第三章--基因克隆载体1.ppt

Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,Click to edit Master title style,Gene Engineering,基因克隆载体,概述,DNA,克隆载体,通过不同途径将承载的外源,DNA,片段（基因）,带入,受体细胞且能在其中维持的,DNA,分子。也称,DNA,克隆载体,。,1、,具有多种单一核酸内切酶切割位点（,多,克隆位点,）,(一个或多个),外源DNA插入，不影响载体复制。,2、能携带外源DNA片段进入受体细胞,能,自我复制,，或,整合,到染色体随受体细胞DNA复制而,复制,。,3、有选择克隆子的,标记基因,（筛选标记）,。,必备条件,基因克隆载体,概述,4、,分子量小，拷贝数高，易从宿主细胞中分离。,5、,安全性(不含损害受体的基因,不任意转入别的,尤其人的细胞),。,基因克隆载体,概述,3.1,质粒克隆载体,一、质粒（Plasmid）,独立于染色体外能够,自主复制,的,双链闭合环状,DNA分子（少数为线状）。,大肠杆菌质粒,3.1,质粒克隆载体,一、质粒（Plasmid）,质粒性质,3.1,质粒克隆载体,一、质粒（Plasmid）,3.1,质粒克隆载体,二、,质粒适于载体构建的,一般特点,、组成与构型,质粒(plasmid)是染色体外裸露的双链DNA分子,（,细菌,、真菌、蓝藻、绿藻）,。,构型：,l-DNA,oc-DNA,ccc-DNA,、分子小,1,200,kb,大小差异很大，一般在10Kb左右。,3.1,质粒克隆载体,二、,质粒适于载体构建的,一般特点,3,、,复制,特点,3.1,质粒克隆载体,二、,质粒适于载体构建的,一般特点,特点：在宿主细胞内进行单向复制。,拷贝数（细胞内质粒与染色体数量之比值）,（）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳定。,严紧控制型：,1,数个拷贝；大质粒,松驰控制型：,10,个以上拷贝；小质粒。,经氯霉素处理，宿主中质粒大量扩增（如,ColE1,拷贝数达,3000,个）。,3,、,复制,特点,3.1,质粒克隆载体,二、,质粒适于载体构建的,一般特点,（）质粒复制的控制因素,cop,基因：,指令宿主合成阻遏物，当质粒,复制到一定拷贝数时，阻遏物也,合成积累，直到阻止质粒的,继续复制。,3,、,复制,特点,3.1,质粒克隆载体,二、,质粒适于载体构建的,一般特点,rep,基因：,指令宿主合成一种调节蛋白，促进质粒的复制,3,、,复制,特点,3.1,质粒克隆载体,二、,质粒适于载体构建的,一般特点,par序列：,附着在细胞膜上，使质粒随细胞分裂而正确地分配到子细胞中，维持相对稳定的拷贝数,。,、质粒的不亲合性,3.1,质粒克隆载体,二、,质粒适于载体构建的,一般特点,亲和性质粒,：能在同一细胞中复制的几种质粒,不亲和性,（不相容性）质粒：不能在同一细胞中复制的质粒。,意义：,宿主细胞内的原有质粒与克隆载体的质粒必须是亲和性质粒，最好不含内源性质粒,。,、质粒的不亲合性,3.1,质粒克隆载体,、质粒迁移,3.1,质粒克隆载体,二、,质粒适于载体构建的,一般特点,（）接合质粒：,含tra基因合成细胞表面物质（鞭毛）质粒DNA入受体细胞,含tra基因的质粒称为,接合质粒,。如F、Ti等,不含tra基因的质粒称为,非接合质粒,。如ColE1、pPbS等,（）迁移作用：,不含,tra,基因而含,bom,（,ori,）,位点的质粒，当宿主细胞存在辅助质粒,mob,基因,产物时，即可打开,ori,位点，非结合质粒借助接合质粒,tra,基因的产物而迁移入受体细胞。这种现象称,质粒的迁移作用,、质粒迁移,3.1,质粒克隆载体,二、,质粒适于载体构建的,一般特点,、显性质粒和隐蔽质粒,3.1,质粒克隆载体,二、,质粒适于载体构建的,一般特点,宿主因含某种质粒而呈现出新的性状，称为显性质粒。,显性质粒,质粒：含有,氨苄青霉素Ap/Amp,（抗性质粒）,氯霉素Cm/Cap,卡那霉素Km/Kan,四环素Tc/Tet,Col,质粒（产大肠杆菌素）,质粒（引起细胞结合的育性质粒）,降解毒物的降解质粒,i,质粒,隐蔽质粒,蓝藻内源质粒,能够催化双链,DNA,片段紧靠在一起的,3,羟基端与,5,磷酸基团末端之间形成磷酸二酯键，使两末端连接起来的酶。,DNA,连接酶,两种类型,（1）,E.coli,DNA,连接酶,（2）,T4 DNA,连接酶,知识回顾,DNA,重组类型,知识回顾,插入重组：,外源,DNA,片断两端具有相同的末端，待重组的,DNA,分子用某种限制性核酸内切酶切割后产生与外源,DNA,相同的末端，并且这种限制性核酸内切酶在此,DNA,分子上只有一个识别序列。,置换重组,外源,DNA,两端具有相同的末端；待重组,DNA,这样的限制性内切酶有两个识别序列，酶切后与外源,DNA,连接，产生重组,DNA,分子。,1.,DNA,连接酶连接作用的特点正确的是（）,多选题,知识回顾,A.,DNA,连接酶需要一条,DNA,链的,3,末端有一个游离的羟基（,OH,），另一条,DNA,链的,5,末端有一个磷酸基（,P,）的情况下，才能发挥连接,DNA,分子的作用。,B.只有当,3,OH,和,5,P,彼此相邻，并且各自位于与互补链上的互补碱基配对的两个脱氧核苷酸末端时，,DNA,连接酶才能将它们连接成磷酸二酯键。,C.,DNA,连接酶不能连接两条单链的,DNA,分子或环化的单链,DNA,分子，被连接的,DNA,链必须是双螺旋,DNA,分子的一部分。,D.,DNA,连接酶可以用以封闭双链,DNA,的某一条链上失去一个或数个核苷酸所形成的单链裂口（,gap,）。,ABC,DNA,克隆载体,通过不同途径将承载的外源,DNA,片段（基因）,带入,受体细胞且能在其中维持的,DNA,分子。也称,DNA,克隆载体,。,知识回顾,1、,具有多种单一核酸内切酶切割位点（,多,克隆位点,）,(一个或多个),外源DNA插入，不影响载体复制。,2、能携带外源DNA片段进入受体细胞,能,自我复制,，或,整合,到染色体随受体细胞DNA复制而,复制,。,3、有选择克隆子的,标记基因,（筛选标记）,。,必备条件,知识回顾,4、,分子量小，拷贝数高，易从宿主细胞中分离。,5、,安全性(不含损害受体的基因,不任意转入别的,尤其人的细胞),。,知识回顾,亲和性质粒,不亲和性,质粒,能在同一细胞中复制的几种质粒,。,不能在同一细胞中复制的质粒。,不含,tra,基因而含,bom,（,ori,）位点的质粒，当宿主细胞存在辅助质粒,mob,基因产物时，即可打开,ori,位点，非结合质粒借助接合质粒,tra,基因的产物而迁移入受体细胞。这种现象称,迁移作用,知识回顾,、,能进行有效复制复制起始位点（最好是多拷贝）,复制子由,复制起点、复制区、复制终点,组成。,是能够进行独立复制的一种遗传因子。,每一个复制子都含有一个特定的RNA聚合酶结合的序列和DNA复制起始部位，即开始复制的复制区。,3.1,质粒克隆载体,三、,质粒载体,的,构建,用来插入外源DNA片段，且不影响复制。,2,、标记基因抗性基因，,Lac,Z基因,筛选的标志，理想的载体应该有两种抗菌素抗性的基因。,3,、克隆位点组装MCS连杆,3.1,质粒克隆载体,三、,质粒载体,的,构建,3.1,质粒克隆载体,三、,质粒载体,的,构建,、分子尽可能小（转化率高），,15kb转化率,、组装各种“元件”，如启动子、终止子等,3.1,质粒克隆载体,三、,质粒载体,的,构建,严密的实验设计构建（切割、修饰和连接重组）,过,程,构建原则,1、选用合适的出发质粒：含必备的元件，如ori、选择标记、,克隆位点、启动子和终止子,。,2、正确获得构建质粒克隆载体的元件。,3、组装合适的标记基因。,4、选用合适的启动子。,5、构建过程力求简单。,1,、pBR322构建,目标是缩小基因组的体积，移去一些对基因克隆载体无关紧要的DNA片段，限制酶识别位点。,质粒载体命名法则,“pBR322”,p：质粒（plasmid),BR：两位主要构建者,322：实验编号,3.1,质粒克隆载体,四、,代表性实例,（一）,pBR322,及其衍生载体,ColE1,松驰型，筛选系统复杂。,衍生的pMB1为出发质粒（松弛型复制起始位点，但缺较好的选择标记基因和克隆位点）。,pSC101,（最早用于DNA克隆的载体），严紧型，含有Tc,r,基因。,构建过程,(,出发质粒：,pMB1),2、,pBR322优点,（,1,）较小的分子量,10kb以内DNA分子纯化过程中可避免断裂，,pBR322易于自身纯化，且可克隆6kb左右的外源DNA,。,（,2,）较高的拷贝数,经氯霉素扩培后达,1000,3000 copys/cell,（,3,）两种抗菌素抗性基因,插入失活，分两次先后选择。,3.1,质粒克隆载体,四、,代表性实例,（,二,）、pUC18/19质粒载体,与pBR322区别：,乳糖操纵子的一个DNA片段,（,lac Z基因）,替换Tcr基因；组装了一个多克隆位点（MCS）连杆,。,命名p UCUniversity of California的科学家首先构建。,图3-3,pUC,包括四个组成部分：,（1）,复制起点,pBR322的ori,。,（,2,）,Ap,m,r,基因,pBR322的,Amp,r,。,（,3,）,lacZ,的启动子,大肠杆菌,（,4,）在,lacZ,基因,大肠杆菌,lacZ,的a-肽链序列，是LacZ的氨基酸片段。,含乳糖操纵子的启动子、调节因子和,-半乳糖苷酶的N端146残基(-肽)合成有活性的,基因（lac Z）的质粒载体引入可编 -半乳糖苷酶,码C端部分残基的宿主(与Lac Z互补,的大肠杆菌),在含IPTG（异丙基-D-硫代半乳糖苷）和,X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖）,蓝色菌落,的诱导培养基上培养,在N端-肽的编码区插入MCS 不影响lac Z基因功能,插入外源DNA 灭活lac Z基因,白色菌落,Lac Z,筛选机制：,pUC,质粒载体的优点,分子量更小、拷贝数更高,筛选方便,X-gal显色、抗菌素双重直接选择。,克隆便利,具有多克隆位点,（MCS），使两个不同粘性末端的外源DNA方面的插入。,测序方便,TA,克隆载体,针对,PCR,产物的克隆,原理,PCR,产物在,Taq,酶的非模板依赖活性作用下，于,3,端加一非配对的,A,。,故可研制一种线性载体，其,5,端各带一不配对,T,，可直接与,PCR,产物以,TA,连接进行克隆，即,TA,克隆。,TA,载体的再生方法,（,1,）克隆载体线性化,（,2,）克隆载体末端补平反应,（,3,）克隆载体末端加,T,反应,注：再生后的,TA,载体，原线性化的酶切位点消失,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,一、病毒的一般特征,病毒基本结构,DNA,（或,RNA,）,+,外壳蛋白,感染细菌的病毒，,称为噬菌体,。,分类,温和性病毒：,溶原性增殖,烈性病毒：,溶菌性增殖,生活周期,溶菌周期,感染细菌后立即在菌体内复制和合成蛋白质外壳，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,一、病毒的一般特征,溶源周期,感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中。形成这一过程称为溶源化。,生活周期,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,一、病毒的一般特征,噬菌体载体,单链噬菌体载体-M13,双链噬菌体载体-,噬菌体,cosmid克隆载体,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,一、,噬菌体克隆载体,DNA+,外壳蛋白,1,、,DNA(48.5kb),噬菌体中：线性,宿主细胞：环状,(cos,位点,),3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,（一）性质,cos,位点,2、噬菌体基因组有基因,61,个以上,有一半是必须的，与自身的活动有关，成簇排列；,大约1/3为非必须的，,J与N、P与Q之间为非必需序列,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,（一）性质,3、限制性核酸内切酶位点:56种,4、,噬菌体的生长途径,溶菌生长途径,溶,源,生长途径,5、,DNA 的复制模型,复制,滚环式复制,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,（一）性质,进入溶原状态时，只有少量基因表达，包括编码阻遏物的cI基因（抑制裂解基因的表达），正向调控自身基因的表达；int基因的表达（整合到基因组）。,研究,E.coli,DNA复制时，采用,3,H标记的T，经放射自显影和电子显微镜拍照，展示了“”形结构而得名。,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,这种复制方式在下列生物DNA中有：,（1）噬菌体：,M13、,174、G4,、,DNA,基因复制。,（2）细菌：,E.coli DNA,、细菌致育因子F。,（3）真核生物：非洲爪蟾卵母细胞rDNA的复制。,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,一、,噬菌体克隆载体,滚环复制过程,（,1,）双链环状,DNA,的（,+,）链从“,ori”,处切刻开。,5-,端离开环。,(-),5,ori,（+）,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,一、,噬菌体克隆载体,DNA聚合酶以（-）链环为模板，从（+）链的3-OH端共价延伸，合成子代（+）链DNA。,(-),5,3,(2),SSB,覆盖在（+）链的5-端单链上，,（+）,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,一、,噬菌体克隆载体,(4)DNA聚合酶以延伸的单链DNA为模板，合成子代双链DNA。,(-),5,3,3,5,(3)象拉卷尺一样，（+）链越拉越长。,66,（+）,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,一、,噬菌体克隆载体,(5)连接各岗崎片段，子代DNA形成线状或环状。,(-),5,3,3,5,67,（+）,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,一、,噬菌体克隆载体,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,一、,噬菌体克隆载体,1、噬菌体是一种温和噬菌体,对大肠杆菌有很高的感染性，以原噬菌体的形式长期潜伏在溶原细胞里，容易保存。在一定条件下又可转入溶菌生长途径，进行大量繁殖。,2、能承载较大的外源DNA片段,DNA头部可包装约36.451kb(自身的75%105%)，且约有20kb DNA可缺失（生长非必需）,3、在DNA上有多种限制性内切酶位点,（二）构建依据,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,一、,噬菌体克隆载体,策略:,切去,部分,非必需区,;,删掉,多余,的限制性内切酶位点,;,插入选择性,标记基因,;,建立,体外包装系统,。,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,一、,噬菌体克隆载体,（三）构建的基本策略与技术路线,技术路线,1,、用限制性酶切去非必需区，抹去多余识别位点,选定一种酶，以,gtWES,为例，,EcoRI,（如图）。,（,48.5kb,）,DNA,E co R I,6,个片段,A=21.6 B=4.9 C=5.5 D=7.5 E=5.9 F=3.3,B片段是噬菌体生长非必需的；,C片段缺失可阻断溶原生长途径，但不影响溶菌途径；,E片段去掉不影响溶菌生长途径的min5序列（2.6kb）。,两端EcoR I别点经点突变或甲基化处理，即得gtWES：（48.5-5.5-2.6=40.4kb）,克隆能力：,替换,B,（置换重组）：,最大：,51-(40.4-4.9)=15.5kb,最小：,36.4-(40.4-4.9)=0.9kb,插入,B,的任一侧（插入重组）,最大：,51-40.4,10.6,最小：无,实际应用时克隆能力略有出入,2、在DNA的非必需区内插入选择标记基因,（1）取代red和gam基因,外源DNA取代 获Spi-表型,在P,2,噬菌体溶原性细胞中能生长,野生型噬菌体(Spi+表型),在P,2,噬菌体溶原性细胞中不能生长,局限性：只能以P,2,噬菌体溶原细胞作为受体,（2）最常用的筛选标记：Lac Z基因,3,、建立重组,DNA,分子体外包装系统,体外重组,DNA,分子必须经体外包装成噬菌体颗粒后，才能转导受体细胞。,在试管中与,噬菌体,的头部和尾部蛋白人工装配成噬菌体颗粒，才能高效地感染大肠杆菌，把重组DNA注入受体菌。,（四）,噬菌体克隆载体的应用（自学）,建立,cDNA,基因文库,克隆外源目的基因,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,一、,噬菌体克隆载体,噬菌体载体,单链噬菌体载体-M13,双链噬菌体载体-,噬菌体,cosmid克隆载体,知识回顾,思考题,1,、名词解释：基因克隆载体、迁移作用、接合质粒、亲和质粒、显性质粒。,2,、任一,DNA,分子都可作为克隆载体使用吗？为什么？,3,、构建质粒载体时需考虑哪些特性？讲究何策略？遵循什么设计原则？,4,、指出,pBR322,的结构来源，并图示,pBR322,的构建。,5,、简述,Lac Z,的筛选机制。,6,、,pUC,质粒的基本结构组成。,1,、,DNA,噬菌体中：线性,宿主细胞：环状,(cos,位点,),cos,位点,知识回顾,2,、噬菌体的生长途径,有两种，分别是：,溶菌生长途径,和,溶,源,生长途径,。,3、在溶菌生长途径中，,DNA 的复制有两种模型：,复制,和,滚环式复制,。,知识回顾,1、噬菌体是一种温和噬菌体,对大肠杆菌有很高的感染性，以原噬菌体的形式长期潜伏在溶原细胞里，容易保存。在一定条件下又可转入溶菌生长途径，进行大量繁殖。,2、能承载较大的外源DNA片段,DNA头部可包装约36.451kb(自身的75%105%)，且约有20kb DNA可缺失（生长非必需）,3、在DNA上有多种限制性内切酶位点,简述,噬菌体,载体的构建依据？,知识回顾,由质粒和含cos位点的,DNA,片段组装成的载体，即cosmid,.,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,二、,cosmid,克隆载体（柯斯质粒载体）,DNA,质粒,含cos位点,和控制包装的序列,复制子,抗药性基因,克隆位点,（一）构建策略,?,1、环形双链DNA分子,36.4kb,一般10kb,2、具有质粒的性质，可转化大肠杆菌，并按质粒方式复制,（二）,cosmid,的特征,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,3、含有一个cos位点,A蛋白,cos末端体外包装成为噬菌体，但不含,噬菌体,溶菌生长途径、溶原生长途径和DNA复制系统,，不会产生子代噬菌体,.,4、cosmid较小，可承载更大的外源DNA,若cosmid为6.5kb，则可承载44.5(51-6.5)kb外源DNA，且能被包装成具有感染能力的噬菌体颗粒。,因此，cosmid克隆广泛用于构建基因组文库。,5、方便的选择,具有抗菌素抗性基因，以及插入失活的选择标记、克隆位点。,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,（,三,）,理论依据,利用Cosmid载体在大肠杆菌中克隆大片段的真核基因组DNA技术，叫“柯斯克隆”。（Cosmid Clone）,cos,位点：包装识别。,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,（,四,）,一般过程,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,（,五,）,cosmid载体克隆的缺点,解决措施,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,cosmid克隆载体由于只有一个cos位点，必须先对cos位点进行处理，构成具有两个cos位点的二联体线性的DNA分子。,当外源的DNA分子插入二联体分子，并且两cos位点的片段大小合适（40kd）就可以被A蛋白切割产生两个cos末端。,丝状噬菌体，内有一,环状单链,DNA,分子,（“,+”,链,DNA,）,大小：,6.4kb,结构：,10,个区,基因间隔区,507bp,（intergenic region，,I,G区）,含复制起始位点及可插入外源,DNA,的位点,三、,M13,噬菌体克隆载体,（一）,M13 DNA,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,三、,M13,噬菌体克隆载体,（一）单链DNA噬菌体的特征,(1)+DNA（ssDNA）.,(2)复制型是双链DNA为中间媒介。,M13噬菌体感染雄性大肠杆菌后，M13的“+”DNA进入细胞，以此为模板复制“-”DNA,由此产生的DNA为,双链DNA,（RF-DNA）。,RF-DNA一般按照环状双链DNA进行复制，同时按照,“+”DNA,转译出一些,包装蛋白,。当RF-DNA达到一定数量时，“+”DNA被阻遏蛋白结合，,阻断“-”DNA复制合成,。,结果细胞只能以,“-”DNA为模板合成新链“+”DNA,，而新链“+”DNA被积累在细胞内的,壳蛋白包装成噬菌体,，不断被挤出宿主细胞。,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,（一）单链DNA噬菌体的特征,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,（一）单链DNA噬菌体的特征,（二）M13的生活周期,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,三、,M13,噬菌体克隆载体,+DNA转录mRNA 翻译形成噬菌体蛋白，,-DNA合成+DNA。,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,策略：在,RF-DNA,的,I,G区插入选择标记基因，并组装合适,MCS,。,1.克隆区域的选定,（2）酶切位点,（1）基因间隔区（intergenic region，,I,G区）,该区域只有一个BsuI酶切位点，其余9个在其他部位。,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,（三）,M13,噬菌体克隆载体的构建策略和途径,三、,M13,噬菌体克隆载体,含复制起始位点及可插入外源,DNA,的位点（不影响M13噬菌体活性）。,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,（三）,M13,噬菌体克隆载体的构建策略和途径,三、,M13,噬菌体克隆载体,2.加入酶切位点,（1）在IG区加入酶切位点,在IG区内插入大肠杆菌的LacZ序列（a-肽序列）。,利用a-肽序列的三个单一酶切位点（Bgl II、Ava II和Pvu I）,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,（三）,M13,噬菌体克隆载体的构建策略和途径,三、,M13,噬菌体克隆载体,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,（三）,M13,噬菌体克隆载体的构建策略和途径,优点：,1,、以双链环形,DNA,为中间媒介复制，可与质粒一样体外纯化操作。,2,、制备的,M13DNA,单、双链都能转染大肠杆菌受体细胞。,3,、单链,DNA,不受包装限制，可包装,M13 DNA,分子,6,倍的,DNA,分子。,4,、可产生大量纯化的含外源,DNA,插入的单链,DNA,分子。,（四）,M13,克隆载体的优点与应用,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,三、,M13,噬菌体克隆载体,主要用途：,克隆、分离单链外源DNA片段,获得的“+”链可直接用于DNA测序,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,（四）,M13,克隆载体的优点与应用,花椰菜花叶病病毒（,CaMV,）,环状双链,DNA,分子,（一）,CaMV,DNA,分子,大小：,8kb,结构：在病毒颗粒中呈开环形式，负链有一缺口，正链有两缺口。进入植物细胞后单链部分被酶解，缺口自行闭合，成为环状,DNA,分子。,3.2,病毒（噬菌体）克隆载体,四、,CaMV,克隆载体,G1,G2,G3,（二）,CaMV,基因区,8,个阅读框（,ORF,）和,3,个间隔区（,IR1,3,）,IR1,ORF VI,与,ORF VII,之间,IR2,ORF VII,与,ORF I,之间,IR3,ORF V,与,ORF VI,之间,IR1,和,IR3,区各有一个启动子结构，分别启动同方向转录,35S RNA,和,19S RNA,，而两者的终止子都在,IR1,区。,35S,启动子,组成型强启动子。组装了,35S,启动子的外源基因可在植物细胞高效表达，在蓝藻细胞内也有效表达。,（三）,CaMV,的增殖和感染,1,、增殖途径：,CaMV,颗粒蚜虫病毒,DNA,进入植物细胞核,转录,19S RNA,翻译,35S RNA,翻译,反转录,“,-”,链,DNA,复制出“,+”,链,2,、,CaMV-DNA,可转染植物细胞,在,ORF II,和,ORF VII,区插入外源,DNA,后仍能转染植物细胞,包装成新的,CaMV,颗粒,（四）构建,CaMV,克隆载体的基本策略和途径,策略：,CaMV-DNA,能侵入植物细胞而将目的基因导入，并且清除,CaMV,对植物的致病性基因,.,途径,1,、构建互补克隆载体。组装,(,目的基因,+,标记基因,),而无感染能力,+,两种基因和感染能力都无彼此获得对方产物感染能力。很少被采用。,2,、构建置换型克隆载体。,置换的外源基因较小,3,、构建混合型克隆载体。,CaMV-DNA,合适的限制性酶切组入,Ti,的,T-DNA,区完成构建,4,、构建,CaMV-,融合基因克隆载体系统。,将,35S,启动子与目的基因融合，高效表达目的基因。,五、烟草花叶病毒（,TMV,）克隆载体,单链正义,RNA,，,6395bp,特点：复制量和外壳蛋白表达量高，寄主范围广，能在整株植物上快速扩散。,TMV,载体构建策略有四种基本形式（自学）（图,3-20,）,思考题,1,、名词解释：,Cos,位点,2,、构建,噬菌体载体的策略及其技术路线。,3,、试从,cosmid,克隆载体的构建策略上说明其特征。,4,、简述病毒的溶原性和溶菌性增殖途径。,5,、,M13,噬菌体载体有何优点和用途？,3.3,染色体定位整合克隆载体,质粒与病毒克隆载体的不足：,1,、转基因生物中游离的外源,DNA,分子能多拷贝复制，但易丢失，导致转基因生物的不稳定性。,2,、随机插入染色体的外源,DNA,片段能稳定维持，但因插入的位点不确定，可能干扰受体细胞基因组的自稳系统，进而导致有害突变，造成选育转基因生物不可知性，增加难度。,基因整合平台系统,基因定位同源重组,(,基因打靶,),整合平台：,即受体细胞基因组上给定的,DNA,区域，是外源,DNA,定位整合的位置。,定位整合克隆载体：,除一般质粒克隆载体必备的元件外，还含有一个或两个与整合平台,DNA,区域核酸序列同源的,DNA,片段（长度最好,1kb,）。,.,人工染色体克隆载体,人工染色体克隆载体含义和特点,实际上是一种“穿梭”克隆载体：含有质粒克隆载体所必备的第一受体（大肠杆菌）源质粒复制起始位点（,ori,），还含有第二受体（如酵母菌）染色体,DNA,着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及合适的选择标记基因。,特点：能容纳长达,1000,至,3000kb,的外源,DNA,片段。,.,特殊用途克隆载体,一、启动子探针,(promoter probe),型克隆载体,应用范围：研究生物的发育机制,提高目的基因表达产量,进行基因治疗,组成结构：必备转化系统,+,检测部件,检测部件：,1),一个已失去转录功能且易于检测的遗传标记基因,2),克隆位点。,1,、,Kan,r,标记：用于植物细胞,Kan,r,基因,Kan,r,蛋白,卡那霉素 磷酸化卡那霉素不能进入细胞,ATP,2,、,gfp,标记,:,用于真核及原核细胞,gfp,基因,GFP,（绿色荧光蛋白,)395nm/470nm,发射,510nm,（绿色荧光）,3,、,hph,标记,:,用于真核及原核细胞,潮霉素,B,磷酸转移酶基因（,hph,）,二、诱导型表达克隆载体,指启动子必须在特殊的诱导条件下才有转录活性或比较高的转录活性的表达克隆载体,.,诱导条件：二价金属离子、红光、热、干旱,1,、,金属硫蛋白,（,MT,）启动子,2,、干旱诱导表达克隆载体,通过转基因技术使细胞内,积累,果聚糖,和,海藻糖,能不同程度地提高转基因植物,的耐旱性。,干旱诱导性启动子：,Prd29A,3,、红光诱导表达克隆载体,藻蓝蛋白操纵子,2,（,cpc2),蓝藻表达克隆载体,pUTK2,（图,3-34,）,(p143),4,、热诱导表达克隆载体,groESL,启动子蓝藻基因整合平台表达克隆载体,pZL,（图,3-35,）,(p144),三、反义表达克隆载体,-,人工干预基因表达,利用人工合成或重组的、与靶基因互补的一段反义,DNA,或,RNA,片段，特异性地与靶基因结合，从而达到封闭其表达的目的。,应用：,基因治疗,和基因功能的研究,1,、,SOD,基因反义表达克隆载体,2,、,NHE1,基因反义表达克隆载体,人肺癌细胞,Na,+,/H,+,交换泵,1,（,NHE1,）,四、组织特异性表达克隆载体,1,、乳腺组织特异性表达克隆载体,基因工程药物的,生物反应器,人凝血因子,另外，,EPO,、,hALB,均在动物乳腺组织中得以表达。,2,、肿瘤细胞特异性表达克隆载体,基因治疗常用携带某种目的基因（,cDNA,）的特定载体导入靶细胞，希望能在肿瘤细胞内有效表达产物，杀伤肿瘤细胞。,杀伤肿瘤细胞的同时，正常细胞也受到损伤。,肿瘤细胞中特异性高效表达的启动子与肿瘤杀伤基因组成嵌合基因。,3,、神经组织特异性表达克隆载体,早老性痴呆（,AD,）,淀粉样前体蛋白（,APP,）,衍生,神经毒性多肽片段,A,脑部形成淀粉样斑块,4,、花药特异性表达克隆载体（启动子,CA55,）,5,、种子特异性表达克隆载体,(,启动子,7S),五、分泌型表达克隆载体（自学）,六、双启动子表达克隆载体（自学）,七、串联启动子表达克隆载体（自学）,八、含增强子表达克隆载体（自学）,复习第三章,第一节思考题,:,1,、名词解释：基因克隆载体、迁移作用、接合质粒、亲和质粒、显性质粒。,2,、任一,DNA,分子都可作为克隆载体使用吗？为什么？,3,、构建质粒载体时需考虑哪些特性？讲究何策略？遵循什么设计原则？,4,、指出,pBR322,的结构来源，并图示,pBR322,的构建。,5,、简述,Lac Z,的筛选机制。,6,、,pUC,质粒的基本结构组成。,第二节思考题,1,、名词解释：,Cos,位点,2,、构建,噬菌体载体的策略及其技术路线。,3,、试从,cosmid,克隆载体的构建策略上说明其特征。,4,、简述病毒的溶原性和溶菌性增殖途径。,5,、,M13,噬菌体载体有何优点和用途？,三、四、五节思考题,1,、名词解释：人工染色体克隆载体、诱导型表达克隆载体,2,、染色体定位整合系统的组成。,3,、启动子探针型载体的检测部件组成。,已知,DNA,分子大小为,48.5kb,，,EcoRI,在该,DNA,上有,5,个识别位点，依次在,3.1,、,9,、,16.5,、,22,、,26.9,。若完全酶切，切割的片段依次用,A,、,B,、,C,、,D,、,E,、,F,表示。（酶切后片断大小变化忽略不计）。其中，,E,片段是,噬菌体生长非必需的；,D,片段缺失可阻断溶原生长途径，但不影响溶菌途径；,B,片段去掉不影响溶菌生长途径的,min5,序列（,2.6kb,）。,gtWES,是切去,D,片段，保留,E,片断两端的位点，,B,两端甲基化处理，去掉,B,片段内,min5,序（,2.6kb,）。,试问：,gtWES,置换和插入外源,DNA,片断的范围。,替换,B,（置换重组）：,最大：,51-(40.4-4.9)=15.5kb,最小：,36.4-(40.4-4.9)=0.9kb,插入,B,的任一侧（插入重组）,最大：,51-40.4,10.6,最小：无,复习第二章,名词解释：,溶菌周期；溶原周期；限制性核酸内切酶；粘性末端；平末端；同裂酶；同尾酶；,1,酶活性单位；,Star,活性；限制性图谱；,PCR,；变性；退火；延伸；平台期；,PCR,扩增引物；,Linker,；衔接头；,MCS,连杆；,DNA,连接酶；插入重组；置换重组。,简答题：,天然DNA来源与用途；质粒DNA和,噬菌体DNA的提取原理；限制性核酸内切酶的命名法则；,型限制性核酸内切酶的特性；双酶切法绘制限制性图谱；PCR反应的基本原理；Taq聚合酶的特性；优化PCR反应条件包括哪些方面；PCR引物设计原则；简述PCR的特殊类型；DNA连接酶连接作用的特点。,试论述DNA片段之间的连接。,限制性核酸内切酶,切割片断大小,Eco,RI,1.2,Sma,I,1.2,Hin,dIII,0.6 0.6,Eco,RI+,Sma,I,0.3 0.9,Eco,RI+,Hin,dIII,0.1 0.5 0.6,Sma,I+,Hin,dIII,0.2 0.4 0.6,复习第一章,基因工程的概念。,基因工程技术的主要步骤有哪些？,基因工程的理论依据是什么？,如何看待基因工程的安全性问题。,Thanks,生命科学学院,