细胞培养技术制药.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第六章 细胞培养技术制药,动物细胞培养,动物细胞融合,单克隆抗体,胚胎移植,核移植,细胞工程常用的技术手段,植物细胞工程,动物细胞工程,植物组织培养,植物体细胞杂交,获得细胞,细胞的全能性,细胞株、细胞系,植物体,培养结果,或细胞分泌蛋白,快速繁殖、培育无病毒植株等,培养目的,葡萄糖、动物血清,蔗糖、植物激素,培养基特有成分,液体培养基,固体培养基,培养基性质,细胞增殖,原理,动物细胞培养,植物组织培养,比较项目,植物细胞和动物细胞培养的比较,IN VITRO:,（离体的，即在玻璃容器中）用培养细,胞进行的实验,IN VIVO:,（在体内的）完整机体内进行的实验,生化学家把在活细胞外进行的生化反应叫,IN VITRO，在活细胞内发生的生化反应叫IN VIVO,体外细胞培养技术,细胞培养（,cell culture）：,是指从活体中取出小块组织分离出细胞，在一定条件下进行培养，使之能继续生存、生长、增殖的一种方法。,优点：离体条件下观察细胞生命活动规律，不受体内环境影响可人为改变条件，进一步观察生理功能的改变。,第一节 哺乳动物细胞培养,第二节 植物细胞培养,第三节 昆虫细胞培养,3、发展历史,1907，美国的哈里森使用盖玻片悬滴培养蛙胚神经组织细胞,4、生长特性,贴附生长型,如人胚肺细胞，,Hela,细胞，巨噬细胞，神经细胞,悬浮生长型细胞,如血液白细胞，淋巴组织细胞等,5、体外培养细胞基本技术,体外培养特点,体外培养工具,体外培养条件,体外细胞生长增殖过程,培养方法,大规模培养技术,5.1 体外培养特点,营养条件苛刻,适应性差,敏感,培养时间长，易污染,Animal cells are,more difficult,to culture,than microorganisms,because they require many more nutrients and typically grow only when attached to specially coated surfaces.,Despite these difficulties,various types of animal cells,including both undifferentiated and differentiated ones,can be cultured successfully.,Pipets,移液管,单支封装、无菌、一次性,规格 1-100,ml,采用不同颜色标示,配合,Pipetboy,使用,5.2 常用培养设备材料,Tubes,锥形离心管和圆底试管,锥形离心管 实验室常用品,用途广泛：样品的离心、收集和存放,圆底试管,用于细胞培养、流式细胞仪等,两种不同的材质：聚丙烯和聚苯乙烯,PP（,聚丙烯）离心速度更高、可耐高温,PS（,聚苯乙烯）价格较低、使用范围广,Cell,Cultureware,细胞培养用品,细胞培养板,表面处理（组织培养表面）,主要规格（6孔、24孔、96孔）,低蒸发盖,细胞培养瓶,表面处理（组织培养表面）,瓶盖的设计（酚盖、螺旋塞、透气型）,瓶颈（直颈、斜颈）,生长面积(12.5,cm,2,-300 cm,2,),Cell,Cultureware,细胞培养用品,Cell,Cultureware,细胞培养用品,滚瓶,（培养面积 850-1450,cm,2,）,细胞培养玻片,Cell Culture Insert,5.3 体外培养条件,温度，37度,pH：7.2-7.4,气体，氧，二氧化碳，氮气,营养条件,需要多种氨基酸，维生素，辅酶，核酸，嘌呤，嘧啶，激素和生长因子，其中多种成分可以由血清提供,培养条件,无菌、无毒,消毒、灭菌,抗生素,定期更换培养液，清除代谢废物,营养,合成培养基：糖、氨基酸、生长因子、无机盐、微量元素,（血清、血浆）,温度和pH,36.50.5，7.2-7.4,气体,95%空气，5%CO,2,.植物组织培养的条件,.概念,Rich Media Are Required for Culture of Animal Cells,Nine amino acids,referred to as the,essential amino acids,cannot be synthesized by adult vertebrate animals and thus must be obtained from their diet.Animal cells grown in culture also must be supplied with these nine amino acids,namely,histidine,isoleucine,leucine,lysine,methionine,phenylalanine,threonine,tryptophan,and,valine,.,addition,most cultured cells require,cysteine,glutamine,and tyrosine.,The other essential components of a medium for culturing animal cells are vitamins,which the cells cannot make at all or in adequate amounts;various salts;glucose;and,serum,the,noncellular,part of the blood,Most Cultured Animal Cells Grow Only on Special Solid Surfaces,The extracellular matrices in various animal tissues consist of several common components:fibrous,collagen proteins;,hyaluronan,(or hyaluronic acid),a large mucopolysaccharide;and covalently linked polysaccharides and proteins in the form of,proteoglycan,(mostly carbohydrate)and,glycoproteins,(mostly protein).,5.4 体外细胞生长增殖过程,原代培养期,传代培养期,衰退期,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,细胞悬浮液,胰蛋白酶,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,（分解弹性纤维）,10代细胞,原代培养,50代细胞,传代培养,细胞株,无限传代,细胞系,遗传物质未改变,遗传物质改变,接触抑制,.,归纳过程.,动物细胞培养过程,应用,.,.对比,原代培养,（,primary culture）,用直接从机体获得的细胞进行的培养称为,原代培养,。这种培养过程主要是采用无菌操作的方法，把组织（或器官）从动物体内取出，经,酶,消化处理，使分散成单个细胞，然后在人工条件下培养，使其不断地生长和繁殖。,原代培养是建立各种细胞系的第一步,。,动物细胞原代培养过程图,（1）,动物处死：,将出生,23d乳鼠,，用,拉颈椎,方法处死。背部向上钉在蜡盘中，用,碘酒和酒精棉球,擦拭腰部两侧被毛。,（2）,取肾及剪肾：,在无菌条件下将肾脏取出，置于无菌培养皿中，剪去肾膜和脂肪，用Hanks液洗涤1次；放入另一培养皿中，纵向剪开肾脏，去掉肾盂，将肾剪成,1mm,3,大小,的块，再并用,Hanks液洗涤23次,，直到液体澄清。,方法与步骤,（3）,消化及分散组织块：,将上述清洗过的组织放入无菌青霉素瓶内，加入56倍量的,0.25胰蛋白酶液,（pH7.4 7.6），置37水浴中消化20 40min，每隔10min摇动一次，直到组织块变得疏松，粘稠，且颜色略变为白色为止。取出青霉素瓶，在超净台中,吸去胰蛋白酶液,，加入5ml培养液，用,吸管反复吹打组织块,，使其分散成细胞悬液，将细胞悬液用两层灭菌纱布过滤至另一烧杯中。,（4）,计数与稀释：,从过滤的细胞悬液中取出1ml滴于血细胞计数板上，按白细胞法进行计数；计数后用培养液稀释，稀释后的浓度一般以,每毫升含30 50万个,细胞为宜。,（5）,分装与培养：,将稀释好的细胞悬液分装于细胞培养瓶中，塞紧瓶塞，在培养瓶上做好标记，置于,37的CO,2,培养箱,中培养。,（6）,观察：,逐日检查培养物是否污染，观察细胞生长情况。待细胞已基本长成致密单层时，即可进行传代培养。,传代细胞培养,（,secondary culture）,离体培养的细胞群体增殖,达到一定密度,时，细胞的生长和分裂速度就会减慢甚至停止，,如不及时分离传代培养，细胞将逐渐衰老死亡,。,传代培养,是指细胞从一个培养瓶以1：2或其他比率转移，接种到另一培养瓶的培养。贴壁培养细胞的传代通常是采用,胰蛋白酶,消化，把细胞分散成单细胞再传代，而悬浮型生长细胞则用直接传代法或离心法传代。,（一）贴壁细胞传代培养,（1）选取生长良好的细胞，在超净工作台的酒精灯旁，倒去瓶中的旧培养液，加入23ml的,D-Hanks,液，轻轻振荡漂洗细胞，以除去悬浮在细胞表面的碎片。,（2）加入2滴管0.25,胰蛋白酶消化液,，37 消化23min，倒置显微镜下观察，待细胞单层收缩突起出现空隙时，倒去酶液。,（3）用Hanks液洗涤1次，加入12滴管培养液，反复吹打细胞，使其成细胞悬液。,（4）以,1:2或1:3进行分装,，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，37 CO,2,培养箱培养。,（5）观察：细胞培养24h后，即可观察培养液的颜色及细胞的生长情况。,方法与步骤,（二）悬液细胞的传代培养,（1）取生长良好的细胞，在超净工作台用无菌吸管把培养瓶中的细胞吹打均匀。,（2）转移到无菌的离心管中，盖紧胶盖，平衡后离心（1 000 r/min）5min。,（3）在超净工作台中吸去上清液，加入适量新培养液，用吸管吹打细胞，制成悬液。,（4）以,1:2或1:3,进行分装，并在培养瓶上做好标记，注明代号、日期，轻轻摇匀，,37 CO,2,培养箱培养。,（5）观察：细胞培养24h后，即可进行观察。,细胞系（,cell line）,在细胞培养中产生了具有无限增殖能力的变种细胞，这种细胞可被无限的传代。,常见的细胞系：,NIH3T3,细胞系：,1963,年取自小鼠胚胎细胞建立,Hela,细胞系：,1952,年取自人宫颈癌细胞建立,5.5 培养方法,悬滴,旋转管,灌注小室,培养瓶,培养板,5.6 大规模培养技术,悬液培养，使用微球载体,6、动物细胞培养技术的应用,生产蛋白质生物制品：病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。,用于检测有毒物质,获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮。,用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据,Vero细胞和狂犬病毒的培养工艺,DMEM培养基,胎牛血清,其他成分,锥形瓶逐级放大培养,加碱（碳酸氢钠）,加糖（葡萄糖）,灌注培养液,微载体,5L种子罐培养,培养液,50L,生,物,反,应,器,接种狂犬,病毒,出液口,收获病毒,20世纪90年代早期组织工程、细胞治疗和基因治疗的出现为哺乳动物细胞培养技术的延伸与发展提供了一个新的领域。,发展重点,已从将细胞作为一个生产生物治疗产品的工厂转变为将细胞本身作为最终的产品，其目标是要治疗一系列疾病。,研究方向包括：干细胞移植、癌症、病毒感染及其他免疫紊乱疾病的治疗、人工器官系统、基因治疗等。,第一节 哺乳动物细胞培养,第二节 植物组织细胞培养,第三节 昆虫细胞培养,植株培养,组织（愈伤组织Callus、茎尖分生组织）,悬浮细胞,器官（胚，花药，子房，根和茎）,原生质体（Protoplast）,广义的植物组织细胞培养,是指将植物体的细胞、植物原生质体、植物组织及器官甚至幼小植株放在离体的、无菌的人工环境中让其生长发育的方法。,主要有：,植物组织细胞培养,愈伤组织培养 Callus,culture,器官培养,organ culture,胚培养,embryo culture,悬浮细胞培养,suspension cell culture,原生质体培养,protoplast culture,毛状根组织培养,hairy root cultures,植物,组织细胞培养,方法,植物快繁技术,（micropropagation）,把,植物器官、组织、细胞或原生质体,作为,外植体,，给予人工培养基和合适的离体培养条件下再生植物的技术，从而达到高速增殖，属离体,无性繁殖,。,步骤：母株（完整）外植体（母株的一小部分，种子亦可）接种到培养基上长芽（继代增殖）长根（试管外生根亦可）炼苗，驯化完整植株,一、植物组织培养,（Plant Tissue Culture）,通过无菌操作分离植物体的一部分（外植体explant），接种到培养基上，在人工控制的条件下（包括,营养、激素、温度、光照、湿度,）进行培养，使其产生完整植株的过程。,植物组织培养技术,植物细胞全能性（,Cellular,totipotency,）：,任何具有完整细胞核的植物细胞，都拥有形成一个完整植珠所必须的全部遗传信息和发育成完整植株的能力。(,Haberlandt,1902),再生:,不同植物种类具有不同再生能力，例如:非洲董叶插，可,于,切口处再生新的植株。,增殖,：,经由细胞分裂，由少变多，由小变大。,器官发生:,再生的途径是经由根或芽等器官之形成。体胚发生:再生的途径是经由胚之形成,。,植物组织培养原理,可培养出,与上一代相同特性,（具相同优良品质）的植物。,可以大規模地、,以小部份组织在试管內倍数,不断地培养繁殖。,培养液,提供养分,生長较快。,必須在,无菌的,环境下操作，才不會引起细菌、霉菌感染而失敗。,组织培养,的特点,1.选取符合培养目的之,培植体,2.完全的,无菌,控制,3.良好的,人工培养基,4.适当的,容器,5.良好的,培养环境,成功的,组织培养,1.获得无菌外植体,2.消毒,3.培养基的选择,4.愈伤组织的培养,5.试管苗的培养,炼苗，驯化完整植株,植物组织培养步骤,愈伤组织（,Callus）,：,原指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，,在组培中则指,人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。,茎 頂,茎頂,側芽,茎頂,节间,节位,老叶的成,功率较低,低,高,成功率,有产生愈伤组织与不定芽之傾向,愈伤组织,器官形成,胚形成,菊花叶片培养,产生愈伤组织,二、植物细胞培养,组织培养物分离成单细胞并不断扩增的液体培养技术,过程：将愈伤组织或其它易分散的组织至于液体培养基中，使组织分散成游离的悬浮细胞，进行振荡培养，通过继代培养使细胞增殖，获得大量的细胞群体，生产有用次生代谢产物,采用水平振荡，速率,30-150r/min，振幅2-4cm，温度24-30为宜,三、花药培养,花药在烧杯中研碎（有溶剂）过滤浓度梯度离心收集中间层,消毒,接种,培养,花药培养得到的植株染色体数目相当于原植株体细胞染色体数目的一半，又称,单倍体植株,。,花 器,花药，花粉,花柱,花絲,子房,胚珠,萼片,花蕾內部无菌,愈伤组织,花粉花药培养的意义,单倍体细胞,中,只有一个染色体组,，表现型和基因型一致，一旦发生突变，无论是显性还是隐性，在当代就可表现出来，因此,单倍体是体细胞遗传研究和突变育种的理想材料,。,品种间杂交育种过程中，通过,F1,代花药培养得到单倍体后，经染色体加倍立即成为纯合二倍体，从杂交到获得不分离的杂种后代单株,只需要2个世代,和常规育种相比,，显著,缩短了育种年限,。,四、原生质体培养,酶解法制备原生质体，在良好的无菌培养基中对原生质体进行培养使原生质体进行生长、分裂，并最终可以长成植株的一种方法。,原生质体培养无机盐的浓度略低,体细胞杂交：,将二倍体植物体细胞经离心、振荡等机械方法或采用诱导剂促使不同植物的原生质体进行融合，培养，获得体细胞杂交的植株，由此使自然不杂交的植物获得种间杂交品种。,植物原生质体,原生质体分离与纯化,protoplast isolation,细胞壁,液泡,细胞核,细胞膜,细胞质,原生质体,浮起的原生质体,离心，洗除酵素,细胞壁等殘渣,長出叶子的芽体,含植物荷爾蒙之誘芽培养基,含植物荷爾蒙之誘根培养基,再生植株,含特殊养分之原生质体培养基,濾紙,原生质体或细胞團,酵素液处理,原生质体培养,小细胞團移出,完整芽体切下移出,菊花原生质体,五、毛状根培养,发根培养，利用治病农杆菌（包括根癌农杆菌和发根农杆菌）感染植物的外植体使其产生毛状根，并对所产生的毛状根进行无菌培养的技术。,形态方面：,Ri,质粒,诱导快速生长的、非定向性、高分支的毛状根的形成,代谢方面：,Ri,质粒转化根能合成与原植物相同或相似的次生代谢物，并且发根合成次生代谢物具有遗传稳定性。,毛根状培养,六、,胚培养,embryo culture,利用组织和细胞培养技术,生产药用成分,植物组织及细胞培养过程中，所产生的次生代谢物常存在于细胞内，可以收获细胞进行提取，因所含色素等,杂质较少,，所以提取过程相对于从原植物中,提取要简单一些,；,植物培养细胞中有效成分,含量高于,原植物中的含量；,培养周期短,，有利于节约成本大规模生产。,利用组织和细胞培养产生,新的化合物,鸡骨常山-利血平,长春花-蛇根碱,利用组织和细胞培养物转化药用成分,植物细胞和组织培养物中,含有,催化氧化、还原、甲基化、羟基化、异构化、酯化、糖基化,、羧基化、去甲基化等,多种反应的酶类,，可,使加入到培养物中的原料,转化,成有用的化合物,。,加入到紫花洋地黄细胞培养中的,甲基毛地黄毒素,可以,被转化成,-,甲基地高辛,。植物细胞和组织培养物的生物转化体系中常含有糖苷化酶，能往一些天然产物上面,加上糖基,，合成一些苷类物质。,可以向药用植物细胞和组织培养物中,添加前体,，经培养将其,转化为目的化合物,，以此来增加有效成分的含量。,生产无病原健康植物体及大量繁殖；,种源的保存及引种；,胚培养及试管受精；,花葯培养产生单倍体之育种，,愈伤组织及细胞悬浮培养；,原生质体培养及遗传工程。,药用植物基材生产,二级代谢物生产,与,植物转基因技术结合，大规模生产药用蛋白质,组织培养之应用,植物组织培养,之应用,植物组织培养培养商业化应用图,第一节 哺乳动物细胞培养,第二节 植物细胞培养,第三节 昆虫细胞培养,昆虫细胞培养,是从昆虫体内取出细胞,模拟昆虫体内的生理环境,在无菌、适温和丰富的营养条件下,使细胞生存、生长并维持结构和功能的一门技术。,它是近年来迅速发展起来的细胞工程中的一个领域，,广泛应用于医学、农业及生物学,的各个方面。,目前，,其主要应用的两个方面：,利用杆状病毒在昆虫细胞内的感染、复制，以大量生产昆虫病毒作为生物杀虫剂；,大量表达杆状病毒携带的外源基因生产重组蛋白质。,大部分昆虫细胞都利用,葡萄糖、果糖或麦芽糖,作为主要碳源和能源,不同种类的昆虫细胞对氨基酸有不同的要求,至少有,14种必需的氨基酸,。,一、昆虫细胞培养基,水解乳蛋白,(Lactalbum in Hydrolysate,LH,)和,酵母提取物,(Yeastolate,YL,)是昆虫细胞培养基中最常用的添加物,YL,是,维生素和嘌呤,的主要来源,而,LH,是,不定成分氨基酸,的主要来源。,天然培养基采用取自动物体液或从组织中提取的成分作为培养液；,合成培养基最大的特点是各种成分已知；,无血清培养基是在已知细胞所需营养物质和贴壁因子基础上,在基础培养基中加入适宜的促细胞生长因子,能够保证细胞生长良好无须补加血清的培养基。,1、昆虫细胞培养基的发展,天然培养基、合成培养基和无血清培养基,昆虫细胞培养基的发展主要是合成培养基的发展。目前已有三种商品化的培养基：Grace 培养基、,IPL 41培养基,和TC 100培养基。,在经历了天然培养基、合成培养基后，无血清培养基的研制成为当代细胞培养的,重大课题,虽然,血清对细胞的生长很有效,，但是血清的应用还存在,缺点,：,高质量的动物血清来源有限，成本高，限制了它的大量使用；,动物血清成分复杂，各种生物大小分子混合在一起，有些成分至今尚未搞清楚，对后期培养产物的分离、提纯以及检测会造成一定困难；,血清也是支原体和其它病毒污染的重要来源；每批血清的质量不同,影响细胞的生长和病毒复制。,2、无血清培养基,到目前为止还没有用血清培养基进行大规模的商业化生产。,数十年来,大概从三个方面开展了无血清培养的研究工作：,寻找血清代用品；,在培养基中补加必需成分,如生长因子,EGF、FGF,等,以降低血清用量；,无血清细胞培养用于相关学科研究。,1982年,Roder,用,蛋黄替代脂类分子,成功地培养了几个鳞翅目细胞系；,M,aiorella,等(1989)以,IPL 41,为基础通过加入,酵母提取物和复杂的脂类代替血清,成功配制成一个无血清的培养基,ISFM。,1915年，,Goldschmid,在,Osbon,实验室最先开始昆虫组织培养，并且取得了一定的成果。,Grace(1962),首次建立了,桉蚕蛾卵巢细胞系,，此后，在100个昆虫种类中建立了,400多个细胞系,，这些细胞系现已被广泛地应用于各个领域。,二、昆虫细胞系,最初,昆虫培养的细胞主要以,血细胞、成纤维细胞,为主，,现在已建立的细胞系,则主要,来源于未发育成熟组织,，如胚胎、器官、芽和卵巢。,用未成熟或未分化的组织建立细胞系必用成熟组织容易,，,主要是因为其中的干细胞含量高,。,胰蛋白酶被广泛地应用于,未成熟,组织的消解,，同时胶原酶、中性蛋白酶和透明质酸酶也被应用于未成熟组织的消解。,由于昆虫,成熟组织对胰蛋白酶敏感,，可以采用胶原酶或中性蛋白酶消化组织。,酶 消 解,目前，生物农药使用的是,虫体生产工艺,：人工饲养多角体病毒感染，即用多角体蛋白包被的多角体病毒喂养虫体，多角体病毒在虫体内复制得到具有杀虫能力的昆虫病毒。,虽然该工艺起到了一定的作用，但是存在,严重的问题,：,生产时间长、耗人力及产品中含有对一线工人易过敏的微生物、昆虫角皮和昆虫蛋白。,三、昆虫细胞培养的应用,1、昆虫细胞作为荷载体生产生物农药,因此,用杆状病毒感染昆虫细胞生产生物农药，是生产病毒杀虫剂的唯一途径。,2、昆虫细胞杆状病毒表达系统生产重组蛋白,利用,昆虫杆状病毒作为载体,，在昆虫细胞中高效表达外源基因生产重组蛋白，已被应用于医疗诊断、动物和人类疫苗等方面。,为有潜力的表达系统。,以杆状病毒多角体蛋白的超强启动子可以高效表达异源蛋白；,不依赖于辅助病毒；,昆虫细胞有后加工系统,重组蛋白具有生物活性。,自杆状病毒作为外源基因载体成功的在昆虫细胞中表达了B 干扰素基因后,有数百种外源基因插入到杆状病毒基因组中并得到表达。,昆虫细胞培养是杆状病毒研究与应用的前提，,但昆虫细胞培养关键在于如何通过优化培养条件、改进培养基成分(不用或少用血清)、降低培养成本和筛选敏感高效的昆虫细胞系,使其向实用化方向发展。,利用昆虫细胞杆状病毒表达系统生产重组蛋白时，,宿主细胞的种类、培养条件和对表达产物的修饰加工,是直接影响表达水平、表达产物的生物活性和生产可行性的重要因素。,四、昆虫细胞培养展望,Thank you,Thank you,