流式细胞仪基本原理及应用.ppt

All rights reserved by Dr Baiqing LI,单击以编辑母版标题样式,单击以编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,-,*,-,Bengbu Medical College,Department of Immunology,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,流式细胞仪和流式细胞术概述,流式细胞仪的工作原理和测量参数,流式细胞仪在临床检测和科研中的应用,免疫学检测和科研应用,血液病检测和科研应用,肿瘤学检测和科研应用,流式细胞仪的基本工作原理以及在基础和临床科研中的应用,1,一、流式细胞仪和流式细胞术的基本概念,流式细胞仪,(Flow,Cytometer,，,FCM):,是集合光电子物理，光电测量技术，液流技术，计算机技术等现代高科技技术为一体的细胞测量和分析仪器。,2,一、流式细胞仪和流式细胞术的基本概念,流式细胞术,(Flow,Cytometry,，,FCM):,是应用流式细胞仪，对处于快速流动液体中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速测量和定量分析，以及分选的技术。,3,6,大型机FACSVantage SE,科研型,八荧光参数,高速分选,多路分选,7,流式细胞仪与荧光显微镜比较,流式细胞仪 荧光显微镜,流动的细胞 静止的细胞样本,数量大 数量少,高速分选 样本难以再利用,细胞群体特征量分布 可揭示细胞内部结构信息,8,二、流式细胞仪的工作原理和测量参数,光路系统,：,激光光源，光路系统（透镜、滤光片）,电子系统：,光电倍增管（PMT），补偿电路,液流系统,：,鞘液系统，样品流动系统,数据系统：,计算机，数据测量和分析软件,。,细胞分选系统,（一）流式细胞仪的结构,9,流式细胞仪光路系统,激光,(Laser),是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照,激光波长,:488nm,635nm,光收集系统是由若干组透镜,滤波片,小孔组成，将产生的光信号引导至检测器,10,光路系统,11,Injector,Tip,12,Injector,Tip,Fluorescence,signals,Focused laser,beam,Sheath,fluid,13,流式细胞仪光学系统,激发光源与荧光标记物,14,光学检测信号,15,流式细胞仪的光学系统 FACSCalibur,16,流式细胞仪液流系统,17,液流系统：,鞘液系统样品流动系统,18,流式细胞仪的电子系统,信号检测和分析,当细胞携带荧光素,通过激光照射区,受到激发产生不同波长的、代表细胞内不同物质的荧光信号,荧光信号由光电接收器接收，转变为电脉冲信号，,电脉冲信号经,A/D,转换成数字信号,数字信号传送到计算机，进行储存、作图和统计分析,19,数据系统,20,（二）流式细胞仪可检测的细胞参数,细胞结构,细胞大小,细胞颗粒性程度,细胞表面面积,核浆比例,DNA,含量与细胞周期,RNA,含量,细胞功能,细胞表面蛋白抗原,细胞胞浆内蛋白性抗原,细胞内细胞因子,细胞增殖,细胞内钙离子浓度,二、流式细胞仪的工作原理和测量参数,21,（二）流式细胞仪可检测的细胞的参数：,散射光信号,前向角散射光（,FSC,Forward Scatter,）,入射光的前向,(,5,),散射光信号,可反映：,细胞相对大小及其表面积,侧向角散射光（,SSC,Side Scatter,）,入射光,90,角的,散射光信号，,可反映：,细胞颗粒性程度,（胞内成分和构造和表面结构的复杂性）,22,散射光信号,前向角散射光,FSC,FALS Sensor,Laser,23,散射光信号,侧向角散射光,SSC,FALS Sensor,90LS Sensor,Laser,24,流式细胞的基本信息:“形态”,25,26,外周全血细胞,（红细胞溶解后）,以散射光表示的 双参数 点图,27,外周全血细胞,（红细胞溶解后）,以散射光表示的 双参数 点图,中性粒细胞,单核细胞,淋巴细胞,28,（二）流式细胞检测细胞参数:,特征信息荧光（Fluorescence）信号,荧光素吸收激光（激发光波长）能量,荧光素将吸收能量释放，转换为,释放较入射光波长更长的光量子（发射光波长）,荧光素与特异抗体结合（荧光抗体）,荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生荧光信号越强,荧光素与细胞核酸结合，荧光强度反映核酸含量,29,（二）流式细胞检测细胞参数:,特征信息荧光（Fluorescence）信号,Forward scatter(FSC),Side scatter(SSC),FL1（第一荧光）-FITC(异硫氰酸荧光素）,FL2（第二荧光）-PE（藻红蛋白）,FL3（第三荧光）-PerCP,PeCy5等,PL4（第四荧光）-APC（藻青蛋白）,30,荧光信号,Fluorescence,FALS Sensor,Fluorescence detector,(PMT3,PMT4 etc.),31,32,荧光信号,双色直接染色,33,（三）流式细胞仪分析数据常见图形：,（二维）点陈图(,Dot,Plot),适用于：双参数分析,34,（三）流式细胞仪分析数据常见图形：,直方图(,Histogram,Plot),适用于：,单参数分析,仅需要观察某个荧光强度的变化,35,流式细胞术检测细胞的荧光 标记方法,单标：,一种单抗:FL1,FSC,SSC（三参数）,双标,：,两种单抗：FL1,FL1,FSC,SSC（四参数）,三标：,三种单抗：FL1,FL2,FL3,FSC,SSC,（五参数）,四标四种荧光标记抗体：,四种单抗：FL1,FL2,FL3,FL4,FSC,SSC,（六参数）,36,淋巴细胞亚群分析,细 胞 凋 亡,肿瘤学,移植免疫,三 流式细胞仪在临床检测和科研中的应用,血小板,其 它,37,淋巴细胞亚群分析,38,Adhesion,Metabolic,39,40,41,T,淋巴细胞,淋巴细胞亚群检测：,T cells,T subsets,NK cells,B cells,42,淋巴细胞亚群,T淋巴细胞(CD3+),名 称,功 能,CD3+CD4+,辅助性/诱导性T细胞(Th/Ti),辅助和诱导细胞免疫和体液免疫,CD3+CD4+CD29+,CD3+CD4+CD29-,辅助性T细胞(Th),诱导性T细胞(Ti),辅助细胞免疫和体液免疫,诱导细胞免疫和体液免疫,CD3+CD8+,抑制性/杀伤性T细胞(Ts/Tc),抑制免疫反应/杀伤异源细胞,CD3+CD8+CD28-,CD3+CD4+CD29-,抑制性T细胞(Ts),杀伤性T细胞(Tc),抑制细胞和体液免疫,细胞毒性T细胞,CD3+CD4+CD8+,活化的T细胞,在T细胞恶性增生时升高,CD3+CD4-CD8-,有调节功能的T细胞,其表达,/,T细胞受体(TCR,/,),CD4+/,CD8,+比值,CD45RA+CD45RO-,幼稚的/静止的T淋巴细胞,当免疫系统没有能力更新辅助性或抑制性/细胞毒性淋巴细胞的祖细胞时此细胞亚群较低,CD45RA-CD45RO+,记忆性T淋巴细胞,病菌感染时升高,但在慢性病毒感染,如HIV患者中降低,CD45RA+CD45RO+,活化的T细胞,感染时升高,感染时升高,43,淋巴细胞亚群,活化T淋巴细胞,名 称,功 能,CD3+HLA-DR+,活化T细胞,CD4+HLA-DR+,活化的辅助性/诱导性T细胞,CD8+HLA-DR+,活化的抑制性/杀伤性T细胞,CD4+CD25+,活化的辅助性/诱导性T细胞,CD8+CD25+,CD8+CD38+HLA-DR+,活化的抑制性/杀伤性T细胞,在病毒感染的患者中增加;其增加意味着HIV患者的预后较差,B淋巴细胞(19+),CD19+CD23+,活化的B细胞,过敏患者中升高,CD19+CD5+,在自身免疫性疾病中升高,CD19+CD5+CD23+,慢性B细胞白血病及单克隆B淋巴细胞,NK细胞,CD3+CD(16+56)+,自身免疫性疾病时降低,而病毒感染时升高,CD3+CD57+,CMV(巨细胞病毒)感染的强烈征兆,44,淋巴细胞亚群与疾病,疾 病,CD3,CD4,CD8,CD4/CD8,NK,自身免疫性疾病,系统性红斑狼疮,类风湿性关节炎,自身免疫性溶血性贫血,重症肌无力,免疫缺陷病,爱滋病,病毒感染,传染性单核细胞增多症,慢性活动性肝炎,活动性肝硬化,肿瘤,消化道癌,肝癌,肺癌,再生障碍性贫血,粒细胞减少症,45,淋巴细胞亚群检测意义,疾病机理研究,疾病辅助诊断,移植后免疫检测,治疗方案的确定及疗效评价,CD25高于正常值5-10%,表明即将或已发生排斥,CD4/CD8比值下降提示并发凶险感染,0.2时,必须停用免疫抑制剂,CD2+HLA-DR+增加5-10%,且不伴有CD25的增加,提,示巨细胞病毒感染,慢性疲劳,感染后综合征,纤维肌痛,类风湿性关节炎,过敏等,疾病预防,46,淋巴细胞亚群检测意义,Control,（n=20),Active SLE,(n=17),Stable SLE,(n=13),CD3,70.4 5.87,65.8 10.9,68.5 8.95,CD4,35.0 5.70,22.1 4.15*,34.5 4.23,CD8,27.9 5.73,45.7 9.58*,32.7 9.01,CD4/CD8,1.27 0.14,0.43 0.12*,1.05 0.26*,NK,17.8 5.48,4.37 3.31*,7.59 5.01*,鉴别活动期和非活动期SLE,47,HIV AND AIDS,48,Th1/Th2细胞,49,Th1/Th2细胞,Th1型细胞因子介导 细胞免疫反应,引起迟发型过敏反应、巨噬细胞活化、局部炎症,刺激来源：病毒、某些细菌,Th2型介导体液免疫反应,引起B细胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、,促进I型变态反应（过敏反应）,刺激来源：多细胞寄生虫、过敏原,50,Th1/Th2细胞,PMA+Ionomycin,刺激4-6hr,51,流式细胞仪检测胞内细胞因子,新鲜分离PBMC,加PMAIo刺激后6h,测定胞内细胞因子IL-4和IFN-,g,检测免疫细胞表型和结合检测胞内细胞因子：操作和分析方法,；,52,四色标记胞内因子,FCM,检测,53,Th1/Th2失衡相关疾病,嗜酸性细胞增多和,IgE,升高相关疾病,Ommens Syndrome(Ommens综合征),Hyperosinophilic Syndrome(高嗜曙红细胞综合征),Kimuras Disease(Kimuras疾病),Wells Syndrome(Wells 综合征),传染病,病毒性疾病,人类免疫缺陷性病毒感染和爱滋病,(AIDS),麻疹,呼吸道合胞体病毒感染,慢性活动性乙型肝炎病毒感染,分枝杆菌和其它细菌感染,麻疯病/肺结核,鸟结核分枝杆菌复合感染,滑膜炎反应性关节炎,淋病和梅毒,54,Th1/Th2失衡相关疾病,寄生虫病,原寄生虫感染：皮肤和内脏利什曼病,蠕虫病：丝虫病和血吸虫病,真菌性疾病,过敏性支气管肺霉菌病,念珠菌病,隐球菌病,类球孢子菌病,球孢子菌病,组织胞浆菌病,恶性肿瘤,皮肤基底细胞和鳞细胞癌,Sezary Syndrome(Sezary,综合征,),淋巴瘤,EBV,相关的,B,细胞和非何杰金氏淋巴瘤,何杰金氏淋巴瘤,大细胞退行性,(CD30+),淋巴瘤,多发性骨髓瘤和,Castlemans,综合征,卡氏肉瘤,55,Th1/Th2失衡相关疾病,变应性疾病,皮肤性哮喘,变应性哮喘,春季结膜炎,炎性和自身免疫性疾病,巨细胞,(,暂时性的,),动脉炎,系统性红斑狼疮,类风湿性关节炎,自身免疫性甲状腺疾病,类肉瘤病,银屑病,(,牛皮癣,),IgA,肾病,多发性硬化,56,Th1/Th2细胞检测意义,疾病治疗,发病机制研究,使用,Th1,和,Th2,相关的细胞因子,IFN-,治疗,麻疯病,用抗,Th1,和,Th2,相关细胞因子或其受体的抗体,抗IL-4抗体治疗真菌和寄生虫感染,使用调节,Th2/Th2,细胞因子平衡的药物:,萨力多胺,(Thaliodomide)治疗,巨细胞动脉炎,疾病治疗监测,57,肿瘤学,58,肿瘤发生发展,59,0,200,400,600,800,1000,PI 荧光强度(DNA,含量),DNA含量分析,2N,4N,Counts,G0/G1,G2/M,S,异倍体,60,DNA含量分析,70%人类癌症中存在着异倍体或细胞周期的改变,1.Ross JS.DNA Ploidy and Cell Cycle Analysis in Pathology.New York:Igaku-Shoin;1996:47-60,DNA,倍体和S期比例-指导治疗2,卵巢癌，乳腺癌，结肠癌，子宫内膜癌，原发部位不明的癌症,-早期 (I/II期),DNA,倍体和DNA指数-预后长期和无病生存期2,卵巢癌-晚期,2.The Recommend Medicare National Coverage Policy for Flow Cytometry.HCFA Website,1999,61,P53/Bcl-2,62,P53,乳腺癌,与病理学分级有关,并与乳腺癌的淋巴结转移显著相关,大肠肿瘤,早期发现大肠癌,胃 癌,与预后相关,肝细胞癌,与组织分级,肿瘤预后,转移及肿瘤大小密切相关,63,Bcl-2,Bcl-2在正常组织中的表达,造血系统细胞,淋巴,单核细胞等,受激素或生长因子调节的腺上皮,前列腺上皮,子宫内膜等,干细胞或增值细胞,皮肤的基底细胞,肠上皮,寿命长的分裂细胞,神经元,胚胎组织,Bcl-2在肿瘤组织中的表达,肾脏肿瘤,肾癌,肾盂乳头瘤,Wilms瘤,肾嗜酸细胞瘤,前列腺癌,B细胞性淋巴瘤,乳腺癌(43%),甲状腺癌,64,nm23,nm23与多种肿瘤的转移及预后相关,肝细胞癌,甲状腺肿瘤,乳腺癌,结肠癌,肉瘤,65,CD44,(CD44s/CD44v),66,肿瘤多药耐药性(MDR)检测,P-gp在肿瘤组织中的表达,乳腺癌,膀胱癌,胃癌,食管癌,卵巢癌,前列腺癌等,化疗前高表达,化疗后高表达,肾细胞癌,结肠癌,肝癌,肾上腺皮质癌,胰腺癌等,化疗前低表达,非何杰金氏淋巴瘤,成神经细胞瘤,急性髓白血病等,化疗不敏感,化疗敏感,化疗不敏感,67,乳腺癌,石蜡切片,脱腊,ER(雌激素受体),ER抗体染色,酶解,流式检测,固定(多聚甲醛),破膜(70%甲醇),细 胞,68,Cyclin(,细胞周期蛋白),69,细 胞 凋 亡,70,细胞凋亡分析,71,DNA断裂,72,乳腺癌,Fas/FasL,与疾病,慢性病毒性肝炎,恶性肿瘤细胞-黑色素瘤、结肠癌、肺癌、肝癌等,脑缺血后细胞凋亡,自身免疫性疾病系统性红斑狼疮,Fas/FasL,(CD95/CD95L),73,乳腺癌,Caspases,早期细胞凋亡,Annexin V/PI,74,移植免疫,75,CD25高于正常值5-10%,表明即将或已发生排斥,CD4/CD8比值下降提示并发凶险感染,0.2时,必须停用免疫抑制剂,CD2+HLA-DR+增加5-10%,且不伴有CD25的增加,提示巨细胞病毒感染,移植后免疫监测,76,血小板,77,血小板活化,静止血小板,活化血小板,78,血小板活化,79,网织血小板,ITP(特发性血小板减少症),化疗,鉴别诊断,骨髓移植,80,血小板计数新标准(间接双平台法),R=红细胞数/血小板数(流式细胞术),血小板数,=红细胞数(血球仪)/R,(国际血液学标准化委员会(ICSH)/国际实验血液学协会(ISLH)2001),灵敏度高(1-400 x10,9,/L)，,重复性好，室内/室外变异系数均很小,尤其应用于血小板预输注病人的检测,(阈值:20 x10,9,/L),81,其 它,82,HLA-B27,83,正常人,患 者,HLA-B27,84,细胞介导的细胞毒作用,活靶细胞,死靶细胞,替代,51,Cr释放实验,85,HLA-B27检测,Calibration beads,HLA-B27 calibration beads,Decision marker,HLAB27FITC（MFI),86,流式临床应用发展,白血病/淋巴瘤免疫分型,HIV感染的CD4绝对计数,CD34绝对计数/异体移植的免疫重建,抗原特异性,T细胞检测,树突状细胞（DC）,循环微转移肿瘤细胞,I,II,III,IV,Marti GE,Maryalice SS,et al.Introduction to Flow cytometry.Seminars in Hematology,2001;38(2):93-99,87,流式微球分析,Cytometric Bead Array（CBA）,88,CBA与ELISA相比优点,“多元”和“同步”检测,样本量少,灵敏度相似,稳定性好,89,