d5-酶学基础蛋白质工程.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,酶工程的概念,从应用目的出发研究酶，,在一定的生物反应装置中,利用酶的催化性质，,将相应原料转化成有用的物质。,是酶学和工程学相互渗透结合形成的一门新的技术科学，,是酶学、微生物学的基本原理与化学工程有机结合而产生的边缘科学,培养室,1920年，过氧化物酶高度纯化，酶活性很高，但是检测不到蛋白质，认为酶不是蛋白质？由于检测技术落后。,1926年，美国的Sumner从刀豆中得到脲酶结晶，证明酶具有蛋白质性质（1947年诺贝尔奖）,1960年，提出操纵子学说，酶生物合成的基本调节机制,1969 日本固定化氨基酰化酶，第一次将固定化酶成功地应用于工业生产。酶工程诞生,1970 美国的Smith 发现限制性内切酶（1979年诺贝尔奖）,1982年，RNA自我剪接功能（self-splicing），核酸类酶（ribozyme）,改变了酶的传统概念,酶是具有生物催化功能的生物大分子（蛋白质或RNA）,蛋白类酶（P酶）,核酸类酶（R酶）,蛋白类酶的分类：,1氧化还原酶,2转移酶,3水解酶,4裂合酶,5异构酶,6连接酶（合成酶）,1氧化还原酶(Oxidoreductase),包括脱氢酶(Dehydrogenase)、氧化酶(Oxidase)、过氧化物酶、氧合酶、细胞色素氧化酶等,2转移酶(Transferase),包括酮醛基转移酶、酰基转移酶、糖苷基转移酶、含氮基转移酶等,3水解酶(Hydrolase),脂肪酶、糖苷酶、肽酶等，水解酶一般不需辅酶,4裂合酶(Lyase),这类酶可脱去底物上某一基团留下双键，或可相反地在双键处加入某一基团。,5异构酶(Isomerase),此类酶为生物代谢需要对某些物质进行分子异构化，分别进行外消旋、差向异构、顺反异构等,6连接酶（合成酶）(Ligase or Synthetase),这类酶关系很多生命物质的合成，其特点是需要三磷酸腺苷等高能磷酸酯作为结合能源，有的还需金属离子辅助因子。分别形成C-O键（与蛋白质合成有关）、C-S键（与脂肪酸合成有关）、C-C键和磷酸酯键。,核酸类酶的命名,分子内催化（in cis）的R酶,分子间催化（in trans）的R酶,7.核酸酶（催化核酸）Ribozyme,核酸酶是一类特殊的RNA，能够催化RNA分子中的磷酸酯键的水解及其逆反应。,二、酶的催化共性,酶参与生物化学反应，它能降低反应的活化能（分子参与化学反应时所需要的最低能量），,加快生化反应的速率，,酶在反应过程中，其主体结构和离子价态可以发生某种变化，,但在反应结束时，一般酶本身不消耗，并恢复到原来状态。,专一性强,酶催化反应有很高的选择性，一种酶仅能作用于一种物质或一类结构相似的物质进行某一种反应，这种特性称为酶的专一性或选择性。,绝对专一性,：,一种酶只能催化一种化合物进行一种反应，,天冬氨酸裂合酶,相对专一性：一种酶能够催化一类具有相同化学键或基团的物质进行某种类型的反应,键专一性：酯酶,基团专一性：胰蛋白酶,反应专一性：一种酶只能催化某化合物在热 力学上可能进行的许多反应中的一种反应,底物专一性,：,一种酶只能催化一种底物,立体专一性：一种酶只能作用于所有立体异构体中的一种,效率高,酶催化的转换数,每个酶分子每分钟催化底物转化的摩尔数,一般10,3,min,-1,，碳酸酐酶高达3.6x10,7,min,-1,。,使反应活化能显著降低,作用条件温和,一般酶作用条件：常温、常压、pH值近中性,特殊酶,耐酸酶：胃蛋白酶pH=2-3,耐热酶：Taq酶95C,耐冻酶：极地微生物,优点：专一性强、催化效率高、作用条件温和,缺点：稳定性差、抗原性、游离酶只能一次性使用,酶的特性改良：发现自然界的新酶、酶分子修饰、固定化,A,B,A,+B+K,AB+K,E,a,0,E,2,AK+B,A,-,B,-,K,A,-,K,E,1,E,3,E,a,反应进程,能量,催化剂作用机理,A+B,AB,K,A+K AK,AK+B,AB+K,k,2,k,1,k,-1,酶催化反应历程,Michaelis-Menten,Briggs,Haldane,Henry,等人研究了酶催化反应动力学，并提出了酶促反应的历程如下：,他们认为酶(E)与底物(S)先形成中间化合物,ES,中间化合物再进一步分解为产物(P)，并释放出酶(E)，整个反应的速控步是第二步。,对酶催化反应过程的机理，得到大量实验结果支持的是活性中间复合物学说，该学说认为酶催化反应至少包括两步，首先是底物S和酶E相结合形成中间复合物ES，然后该复合物分解成产物P，并释放出酶E。,例如：酶反应,其反应机理可表示为,根据化学动力学，反应速率通常以单位时间、单位反应体系中某一组分的变量来表示。对均相酶的催化反应，单位反应体系常用单位体积表示。,反应的速率可表示为,r,s,：,底物,S,的消耗速率,（mol/Ls）,r,p,：,产物,P,生成速率,（mol/Ls）,v：反应体系的体积,（L）,n,s,、n,p,：底物,S,和产物,P,的质量,（mol）,t：,时间,（s）,根据质量作用定律，,P,的生成速率可表示为,：,速率控制步骤在反应动力学中是一个重要的概念。在一个多步骤的反应体系中，其中反应速率最慢的一步称为速率的控制步骤，并且控制步骤的速率决定了该反应的速率。,“拟稳态”假设,。,认为由于反应体系中底物浓度要比酶的浓度高得多，中间复合物分解时所得到的酶又立即与底物相结合，从而使反应体系中复合物的浓度维持不变，即中间复合物的浓度不再随时间而变化。,用稳态近似法处理,酶催化反应的速率方程,令酶的原始浓度为E,0,，反应达稳态后，一部分变为中间化合物ES，余下的浓度为E,米氏常数,K,M,当反应速率达到最大值,r,m,的一半时，,K,M,=S,。,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,V,m,0.0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,S,酶促反应速率与底物浓度的关系,1/2V,m,K,m,k,m,值是酶的特性常数，,代表反应速率为最大反应速率一半时的基质浓度，其单位为浓度单位。,它和酶的浓度无关，但和温度、,pH,等因素有关。,根据,k,m,值可以推断酶和底物的亲和力。如果酶的专一性不高，可催化几种底物发生反应时，,k,m,值最小的就表示酶与这一底物的亲和力最大，反之，则最小。,酶催化的反应级数的讨论,1.当底物浓度很大时，,S,K,M,，,r,=,k,2,E,0,，反应只,与酶的浓度有关，而与底物浓度无关，,对底物浓,度S呈零级,。,2.当,S,K,M,时，,r,=,k,2,E,0,S/,K,M,对S呈一级,。,3.当,S,时，,r,=,r,m,=,k,2,E,0,。,双倒数图解法求方程参数,下面的数学处理可以求出,K,M,和,r,m,重排得：,以 作图，从斜率和截距求出,K,M,和,r,m,双倒数图解法（,Lineweaver Burk,图解）,将MM方程取其倒数得到下式:,以 值对应于 作图：,双倒数法应用广泛，但有两个缺点：,1、选用基质浓度不宜等量增加，否则在作图时，点都会集中在纵轴附近，难于正确作图。基质浓度以选用,1.0,、,1.11,、,1.25,、,1.43,、,1.67,、,2.0,、,2.5,、,3.33,，,5,和,10,等为宜，这样倒数值几乎是等量递增的。,2、反应速率测定稍有误差，其倒数值误差必将扩大，特别是在低浓度基质测定时，引起的误差更大，这样将影响直线斜率，影响 r,max,及K,m,值,的测定。,影响酶催化作用的因素,底物浓度的影响,酶浓度的影响,在底物浓度较低的条件下,温度的影响,pH值的影响,抑制剂的影响,酶抑制剂：无机离子、小分子有机物、蛋白质等,可逆性抑制剂,竞争抑制,非竞争抑制,反竞争抑制,不可逆抑制剂,竞争性抑制,若在反应体系中存在有与底物结构相类似的物质，该物质也能在酶的活性部位上结合，从而阻碍了酶与底物的结合，使酶催化底物的反应速率下降。这种抑制称为竞争性抑制，该物质称为竞争性抑制剂。,竞争性抑制,主要特点,抑制剂与底物竞争酶的活性部位，当抑制剂与酶的活性部位结合之后，底物就不能再与酶结合，反之亦然。,在琥珀酸脱氢酶催化琥珀酸为延胡索酸时，丙二酸是其竞争性抑制剂。,抑制剂和底物竞争与酶分子结合,抑制剂与底物结构相似,随着底物浓度增加，抑制作用减弱,最大反应速度不变，Km增大,竞争性抑制图,又竞争性抑制剂时，同样底物浓度下，反应速率减小。Km增大，达到同样速率需多消耗底物。,一部分酶活性位点被竞争性抑制剂占据，不能使底物转化为产物。,非竞争抑制,若抑制剂可以在酶的活性部位以外与酶相结合，并且这种结合与底物的结合没有竞争关系，这种抑制称为非竞争性抑制。,此时抑制剂既可与游离的酶相结合，也可以与复合物,ES,相结合，生成了底物,酶,抑制剂的复合物,SEI,。,绝大多数的情况是复合物,SEI,为一无催化活性的端点复合物，不能分解为产物，即使增大底物的浓度也不能解除抑制剂的影响。,还有一种是三元复合物,SEI,也能分解为产物，但对酶的催化反应速率仍然产生了抑制作用。如核苷对霉菌酸性磷酸酯酶的抑制属于非竞争性抑制。,非竞争抑制图,非竞争抑制使反应速率降低，,Km不变,非竞争性抑制与竞争性抑制的主要不同点,对竞争性抑制，随着底物浓度的增大，抑制剂的影响可减弱；,而对非竞争性抑制，即使增大底物浓度也不能减弱抑制剂的影响。,反竞争抑制,反竞争性抑制的特点是抑制剂不能直接与游离酶相结合，而只能与复合物ES相结合生成SEI复合物。,反竞争抑制图,反竞争性抑制使反应速率减小，Km减小,例：水杨酸抑制谷氨酸脱氢酶催化的脱氢反应。试根据下列实验结果确定抑制类型K,m,和K,I,及值。又脱氢反应速度,r,的单位是根据,340 nm,波长下光吸收速率的增加来表示的。,谷氨酸脱氢酶的反应结果,谷氨酸，mmol,（含40mmol水杨酸,）,1.5,0.21,0.08,2.0,0.25,0.10,3.0,0.28,0.12,4.0,0.33,0.13,8.0,0.44,0.16,16.0,0.40,0.18,从图中可以看出反应为非竞争性抑制。,酶用于生物催化的概况,类别,占总酶比例%,利用率%,水解酶,hydrolases,26,65,氧化还原酶,oxidoreductases,27,25,转移酶,transferases,24,5,裂合酶,lyases,12,5,异构酶,isomerases,5,1,连接酶,ligases,6,1,二酶的组成和结构特点,1 单体酶,2 寡聚酶,3 多酶复合体,3 多酶复合体的组成部分,辅因子：酶蛋白中非蛋白质部分，它可以是无机离子也可以是有机化合物。,辅酶：有机辅因子与酶蛋白结合松散即为辅酶。,辅基：有机辅因子与酶蛋白结合紧密即为辅基。,三酶的作用机制,1 酶的作用过程,2 酶与底物的结合模型,3 酶的催化作用,1 酶的作用过程,酶的活性部位：,是它结合底物和将底物转化为产物的区域，通常是整个酶分子相当小的部分，它是由在线性多肽中可能相隔很远的氨基酸残基形成的三维实体。,2 酶与底物的结合模型,a 锁和钥匙模型,b 诱导锲合模型,a 锁和钥匙模型,b 诱导锲合模型,酶抑制作用的概念和分类,一 概念,二 抑制程度的表示,三 抑制作用的分类,四 抑制作用的定义,一 概念：能降低酶催化反应速度的因素,1.失活作用,2.抑制作用,3.去激活作用,4.阻遏作用,1.失活作用,失活作用是指由于一些物理因素和化学试剂部分或全部破坏了酶的三维结构，即引起酶蛋白变性，导致部分或全部丧失活性。,2.抑制作用,抑制作用是指在酶不变性的情况下，由于必需基团或活性中心化学性质的改变而引起的酶活性的降低或丧失。,3.去激活作用,去激活作用，某些酶只有在金属离子存在下才有活性，去除金属离子也会引起这些酶活性的降低或丧失。,4.阻遏作用,阻遏作用指某些因素（如激素或药物等）使细胞内酶蛋白的合成减少，反应速度的降低是由于酶分子数量的减少，每分子酶的催化效力并无变化.,二抑制程度的表示,一般用反应速度的变化来表示。若以不加抑制剂时的反应速度为 Vo，加入抑制剂后的反应速度为Vi，则酶的抑制程度有下列几种表示方法：,二抑制程度的表示,1 相对活力分数（残余活力分数）,a=Vi/Vo,2 相对活力百分数（残余活力百分数）,a%=Vi/Vo*100%,3 抑制分数,指被抑制而失去活力的分数i=1-a=1-Vi/Vo,4 抑制百分数,i%=(1-a)*100%=(1-Vi/Vo)*100%,通常所谓抑制率是指抑制分数或 抑制百分数。,激活剂的影响,常见的激活剂：,多种二价金属离子：Ca2+，Mg2+，Co2+，Zn2+，Mn2+,Cl,-,等无机离子,酶,在激活剂的作用下，酶的催化活性提高，或者由酶原生成酶,酶活力表示方法,酶活力：在特定条件下，每,1min,能催化,1umol,底物转化为产物时所需要的酶量，称为一个酶活力单位，或称为国际单位，用,IU,表示。,酶活力还可用比活力表示。比活力系指每,1mg,酶所具有的酶单位数，用,U/mg,表示。酶纯度指标。,酶的转换数,Kp,：每摩尔酶每分钟催化底物转化为产物的摩尔数，是酶催化效率的指标。,酶催化反应和化学催化反应的转换数大小的比较,催化剂,反应,转换数,mol/（中心点,S）,温度,酶催化剂,菠萝蛋白酶,木瓜蛋白酶,胰蛋白酶,碳酸肝酶,肽的水解,肽的水解,肽的水解,羰基化合物的可逆反应,410,-3,510,-1,810,-2,110,310,-3,110,2,810,-1,610,5,037,037,037,037,化学催化剂,硅胶氧化铝,硅胶氧化铝,二氧化钒,二氧化钒,异丙基苯裂解,异丙基苯裂解,环己烷脱氢,环己烷脱氢,310,-8,210,4,710,-11,110,2,25,420,25,350,酶的生产方法,提取分离法,生物合成法,人工控制条件的生物反应器中，通过微生物细胞、植物细胞、动物细胞合成酶,微生物发酵,化学合成法,利用氨基酸单体合成多肽,胰岛素的全人工合成,发展趋势,新酶或已有酶的新功能的开发,根据已有底物开发新的酶反应,利用突变或定向进化技术改善生物催化剂性能,利用重组DNA技术大规模生产生物催化剂,利用有机溶剂或共溶剂开发新的反应体系,体内或体外合成的多酶体系,发展趋势,克服底物和产物抑制,精细化工品或医药合成技术的放大,辅因子再生,生物催化剂的修饰,生物催化剂的固定化,