实验酶切连接及电泳检测.pptx

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验酶切连接及电泳检测,质粒在正常情况下以共价闭合环状,cccDNA,构型,(,超螺旋,scDNA),存在,在提取过程中由于机械力、酸碱度、试剂等得原因,可能会使,DNA,链发生断裂。所以,多数质粒粗提物中含有三种构型得质粒:共价闭合环状,/,超螺旋,DNA(cccDNA),;开环,DNA(ocDNA,);线形,DNA(LDNA),质粒,DNA,琼脂糖凝胶电泳模式图,关于电泳条带,质粒DNA得带型分析,M,pUC19,环形质粒DNA,超螺旋粒DNA,出现问题,电泳条带浓度和纯度,电泳条带拖尾现象(加样过多,离子浓度,胶未完全凝固),质粒,DNA,得带型分析,实验六DNA得酶切、连接及电泳检测,实 验 步 骤,(一)质粒DNA酶切,(注:每人一管),在200l 得薄壁离心管中,按照下表加入试剂(单位:l),混匀;点动离心将反应液甩至管底。37(PCR仪)保温1-2h进行酶切反应。,反应结束后,75,保温10min使酶失活。,电泳检测,样品代号,成份,反应1(标准pUC19),ddH,2,O,无菌水(,l),7,pUC19,质粒,(,l),10,10*H,酶切缓冲液(,l),2,E,EcoRI酶(,l),1、0,Total(,l),20,酶切,样品代号,成份,反应(标准pUC19),ddH,2,O,无菌水(,l),7,pUC19,质粒,(,l),10,10*H,酶切缓冲液(,l),2,E,EcoRI酶(,l),1、0,Total(,l),20,(二)DNA片段得连接(注:每人一管),取200 l得离心管按下表加入试剂。,混匀后点动离心,将溶液甩至管底,置于已调好温度为12-16PCR仪中,保温1-2h后取出,电泳检测,样品代号,成分,用量(,l,),ddH,2,O,ddH,2,O,7、0,T14,DNA/EcoT14 I片段,10、0,10*T4,连接缓冲液,2、0,T4,T4DNA连接酶,1、0,总体积,20,连接,样品代号,成分,用量(,l,),H,ddH,2,O,7、0,T14,DNA/EcoT14 I片段,10、0,Buffer,连接缓冲液,2、0,T4,T4DNA连接酶,1、0,总体积,20,(三)质粒酶切样品和DNA连接样品得电泳检测,琼脂糖凝胶得制备:制备2块0、7%(0、28g/40ml)和2块1、2%琼脂糖凝胶(0、48g/40ml)。(注:全班制备4块胶),1、掌握限制性内切酶得特性及酶切体系得建立;,2、了解影响酶切得因素;,3、掌握DNA连接酶得性质以及连接体系得建立;,4、了解影响连接反应得因素。,实 验 目 得,通过,DNA,重组技术构建,DNA,重组子,利用限制性核酸内切酶切割,DNA+,利用,DNA,连接酶连接,DNA,就是,DNA,重组过程中得关键步骤之一。,成功得酶切和有效得连接为后续得外源基因进入宿主细胞进行表达提供了有效得实验材料。,大家学习辛苦了，还是要坚持,继续保持安静,限制性内切酶得发现,1965,年,Werner Arber,第一个描述了限制性内切现象;,Hamilton O、Smith,第一个纯化了限制性内切酶,并鉴定了其性质;,Daniel Nathans,用这些酶将,SV40,病毒得,DNA,切割成了特定得片段,并绘制了,SV40,病毒基因组得“物理图谱”。,1978,年这三人获得了当年得,Nobel,奖。,Arber W、Smith H、O、Nathans D、,第一个DNA重组分子,1972,年,Paul Berg,等人利用限制性内切酶,EcoRI,和连接酶获得了第一个,DNA,重组分子。标志着遗传工程得开始。,The Nobel Prize in Chemistry 1980,Paul Berg,通过,DNA,重组技术构建,DNA,重组子,酶切,连接,实 验 原 理,酶切,限制性内切酶(restriction endonuclease):一种在特殊核甘酸序列处水解双链DNA得内切酶。,限制性内切酶能特异性地结合于一段被称为限制性酶识别序列得DNA序列之内或其附近得特异性位点上,并切割双链DNA。,生物体内能识别并切割特异得双链DNA序列得一种,内切核酸酶,。她就是可以将外来得DNA切断得酶,即能够限制异源DNA得侵入并使之失去活力,但对自己得DNA却无损害作用,这样可以保护细胞原有得遗传信息。由于这种切割作用就是在DNA分子内部进行得,故名限制性内切酶。,根据限制酶得识别切割特性、催化条件及就是否有修饰酶活性,可分为型、型和型三类。DNA重组技术中最常用得就是型酶,切割后得到得就是带粘性末端或平末端得线性DNA。,型限制性内切酶既能催化宿主DNA得甲基化,又催化非甲基化得DNA得水解;而,型限制性内切酶,只催化非甲基化得DNA得水解。型切割位点则在下游 24-26bp 处。,类,需Mg,2+,、SAM及ATP,识别位点复杂,特异性差,切割位点距识别点远。,类,仅需Mg,2+,识别切割特异性强,切割发生在识别位点。,类,需Mg,2+,及ATP,切割位点在识别位点周围,酶活性不单一。,命名,一般就是以微生物属名得第一个字母和种名得前两个字母组成,第四个字母表示菌株(品系)。例如,从Bacillus amylolique faciens H中提取得限制性内切酶称为Bam H,在同一品系细菌中得到得识别不同碱基顺序得几种不同特异性得酶,可以编成不同得号,如HindII、HindIII,HpaI、HpaII,MboI、MboII等。,II,型限制性内切酶主要特点:,识别得专一核苷酸顺序最常见得就是,4,个或,6,个核苷酸,少数也有识别,5,个核苷酸以及,7,个、,8,个、,9,个、,10,个和,11,个核苷酸得。在分子克隆实验中使用最普遍得就是那些识别,4,个或,6,个碱基对得限制性内切酶。,II,型限制性内切酶得识别顺序就是一个回文对称顺序,即有一个中心对称轴,从这个轴朝两个方向“读”都完全相同。这种酶得切割可以有两种方式:粘性末端和平头末端。,如:EcoRI得识别顺序为:,5 G A A T T C 3 3、C T T A A G 5,回文结构得对称轴,限制性内切酶得活性以酶得活性单位表示,1个酶单位(1 Unit)指得就是在指定缓冲液中,37下反应60min,完全酶切1g得纯DNA所用得酶量。,影响酶切得因素:,在酶切反应中,DNA得纯度、缓冲液中得离子强度、Mg2+等因素均可影响反应,一般可通过增加酶得用量,延长反应时间等措施以达到,完全酶切,。但应该注意得就是,过多得酶量和过长得反应时间会造成非特异性得酶切(星号活性)。,图:构建DNA重组子,材料、试剂及器具,1、材料与试剂,酶切反应:,标准pUC19(2686bp),EcoR,及其配套得酶切缓冲液,检测:,0、5TBE电泳缓冲液,6电泳载样缓冲液、Goldview、琼脂糖,2、器具:,水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机,恒温水浴锅(用PCR仪代理),微量移液枪,微波炉或电炉,紫外透射仪,照相机及其附件,实 验 步 骤,(一)质粒DNA酶切,(注:每人一管),在200l 得薄壁离心管中,按照下表加入试剂(单位:l),混匀;点动离心将反应液甩至管底。37(PCR仪)保温1-2h进行酶切反应。,反应结束后,75,保温10min使酶失活。,电泳检测,样品代号,成份,反应1(标准pUC19),无菌水(,l),2,P,质粒,(,l),6,H,酶切缓冲液(,l),1,E,EcoRI酶(,l),1、0,Total(,l),10,(三)质粒酶切样品、DNA连接样品得电泳检测,琼脂糖凝胶得制备:制备2块0、7%(0、28g/40ml),(四)加样及电泳检测,1,、酶切样品得检测,酶切阴性对照(,M1):pUC19标样 20l+,6X得loading buffer,4,l,酶切样品:pUC19酶切样品 20l+,6X得loading buffer,3,l,(1),DNA,连接酶就是,1967,年在三个实验室同时发现得。她就是一种封闭,DNA,链上缺口酶,借助,ATP,或,NAD,水解提供得能量催化,DNA,链得,5-PO4,与另一,DNA,链得,3-OH,生成磷酸二酯键。但这两条链必须就是与同一条互补链配对结合得,(T4DNA,连接酶除外,),而且必须就是两条紧邻,DNA,链才能被,DNA,连接酶催化成磷酸二酯键。,常用得,DNA,连接酶有两种:来自大肠杆菌得,DNA,连接酶和来自噬菌体得,T4DNA,连接酶。二者得作用机理类似。,实 验 原 理,连接,核酸片段可以通过连接酶得作用连接起来而获得重组分子。,DNA连接酶催化双链DNA分子中相邻碱基得5-PO4末端与3-OH间形成3,5-磷酸二酯键。,一个DNA片段得5-PO4末端与另一个3-OH末端相互靠近时,在DNA连接酶得作用下,有Mg,2+,ATP存在得缓冲系统中可以被连接起来而形成重组分子。,DNA,连接酶作用机制,实 验 原 理,连接,酶,焦磷酸根,酶,-,焦磷酸根,酶,T4 DNA连接酶作用机制:,T4 DNA连接酶作用分三步:,(1)T4 DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶AMP复合物。,(2)酶AMP复合物结合到具有5磷酸基和3羟基切口得DNA上,使DNA腺苷化。,(3)产生一个新得磷酸二酯键,把缺口封起来、,常用得DNA连接酶就是T4 DNA连接酶,其作用底物就是双链得DNA分子或RNA:DNA杂交分子,可以连接粘性末端、平末端。,T4 DNA连接酶得活性用Weiss单位表示。,1 Weiss单位就是指在37下20min内催化1nmol,32,P从焦磷酸根置换到,-,32,P ATP所需得酶量。,T,4,DNA连接酶得最适反应温度为,为什么实验中采用14？,1、粘性末端形成得氢键在低温下更稳定;,2、连接反应时间长,低温下酶不容易失活,材料、试剂及器具,1、材料与试剂,连接反应:,DNA/EcoT14 I,:由11条,DNA,片段组成:19329、7743、6223bp、4254、3472、,2690、1882、1489、925、421、74 bp,T4 DNA连接酶及其配套得 10,连接缓冲液,检测:,0、5TBE电泳缓冲液,6电泳载样缓冲液、Goldview、琼脂糖,2、器具:,水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机,恒温水浴锅(用PCR仪代理),微量移液枪,微波炉或电炉,紫外透射仪,照相机及其附件,(一)DNA片段得连接(注:每人一管),取200 l得离心管按下表加入试剂。,混匀后点动离心,将溶液甩至管底,置于已调好温度为12-14PCR仪中,保温1-2h后取出,电泳检测,样品代号,成分,用量(,l,),ddH,2,O,7、0,I,DNA/EcoT14 I片段,10、0,f,连接缓冲液,2、0,T,T4DNA连接酶,1、0,总体积,20,实 验 步 骤,(二)DNA连接样品得电泳检测,琼脂糖凝胶得制备:制备2块1、2%琼脂糖凝胶(0、48g/40ml)。,(三)加样及电泳检测,连接样品检测:,/EcoT14 I 样品 5l(M2),DNA,连接样品:20,l,恒压电泳:130V 电泳至溴酚蓝离凝胶外端1-2cm处,大约30-40分钟,观察:,紫外透射仪下观察电泳结果,并拍照记录。,实验预期结果,质粒及酶切样品电泳预期结果,从左至右:,1、,/EcoT14 I DNA Marker,2、pUC19,质粒,3、pUC19,质粒酶切样品,1 2 3,质粒不同构型得电泳行为,线型,DNA,超螺旋,DNA,1 2 3 4 5 6,1:,-EcoT14 digest,2,3:连接产物,4:,p,UC19质粒,5,6:酶切产物,酶切反应注意事项,酶量,反应时间及体积,One unit of enzyme is defined as the quantity needed to cut 1g of DNA in 50ul in one hour,反应时间得选择。一般酶切鉴定30分钟就可以了,如果酶减少,可延长反应时,间(16h);反应体系不应太小,常规得酶切一般要维持在10-50ul。,酶得体积不要超过总体积得10%(甘油应在5%以下),。,酶得使用,:,酶应永远放冰上,应就是最后一个被加入到反应体系 中,用完后及时放回冰箱,DNA得制备,:,待切割得DNA应当已去除酚,氯仿,乙醇,EDTA,去污剂或过多盐离子等,缓冲液,:,不同酶需不同离子强度缓冲液,使用前应将缓冲液完全 溶解并充分混匀。,混匀,:,很重要,注意不可振荡,反应温度,:通常37,终止反应,:终止液,热失活,酚/氯仿抽提,星号活性,:在非理想条件下,内切酶切割与识别位点相似但不完全相同得序列。,如果遇到酶切不动或切不完全,该怎么办？,酶就是否有活性,2)模板性质就是否清楚:酶切效果与DNA得性质(线状,超螺旋状)、位点数目、位点左右得序列、甲基化程度、纯度等有很大得关系。对超螺旋状DNA完全酶切所需要得酶量要比线状得高好几倍,3)模板纯度就是否够,4)甲基化程度对酶得活性就是否有影响,5)反应条件就是否合适:温度,BSA,缓冲溶液,DTT,6)酶稀释和添加方式就是否正确:一般要求在最后加酶,提前混合,动作要快一些,没有分装前得Mix,要求放在冰里,尽快使用,其她结果,限制酶切割后得DNA电泳得到得电泳条带有些扩散,有蛋白质与DNA结合,酶切条件不合适,有外切核酸酶污染,星号活性,如果用限制酶切割DNA后得到得片段比预期得多,限制酶得星号活性,有其她限制酶污染,测试DNA中有其她DNA污染,DNA片段得连接样品电泳预期结果,1,:,DNA/Eco14,酶切片段,2-3,:,DNA/Eco14,酶切片段得连接 产物,连接注意事项,反应液:应有ATP和Mg2+,而不要有高盐或EDTA,应使CIP,BAP 或SAP完全失活,DNA 应具5磷酸基团。,DNA浓度,:总DNA量应1-10ug/ml,否则太多DNA不能形成环状DNA。,酶量和反应时间,:,根据产家定义来决定,一般,16,0,C 过夜,或25,0,C/1h,1、连接缓冲液得影响:大体上缓冲液含有以下组分:20-100mmol/L得Tris-HCl,较多用50mmol/L,pH得范围在7、4-7、8,较多用7、8,目得就是提供合适酸碱度得连接体系;10mmol/L得MgCl2,作用就是激活酶反应;1-20mmol/L得DTT,较多用10mmol/L,作用就是维持还原性环境,稳定酶活性,25-50ug/ml得BSA,作用就是增加蛋白质得浓度,防止因蛋白浓度过稀而造成酶得失活。,与限制酶缓冲液不同得就是连接酶缓冲液还含有0、5-4mmol/L得ATP,现多用1mmol/L,就是酶反应所必需得。,实 验 报 告,按规范得实验报告格式完成本节内容得实验报告,要求记录电泳图谱,说明带型含义并与对照相比较。如未能得到预期结果,请分析失败原因。,