专题一-兽药的毒理学试验和安全性评价.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,专题一 兽药的毒理学试验和安全性评价,一般毒性试验:,急性毒性试验,亚慢性毒性试验,长期毒性试验,特殊毒性试验:,“三致”试验,致畸、致突变、致癌,1,第一节 一般毒性试验,一、急性毒性试验,(1)经口或注射给药的急性毒性试验,(2)经皮给药的急性毒性试验,目的：,（1）求出受试物的半数致死量（,LD,50,）。,（2）,阐明受试物急性毒性的剂量-反应关系与中毒特征，为急救治疗措施提供依据。,（3）为受试物的毒性作出初步判断，为其它毒性试验设计提供依据。,2,经口或注射给药的急性毒性试验,1.动物,小鼠（体重1822,g）、,大鼠（体重180200,g）,或其他敏感动物。应注明动物的品系。每组小鼠不,少于10只、大鼠不少于6只，雌雄各半，雌性应未,产无孕。,2.供试药物的配制,一般用水为溶剂,将药物配成一定浓度的溶液.,3,3.给药方式与最大体积,灌胃法:,一次最大,灌胃,量,1.0,ml/,只(小鼠),4.0ml/,只(大鼠),腹腔注射:,一次最大,注射,量 1.0,ml/,只(小鼠),3.0ml/,只(大鼠,),4.剂量与分组,预试验,全部致死的最小剂量,LD,100,和全部存,活的最大剂量,LD,0,正式试验,5-7个剂量组,组间剂量呈等比级数,其比值为1.2-1.4,.,4,5.观察指标,动物一般健康状况，中毒表现和死亡过程。,时间：7天。,死亡动物：大体剖检、病理组织学检查（必要时）,6.,LD,50,计算,寇氏法 计算供试药的,LD,50,值及其95%可信限范围。,7.结果判定,大鼠一次经口,LD,50,在1,mg/kg,以下为极毒，150,mg/kg,为剧毒，50 500,mg/kg,为中等毒，500 5000,mg/kg,为低毒，,5000,mg/kg,以上者为实际无毒。,5,小鼠腹腔注射敌百虫,LD,50,计算表,组别,剂量,(,mg/kg),对数剂量,(,Xi),实验动,物数(,ni),死亡动物,数(,ri),死亡率,(,pi),存活率(,q),1,300,2.4771,10,0,0,1,2,360,2.5563,10,2,0.2,0.8,3,432,2.6355,10,5,0.5,0.5,4,518,2.7143,10,7,0.7,0.3,5,622,2.7938,10,10,1.0,0,合计,-,-,-,ri24,Pi2.4,q2.6,6,3.给药方式,脱去动物背部脊柱两侧毛发（不得损伤皮肤），脱毛,后24小时检查皮肤，如无损伤才能进行试验。将供试药,物均匀地涂敷于脱毛区，不应少于动物体表面积的10%，,用塑料纸和两层纱布覆盖，再用胶布或绷带固定，以防,脱落和动物舔食。敷药24小时。试验结束后，用温水或,适当溶剂清除残留供试药。,大鼠可采用浸尾方法给药,。,9,4.剂量与分组,正式试验前，用少量动物做预备试验，根据24,小时内动物死亡情况，估计,LD,50,的可能范围，以,确定正式试验的剂量。一般分为4个剂量组，组间,剂量呈等比级数。其比值为：,1:1.5-3.0,。若用赋,形剂，需设赋形剂对照组。,10,5.观察指标,观察动物的全身中毒表现和死亡情况，观察,时间为一周。若给药4天后仍有动物死亡时，仍,需继续观察一周，对死亡动物应做大体剖检，必,要时进行病理组织学检查。,11,6,.,结果判定,兔涂皮,LD,50,在5,mg/kg,以下为极毒，544,mg/kg,为剧毒，44 350,mg/kg,为中等毒，,350 2180,mg/kg,为低毒，2180,mg/kg,以上者为,实际无毒。,12,二、亚慢性毒性试验,确定外来化学物质在动物1/10左右的生命时间,内，反复多次接触后有无引起损害的观测过程。,又称短期试验、亚,急性毒性试验（,Subchronic,toxicity test）。,目的：1.毒性确定,2.靶器官,3.慢性毒性试验依据,13,试验方法,1.动物,一般选用大鼠(100200,g),或小鼠(1520,g)。,有条件时，采用供试药物的靶动物鸡等。外购动物需饲养一周后才能供试验用。,14,2.试验周期,临床用药期（天）,毒性试验给药期（天）,13,14,7,28,30,90,30天以上,6个月,15,3.给药方式,试验周期,给药途径,14天,大鼠、小鼠,灌胃,鸡,药丸,28天以上,混饲 自由采食,饮水不限,16,4.剂量与分组,大鼠 20只/组，雌雄各半,对照组,低剂量组,高于有效量，不出现毒性反应,中剂量组,高剂量组,部分动物出现毒性反应或死亡,但死亡数不超过20%,17,5.观察指标,分六大项，具体指标为：,（1）健康状况,每天,（2）体重，饲料消耗,2-3次/周,（3）血液学检查,定期,（4）血液生化学检查,定期,（5）肝、肾绝对重量和脏器指数,试验结束时,（6）剖检、组织病理学检查,试验结束时,18,6.结果处理,试验数据 方差分析或,X,2,病理变化 照片,写出评价报告,19,三、长期毒性试验,1.概念,外来化学物质在动物生命期的大部分时间或,终生接触于机体时所引起的损害作用，称为长期,毒性作用或慢性毒性作用。,确定外来化学物质这种慢性毒性作用的动物,试验观察方法，称为长期毒性试验。,20,2.目的,观测长期反复摄入低剂量的受试物，可能对,机体造成的损害、严重程度、停药后的发展和恢,复情况，为临床试验提供依据。,3.试验方法,（1）动物,两种动物（啮齿类和非啮齿类），目前要求,用一种啮齿类动物进行全面系统的试验。,21,（2）剂量分组,试验组：45个，设高剂量组12个，中剂量组12个，低剂量组12个。,以,LD,50,的1/10、1/50、1/100、1/1000剂量分组。,对照组：1个,（3）染毒方式,混饲或饮水，由动物自由进食。或涂擦皮肤。,22,（4）观察指标,一般情况,：健康、生长发育、进食量，特别是体重。,生物化学指标,：肝、肾功能。,血液学变化,：,Hb，WBC，RBC，,病理学检查,：病理解剖和病理组织学变化。,（5）结果评价,参考亚急性毒性试验。,23,第二节 特殊毒性试验,致突变:,体外:（1）艾母氏(,Ames),试验(,必做,),（2）哺乳动物培养细胞染色体畸变（,CHO、CHL,）,选做,体内:（3）微核试验(,必做,),（4）精子畸形试验,选做,（5）小鼠睾丸精原细胞染色体畸变试验,选做,（6）显性致死试验,若（4）、（5）任一项为阳性，必做（6）,24,致畸:,（1）传统致畸试验(必做)一般兽药必做,（2）喂养繁殖毒性试验,（3）喂养致畸试验,（2）、（3）饲料药物添加剂必须增做,25,一、,艾母氏(,Ames),试验方法,1.原理,组氨酸缺陷型（即突变型）鼠伤寒沙门氏菌在缺乏组氨,酸的培养基上不能生长，但在加有致突变原的培养基上培,养，则可使突变型产生回复突变成为野生型，即恢复合成,组氨酸的能力，于是就能在缺乏组氨酸的培养基上生长，,根据其生长菌落的数量判断受试物是否具有致突变性。,26,野生型（能合成组氨酸）,缺乏组氨,酸的培养基,加有致突变原,的培养基,组氨酸缺陷型（即突变型）,鼠伤寒沙门氏菌,。,。,。,27,2.菌种,组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌,TA97a、TA98、,TA100、TA102,四个标准株。,3.剂量分组,每次试验要求4-,-5,个剂量组，每个剂量做三个平行平皿。高剂量以不抑菌为原则。,液态受试物：0.05-50,ul/,平皿,固态受试物：0.1-1000,ug/,平皿，最高剂量可达5000,ug/,平,皿。,选定后剂量的药物应配制成适当浓度,体积：100,ul,或200,ul/,皿,。,28,4.溶剂,水,5.对照物,每次检测均需要,阳性对照：已知的阳性药物,阴性对照：溶剂,加,S9,混合液时要同时作不加,S9,混合液的对照平皿,6.,S9,混合液,如果受试物可能是经动物体酶系统活化代谢后才具有,致突变作用，则试验过程需要在培养基上同时加入哺乳,动物的肝微粒体（,S9,混合液），使受试物被活化而呈现,致突变作用。,29,S9,制备,选体重200,g,左右成年雄性大鼠，经诱导剂诱,导后宰杀（处死前12小时禁食）。在低温条件下，,无菌操作取出肝脏，用,KCI,液淋洗后置匀浆器中,制成匀浆。低温离心后分装，保存于液氮或,80,冰箱。,30,7.试验步骤,TA97a TA98 TA100 TA102,37,水浴,振荡培养,活菌数不得少于12,x 10,9,/ml,增菌培养液,增菌培养液,增菌培养液,增菌培养液,31,试验步骤,受检物 +菌液 +,S9,混合液 或磷酸盐缓,（0.1-0.2,ml）,（0.1,ml）,（0.5,ml）,37,水浴,振荡培养20,imns,加入45,顶层,培养基2,ml,混匀,37,培养48,h,无菌小试管,含底层,培养基,的平皿,32,8.结果评价,受试组的菌落数大于2倍自发回变数，并有剂,量反应关系和重现性，判为诱变阳性。,33,二、微核试验,原理,：,骨髓细胞,染色体,经,诱变物,作用，发生突变后出现断裂，并有部分断片在有丝分裂后期不移向两极，在有丝分裂的末期不进入分裂的细胞核中，因而,存,留于细胞浆中，形成一个或几个圆形至杏仁状的结构，并存留一定时间。由于这种圆形结构比普通细胞核小，故称,微核（,micronucleus,）,。,34,图示,原理：,诱变物,嗜多染红细胞,微核直径相当于红细胞直径的1/201/5。,35,1.动物,成年健康小鼠（品系），随机分为受试组和对照组。,10只/组，雌雄各半。,2.受试物的处理,将受试物溶于适宜的溶剂中,以0.1-0.2,ml/10g,体重的给,药体积配制成适当的浓度。,3.给药方式,给药途径：与临床用药途径相同。内服时需灌胃。,给药剂量：以,LD,50,为依据，设三个剂量组。,高剂量组,LD,50,的0.8-0.5；低剂量组,LD,50,的0.05-0.1,并设阴性对照和阳性对照组，阳性对照物可选用已知的,能诱发微核阳性的诱变剂。,36,4.试验操作,一次给药,：24，48，72小时取样制片。,二次给药,：第二次给药后的6，24小时取样制片。,处死小鼠，将股骨骨髓洗入离心管，离心，常规涂片。,姬姆萨染色，镜检。,5.,镜检,计数：,1000 个嗜多染红细胞（,PCE）/,片,求出：嗜多染红细胞/正染红细胞（,NCE）,必要时，丫啶橙染色，荧光显微镜分析计数。,37,6.,结果评价,将数据列表，分别列出嗜多染红细胞数，微核数及,PCE/NCE,之比。所得结果用,t,检验进行数据分析，经重复,试验,P0.01,并有剂量反应关系时，判为阳性。,38,三、,异常毒性检查,（一）目的,将一定剂量的供试品溶液注入小鼠体内,或口服给药，在规定时间内观察小鼠的死,亡情况，以判定供试品是否符合规定的一,种方法。,39,（二）实验动物,小鼠 健康无伤，体重1720,g。,做过本实验的小鼠不能重复使用。,40,（三）检验方法,取5只小鼠，按药物的给药途径，每只小,鼠分别给予供试品溶液0.5,ml。,静脉注射：,尾静脉注入供试品溶液，注射时,间一般为45秒，规定缓慢注射的药品可延,长至30秒。,皮下注射：,可见注射部位皮下出现泡状隆起,。,41,（四）结果判定,除另有规定外，5只小鼠在给药后48小时,内不得死亡。如有死亡，另取体重1720,g,小鼠10只复测，全部小鼠在48小时内不得,有死亡，否则，判为不合格。,42,第三节 制剂的安全性评价,一、热原反应试验,二、溶血性检查,三、局部刺激性试验,1.家兔点眼法,2.家兔股四头肌法,四、过敏性试验,五、降压物质检查,43,一、热原反应试验,1.概念,是指某些微生物的尸体及其增殖时的产物,主要,是细菌的一种内毒素。,大多数细菌都能在增殖时产生热原，霉菌与酵,母菌也能产生热原。,热原随注射液进入动物体后，轻则能引起体温,升高，严重的虚脱死亡。,44,检查对象：,注射用原料,溶媒,注射液,注射器,45,注射剂热原污染的途径,1.溶媒,注射用水,2.原料,适宜微生物生长、生物制品,如葡萄糖、水解蛋白、氯化钠,3.用具或容器污染,4.生产过程中污染,及时灭菌，缩短时间,46,热原的性质,1.耐热性,60,1小时不受影响;180-200,干热2小时或250 30,mins,彻底破坏,2.,滤过性,过细菌滤器;不能过透析膜,3.水溶性,不溶于有机溶媒,4.不挥发性,但可随水蒸气带入蒸馏水,5.被吸附性,活性炭,硅藻土,树脂等,47,除去热原的方法,1.防止污染,药液、溶媒（24小时内,ddH,2,O）,2.清除热原,容器用强酸、强碱、干热,3.吸附,0.1-0.2%活性炭；多层石棉板,4.超声波,破坏热原,5.氧化剂,高锰酸钾、双氧水,48,2.热原检查法,本法系将一定剂量的供试品，静脉注射入家兔体内，在规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供试品中所含,热原,的限度是否符合规定。,49,(1)选符合规定的家兔,1.,健康无伤，体重1.73.0,kg，,同一来源、同一品系，雌兔无孕。,2.,1兔1笼，标兔号，经7日同一饲养条件饲养，测温条件相同。在此期间，体重应不减轻，精神、食欲、排泄等不得有异常,。,50,(2)试验前的准备,1、试验前12日，供试用家兔应处于同一温度的环境中，实验室与饲养室环境温度相差不得大于5。,51,2.室温应在1728，在试验全部过程中，应注意室温变化不得大于3，应避免噪音干扰。,3.家兔在试验前停食1小时并置于固定盒内，直至试验完毕。,52,4、肛温计插入深度约6,cm，,不得少于1.5,分钟，每隔30分钟测量体温1次，一般测,量2次，两次体温之差不得超过0.2，以,此两次体温的平均值作为该兔的正常体,温,。,53,5.,试验用的注射器、针头及一切与供试品溶液接触的器皿，应置烘箱中用250加热30分钟或用180加热2小时，也可用其他适宜的方法除去热原。,54,(3)检查方法,1.每个供试样品用家兔3只，在测定正常体温,(38.3-39.6),后15分钟内给药。,2.供试品注射的体积，按家兔体重不少于1,ml/kg，,不大于10,ml/kg，,体积在510,ml/kg,的溶液应在37,38预热后注射。,55,3.耳静脉缓慢注射，但每兔不超过3分钟。,4.给药后每隔30分钟测温1次，共测6次。,56,5、温差计算：,（1）以6次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔体温的升高温度。,（2）以6次体温中最低的一次减去正常体温，即为该兔体温的降低温度。,57,(4)结果判断,1.判断复试：,（1）初试3只兔中仅有1只体温升高0.6或0.6以上，或3只家兔升温均低于0.6，但升温的总数达1.4或1.4以上,应另取5只家兔复试。,58,（2）含有热原的供试品，一般在给家兔静脉注射后12小时出现升温高峰，当第3小时升温大于0.6时，宜复试后再作判断。,（3）3只家兔中有1只降温值小于0.6，或3只家兔中有2只降温值在0.450.55，应另取3只家兔复试。,59,2.判断合格,（1）初试3只家兔中，体温升高0.6以下，并且3只家兔升温的总数在1.4以下可判断为符合规定。,60,（2）复试5只家兔中，体温升高0.6或0.6以上的家兔数仅有1只，并且初复试合并，8只家兔的升温总数为3.5或3.5以下，可判断为符合规定。,61,3、判断不合格,（1）初试3只家兔中，体温升高0.6或0.6以上的家兔数有2只或3只，可判断为不符合规定。,62,（2）复试的5只家兔中，体温升高0.6或0.6以上的家兔数有2只或2只以上，可判断为不符合规定。,（3）初复试合并8只家兔的升温总数超过3.5，可判断为不符合规定。,63,二、中草药注射剂的质量检查,1.急性毒性,中草药注射剂的耐受量应为家畜临床用,量的100倍为安全，60倍以上者可慎用。,64,具体方法,取小鼠5 只，尾静脉或腹腔注射0.5,ml,药液，观察小鼠有无震颤、惊厥、四肢瘫痪、步态不稳、竖毛、呼吸抑制或死亡等反应。,一般观察48-72小时，如有死亡，应另取10只重做，不得有死亡。,65,2、溶血试验,含皂苷或鞣质或成分尚未十分明确的中草药注射液必须做溶血试验。,66,具体方法,（1）2%兔的红细胞生理盐水的配制,兔耳缘静脉采血1,ml，,置青霉素小瓶（西林,瓶）中，加玻璃珠搅拌除纤维蛋白，用生理盐水,离心洗涤至上清液澄清为止，然后配成2%混悬,液,。,67,（2）溶血试验设计表,试管号,1,2,3,4,5,6,7,被试药液,（,ml）,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0,0,生理盐水,（,ml）,2.4,2.3,2.2,2.1,2.0,2.5,0,红细胞液,（,ml）,2.5,2.5,2.5,2.5,2.5,2.5,2.5,蒸馏水,（,ml）,0,0,0,0,0,0,2.5,68,取洁净试管7支，按上表排列加入各种溶液，,第6管为阴性对照管，第7管为阳性对照管。各管,轻轻摇匀后，37恒温箱或水浴中保温（或25-,37 室温下），开始每隔15分钟，1小时后每隔1,小时分别观察1次，共3小时。,69,（3）结果判断,判定标准:,1.全溶血,:溶液澄明红色,管底无红细胞残留.,2.部分溶血:,溶液澄明红色或棕色,管底有少量红细胞残留.,3.无溶血:,红细胞全部下沉,上层液体无色,澄明.,4.凝集:,虽不,溶血,但出现红絮状物,振摇后不能分散.将凝,集物置于载玻片上,盖上盖玻片,从边缘滴加生理盐水,显微,镜下观察,红细胞散开者为假,凝集,反之为真凝集.,70,结果判定:,一般认为,第3管或第3管以前被试药液在30分钟内引,起溶血、,部分溶血,或出现凝集现象的，不宜作静脉注射,用；不溶血或出现假凝集现象的才可作注射用。,71,三、局部刺激性试验,1.家兔点眼法,取健康家兔1只，固定，观察眼结膜色泽和血管分布情况；然后将下眼睑拉成杯状，取被测试药液2滴（10,mg/ml）,滴入左眼结膜囊内，1分钟后放开眼睑，任药液自溢；右眼同样滴入生理盐水为对照。观察给药后30、60、90、120,mins,时结膜有无充血、水肿、畏光和流泪等现象。如无这些现象该药即为合格。本法适用于滴眼剂和其他黏膜用药刺激性的测试。,72,三、局部刺激性试验,2.家兔股四头肌法,本试验考察药物制剂，应用于局部组织后，是否引起,红肿、充血、肌肉变性或坏死等刺激反应，以确定该药物,制剂的局部试验是否符合规定。,方法,：家兔股四头肌法。选用健康、体重2,kg,左右的家兔2,只，分别于一侧股四头肌处以无菌操作方法注入受试制剂,2.0,ml；,另侧相应部位同法注入等容积的灭菌生理盐水作,为对照。48小时后处死家兔，解剖后取出股四头肌，纵向,切开，观察注射部位肌肉的刺激反应。,73,注射剂刺激反应评分标准,反应级数,刺激反应,0,给药部位无明显反应,1,给药部位轻度充血，直径在0.5,cm,以下,2,给药部位中度充血，直径在1.0,cm,以下,3,给药部位重度充血，红肿，肌肉有变性,4,肌肉褐色变性，坏死，直径在0.5,cm,以下,5,肌肉严重变性，出现大片坏死,74,结果判定,凡两只家兔的平均反应级数在2以下者，可供,肌注；如平均反应级数在23之间者应复试，或,结合其他项目考虑其临床试用问题。,75,四、过敏性试验,取体重250-350,g,豚鼠6只，隔日肌肉注射受试药液,0.2-0.5,ml，,共三次，然后分两组，每组3只。第一组首次,注射后的第14日由颈静脉注射受试品1-2,ml，,或腹腔注射,受试品2-3,ml。,第二组于首次注射后的第21天同样静脉或腹,腔注射受试品，并进行观察。观察注射后有无用爪搔鼻、,喷嚏、竖毛、抽搐、呼吸困难、大小便失禁、休克和死亡,等反应。如两组豚鼠均未出现明显的上述过敏现象，即可,以认为受试品不会引起过敏反应。,76,五、降压物质检查,药典中规定供注射用的脏器制剂和生化制,剂，须经过降压物质检查。,方法,：将一定量的受试品与一定量的组胺对,照品注射入麻醉猫（或狗）的静脉，以比较,两者引起血液下降的程度，从而判定受试品中降,压物质的限度是否符合规定。,77,