微生物学第七章-微生物遗传与变异.ppt

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DNA),。,特点,（,1,）超螺旋结构；,（,2,）携带某些核基因组上所缺少的特殊功能的基因；,（,3,）独立存在于细胞内的复制子；,（,4,）当用一些理化因素处理时，可使子代细胞中的质粒消除；,（,5,）某些质粒可与核染色体发生整合或脱离,附加体；,（,6,）质粒与质粒间、质粒与染色体之间具有重组功能；,（,7,）有些质粒不表现任何功能,隐蔽性质粒。,2,、质粒的种类,按其功能划分：,（,1,）接合性质粒：如,F,质粒；,（,2,）抗药性质粒：如,R,质粒；,（,3,）产细菌素的质粒：如,Col,质粒；,（,4,）具有生理功能的质粒：如固氮的,mega,质粒、降解性质粒等；,（,5,）产毒质粒：如,Ti,质粒。,第二节 基因突变和诱变育种,一、基因突变（,gene mutation,）,基因突变简称突变，泛指细胞内遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化，可自发或诱导产生。（野生型、突变型）,突变率：每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株的数目来表示。,突变率,=,突变细胞数,/,分裂前群体细胞数,（一）突变的类型,按是否在选择性培养基上比较容易、迅速地分离和鉴别来分：,突变株的表型,选择性突变株,非选择性突变株,营养缺陷型,抗性突变型,条件致死突变型,形态突变型,抗原突变型,产量突变型,（二）突变的特点,1,、稀有性：突变率低；,2,、独立性：各种突变独立发生，不会互相影响；,3,、可诱变性：诱变剂可提高突变率；,4,、稳定性：变异性状稳定，可遗传；,5,、可逆性：正向突变；回复突变或回变；,6,、自发性：突变可以在没有人为诱变因素处理下自发地产生；,7,、不对应性：突变的性状与引起突变原因之间无直接的对应关系。,（三）基因突变的机制,突变,诱变,自发突变,基因突变,染色体畸变：缺失、重复、易位、倒位,碱基置换,移码突变,转换,颠换,缺失,添加,1,、诱发突变（,induced mutation,）,诱发突变：指通过人为的方法，利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变频率的手段。简称诱变。,诱变剂：凡具有诱变效应的任何因素。,（,1,）碱基置换,转换：嘌呤被嘌呤所置换或嘧啶被嘧啶所置换；,颠换：嘌呤被嘧啶所置换或嘧啶被嘌呤所置换。,（,2,）移码突变,诱变剂使,DNA,序列中一个或少数几个核苷酸增添或缺失，从而使该部位后面的全部遗传密码的阅读框架发生改变，引起转录和转译错误的突变；,（,3,）染色体畸变,某些强烈理化因子，如电离辐射（,X,射线等）和烷化剂、亚硝酸等引起,DNA,分子的大片段损伤。,若干诱变剂的作用机制及诱变功能,诱变因素在,DNA,上的初级效应 遗传效应,碱基类似物 掺入作用,AT=GC,双向转换,羟 胺 与胞嘧啶起反应,GCAT,的转换,亚硝酸,A,、,G,、,C,的氧化脱氨作用,AT=GC,双向转换,交 联 缺失,烷化剂 烷化碱基（主要是,G,）,AT=GC,双向转换,烷化磷酸基团,ATTA,的颠换,丧失烷化的嘌呤,GCCG,的颠换,糖,-,磷酸骨架的断裂 巨大损伤（缺失、重复、倒位、易位）,丫啶类 碱基之间的相互作用（双链变形）码组移动（或）,紫外线 形成嘧啶的水合物,GCAT,转换,形成嘧啶的二聚体码组移动（或）,电离辐射 碱基的羟基化核降解,AT=GC,双向转换,DNA,降解 码组移动（或）,糖,-,磷酸骨架的断裂 巨大损伤（缺失、重复、倒位、易位）,丧失嘌呤 加热,C,脱氨基,CGTA,转换,Mu,噬菌体 结合到一个基因中间 码组移动,2,、自发突变,(spontaneous mutation),自发突变：是指生物体在无人工干预下自然发生的低频率突变。,原因：,（,1,）由背景辐射和环境因素引起；,（,2,）由微生物自身有害代谢物引起；,（,3,）由,DNA,复制过程中碱基配对错误引起等；,（,4,）转座（,Indel,诱变假说）。,（四）紫外线对,DNA,的损伤及其修复,1,、损伤机制,紫外线的主要作用是使同链,DNA,的相邻嘧啶间形成共价结合的嘧啶二聚体。二聚体的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，影响,DNA,的复制和转录，从而引起突变或使细胞死亡。,2,、修复机制,（,1,）光复活作用,经紫外线照射后的微生物立即暴露于可见光下时，可明显降低其死亡率的现象，称为光复活作用。（,光解酶,）,（,2,）切除修复（暗修复）,是活细胞内一种用于修复被紫外线等诱变剂（包括烷化剂、,X,射线和,射线等）损伤后的,DNA,的机制。这种修复作用与光无关。,二、突变与育种,（一）自发突变与育种,（二）诱变育种,指利用物理、化学等诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的筛选方法，从中挑选出少数符合目的的突变株，以供科学试验或生产实践使用。,1,、诱变育种的基本环节,2,、诱变育种的原则,（,1,）选择简便有效的诱变剂；,（,2,）挑选优良的出发菌株；,（,3,）处理单细胞或单孢子悬液；,（,4,）选用最适的诱变剂量；,（,5,）充分利用复合处理的协同效应；,（,6,）利用和创造形态、生理与产量间的相关指标；,（,7,）设计高效筛选方案；,（,8,）创造新型筛选方法。,Ames test,理论依据：一切生物的遗传物质基础都是核酸，所以任何能改变核酸结构的因素都可引起核酸生物学功能的改变。,生物的“三致”（致突变、致畸变、致癌变）物质可引起核酸结构的改变，从而引起其功能的改变。,基本原理：,Salmonella typhimurium,的,his,-,菌株在,-,的平板上不能生长，如发生回复突变，则能生长。,春日霉素产生菌的孢子悬液,诱变,涂布平板,培养,2,天（,29,）,培养,4-5,天,(,29,),生物鉴定板上含供试菌种,培养,17-18,小时,(29,）检查抑菌圈的大小,（,1,）产量突变株的筛选,3,、,3,类突变株的筛选方法,（,2,）抗药性突变株的筛选,（,3,）营养缺陷型突变株的筛选,与筛选营养缺陷型有关的三类培养基,基本培养基,(,minimal midium,，,MM)-,；,完全培养基,(complete medium,，,CM)+,；,补充培养基,(supplemental medium,，,SM)A,与营养缺陷型突变有关的菌体,野生型,(,wild type,),能在,-,中生长；,营养缺陷型,(auxotroph),能在,+,或,A,生长；,原养型,(prototroph),能在,-,中生长。,营养缺陷型突变株的筛选方法,抗生素法,菌丝过滤法,青霉素法,制霉菌素法,原菌株,(,出发菌株,),诱变剂处理,淘汰野生型,检出缺陷型,鉴定缺陷型,同一培养皿,夹层培养法,限量补充培养法,不同培养皿,逐个检出法,影印接种法,生长谱法,抗生素法,菌丝过滤法,夹层培养法,逐个检出法,影印接种法,营养缺陷型的鉴定,生长谱法,无菌水洗下,离心清洗后配成菌悬液（,10,7,-10,8,/ml,）,0.1ml,-,.,+,培养,举例,枯草杆菌氨基酸缺陷型,菌体前培养,氨基酸缺陷型菌株的营养要求的鉴定,细胞悬浮液制备,诱变处理,中间培养,淘汰野生型,营养缺陷型菌株的检出,（影印培养法）,（使细胞处于对数生长期）,（,UV,照射,60s,）,（调整细胞浓度为,10,8,个,/ml,）,（,30,度振荡过夜培养）,（青霉素法）,第三节 基因重组和杂交育种,基因重组的定义：两个独立基因组内的遗传基因，通过一定的途径转移到一起，形成新的稳定基因组的过程称为基因重组或遗传重组，简称重组。,一、原核生物的基因重组,（一）转化（,transformation,）,1,、定义：受体菌直接吸收供体菌的,DNA,片段而获得后者部分遗传性状的现象。形成的重组细胞称为转化子。,2,、影响菌株间发生转化的因素,与它们在进化过程中的亲缘关系有关；,最易与细胞表面结合的是,dsDNA,；,转化需要的最低,DNA,浓度极低（,10,-5,g/ml,）,;,发生转化的细胞必须处于感受态（,受体细胞最易接受外源,DNA,片段并能实现转化的一种生理状态,）。,3,、转化过程,4,、转染,(transfection),用提纯的病毒核酸（,DNA,或,RNA,）去感染其宿主细胞，可增殖出一群正常病毒后代的现象称为转染。,与转化的区别：,病毒或噬菌体并非遗传基因的供体菌；,中间不发生任何遗传因子的交换或整合；,最后不产生具有杂种性质的转化子。,（二）转导,(transduction),定义：通过缺陷噬菌体的媒介，把供体细胞的小片段,DNA,携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。由转导作用而获得部分新性状的重组细胞称为转导子。,1,、普遍转导,(generalized transduction),定义：通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何,DNA,小片段的“误包”，而将其遗传性状传递给受体菌的现象。,（,1,）完全普遍转导,(generalized transduction),（,2,）流产普遍转导,2,、,局限转导,(restricted transduction),定义：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌少数特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象；,（,1,）低频转导（,LFT,）,定义：指通过一般溶源菌释放的噬菌体所进行的转导，引起只能形成极少数（,10,-4,10,-6,）转导子，故称低频转导。,（,2,）高频转导（,HFT,）,定义：局限转导中，若对双重溶源菌进行诱导，就会产生含,50%,左右的局限转导噬菌体的高频转导裂解物，用这种裂解物去转导受体菌，可获得高达,50%,左右的转导子，故称高频转导。,双重溶源菌：同时感染有正常噬菌体和缺陷噬菌体的受体菌。双重溶源菌被紫外线等诱导时，正常的噬菌体（如,）具有补偿缺陷噬菌体（如,dgal,）所缺失的部分基因的功能，使两种噬菌体同时获得复制；存在于双重溶源菌的正常噬菌体被称作助体噬菌体。,3,、溶源转变,（,lysogenic conversion,）,当温和噬菌体感染其宿主而使之发生溶源化时，因噬菌体基因整合到宿主基因上，而使后者获得了除免疫性以外新性状的现象，称溶源转变。,与转导区别：,不携带来任何外源基因的正常噬菌体；,是噬菌体基因而不是供体菌基因提供了宿主新性状；,新性状是宿主细胞溶源化时的表型，而不是经遗传重组形成的稳定转导子；,获得的新性状随噬菌体的消失而同时消失。,（三）接合（,conjugation,）,1,、定义：供体菌通过性菌毛与受体菌直接接触，把,F,质粒或其携带的核基因组传递给后者，使后者获得若干新遗传性状的现象。通过结合而获得新遗传性状的受体细胞称为接合子。,2,、大肠杆菌的四种接合型菌株,（,1,）,F,+,（“雄性”）菌株,指细胞内含有一至几个,F,质粒，并在细胞表面存在与,F,因子数目相当的性菌毛。,与,F,相接触时，可通过性菌毛将,F,因子转移到,F,菌株中，使之也变成,F,+,菌株。,（,2,）,F,（“雌性”）菌株,指细胞中无,F,质粒，细胞表面也无性毛的菌株。,可以通过与,F,+,、,F,或,Hfr,菌株接合而接受供体菌的,F,质粒、,F,因子或,Hfr,菌株的部分或全部遗传信息，相应地可以转变成,F,+,菌株、,F,菌株或含有一系列,Hfr,菌株遗传性的重组子。,（,3,）,Hfr,（高频重组菌株，,high frequency recombination,）,含有与染色体特定位点整合的,F,质粒。,Hfr,菌株与,F,菌株接合时，,Hfr,染色体双链中的一条单链在,F,质粒处断裂，整段单链线状染色体从,5,端开始等速进入,F,细胞，在没有外界干扰的情况下，全部转移过程的完成需要约,100,分钟。由于种种原因,DNA,转移过程常会发生中断，所以越是前端的基因进入,F,细胞的机会越大。,F,质粒决定性别的基因位于线状,DNA,的末端，进入受体细胞的机会最小，故这种接合引起转性的频率最低，但可以出现各种重组子。,中断实验：接合试验的,DNA,转移过程存在着严格的顺序性，在接合进行中采用定时人为中断的方法，可以获得呈现不同数量,Hfr,性状的,F,接合子，据此，可以选定几种有特定整合位点的,Hfr,菌株，使之与,F,菌株进行接合，并在不同时间使其中断，最后，根据,F,中出现,Hfr,菌株中各种形状的时间顺序（分钟），可以绘出较为完整的环状染色体图（,chromosome map,）。,（,4,）,F,菌株,细胞中含有游离的、带小段染色体基因的环状,F,质粒，可与,F,菌株接合，称为,F,菌株。,F,菌株的形成：由,Hfr,菌株中的,F,质粒在不正常切离而脱离核染色体组时所形成。,由,Hfr,异常释放所生成的,F,菌株称为初生,F,菌株；由,F,接受外来,F,因子所产生的,F,菌株叫作次生,F,菌株。,F,因子转导（,F-mediated transduction,）,:,以,F,质粒来传递供体基因的方式。又称性导。,3,、,F,质粒的,4,种存在方式及相互关系,大肠杆菌的接合方式,F,+,F,-,F,+,+F,+,Hfr F,-,Hfr+F,-,Hfr F,-,Hfr+,Hfr,F F,-,F+F,（四）原生质体融合,(protoplast fusion),1,、定义：通过人为的方法，使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。此重组子称为融合子。,2,、原生质体融合的特点,（,1,）重组频率高；,（,2,）不受亲缘关系的影响；,（,3,）能转移多数基因，可获得生产性状更为优良的新物种；,（,4,）两个原生质体表面直接接触，对等融合形成（双向转移）。,3,、原生质体融合的主要步骤,（,1,）选择亲本：,有特殊价值；,有选择性遗传标记。,（,2,）获得原生质体：脱壁酶去除细胞壁（细菌、放线菌、真菌）。,（,3,）原生质体融合：促融合剂,PEG(,聚乙二醇,),或电脉冲。,（,4,）筛选稳定的融合子。,二、真核微生物的基因重组,（一）有性杂交,1,、定义：指不同遗传型的两性细胞之间发生的接合和随之进行的染色体重组，进而产生新遗传型后代的一种育种技术。,2,、举例,酿酒酵母,酒精酵母：产酒精率高但对葡萄糖的发酵力弱；,面包酵母：产酒精率低但对葡萄糖的发酵力强。,亲本的单倍化,有性杂交,杂交后代的检出,筛选优良性状个体,酵母菌有性杂交程序,（二）准性杂交（,parasexual hybridization,）,1,、准性生殖：同种两个不同菌株的体细胞发生融合，且不以减数分裂的方式而导致低频率的基因重组并产生重组子。,2,、准性生殖过程,（,1,）菌丝联结：频率低；,（,2,）形成异核体：质配；,（,3,）核融合：核配；,（,4,）体细胞染色体交换和单倍体化。,3,、准性杂交育种,Penicillum urticae,的准性杂交,第四节 基因工程,一、基因工程的定义,又称遗传工程，指人们利用分子生物学的理论和技术，自觉设计、操纵、改造和重建细胞的遗传核心,-,基因组，从而使生物体的遗传性状发生定向变异，以最大限度地满足人类活动的需要。,二、基因工程的基本操作,1,、目的基因的获得；,2,、优良载体的选择；,3,、目的基因与载体,DNA,的体外重组；,4,、重组载体导入受体细胞；,5,、重组受体细胞的筛选和鉴定；,6,、“工程菌”的大规模培养。,三、基因工程的应用,1,、在生产多肽类药物、疫苗中的应用；,2,、改造传统工业发酵菌种；,3,、动、植物特性的基因工程改良；,4,、基因工程在环境保护中的应用。,第五节 菌种的衰退、复壮和保藏,一、菌种衰退与复壮,1,、衰退（,degeneration,）：指由于自发突变的结果，而使某物种原有一系列生物学性状发生量变或质变的现象。,常见的衰退现象：,形态性状的改变；,生长速度变慢，产生的孢子少；,代谢产物生产能力下降；,致病菌对宿主侵染力下降；,抵抗能力、抗不良环境能力减弱。,2,、复壮,狭义：使衰退的菌种重新恢复原来的优良特性称为复壮。,广义：在菌种衰退前，有意识地选择到自发的正变个体。,（一）衰退的防止,1,、控制传代次数；,2,、创造良好的培养条件；,3,、利用不易衰退的细胞传代；,4,、采用有效的菌种保藏方法。,（二）菌种的复壮,1,、纯种分离法；,2,、通过宿主体复壮；,3,、淘汰已衰退的个体。,二、菌种的保藏,1,、目的存活，不丢失，不污染；,防止优良性状丧失；随时为生产、科研提供优良菌种。,2,、原理,选用优良的纯种（最好是休眠体，如分生孢子、芽孢等），创造降低微生物代谢活动强度、生长繁殖受抑制、难以发生突变的环境条件（其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养 以及添加保护剂等）。,3,、菌种保藏的方法,连续在培养基上（内）移种,生活态 传代培养保藏法,固体斜面,连续在活宿主上（内）移种,湿法 半固体琼脂柱,休眠态 液体介质（蒸馏水、糖液、其它溶液）,干法 保藏在玻璃管内,吸附在合适的载体上,几种常用菌种保藏方法,方法名称,主要措施,适宜菌种,保藏期,评价,冰箱保藏法（斜面）,冰箱保藏法（半固体）,石蜡油封藏法,沙土保藏法,冷冻真空干燥法,低温,低温,低温、缺氧,干燥、无营养,干燥、无氧、低温、有保护剂,各大类,细菌、酵母菌,各大类,产孢子微生物,各大类,36,月,612,月,12,年,110,年,515,年以上,简便,简便,简便,简便有效,简便有效,国内外菌种保藏机构,中国微生物菌种保藏委员会,(CCCCM),美国的典型菌种保藏中心,(ATCC),英国国家典型菌种保藏所（,NCTC,）,法国里昂巴斯德研究所（,IPL,）,