成100个aa组成的肽链要消耗多少能量？,原核生物,aa活化：1ATP（2个 键）,起始：1GTP（1个 键）,延长：2GTP（2个 键）,终止：1GTP（1个 键）,P,P,P,P,