第五单元----验证实验.ppt

,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,第五单元,细胞免疫和非特异免疫功能检测技术,实验一 外周血单个核细胞的分离,（不连续密度梯度法）,（验证性实验）,实验目的,外周血单个核细胞指淋巴细胞和单核细胞，是免疫学实验中最常用的细胞群。,在研究免疫细胞时，常常需要先将淋巴细胞等分离纯化，再进一步进行检测。,根据,各种血细胞的体积、形态、密度和比重均有差异，,可将不同的细胞分离。,实验原理,不同类别人类血细胞的密度如下：,多形核白细胞比重,1.092,血小板比重约为,1.032,单个核细胞比重为,1.076,1.090,红细胞比重为,1.093,利用一种比重介于,1.075,1.092,之间等渗的,聚蔗糖,-,泛影葡胺,（,ficoll-hypaque,）混合液（,淋巴细胞分离液,），比重为,1.0770.001,，进行密度梯度离心。,离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布。,实验原理,红细胞和多形核粒细胞密度大于分离液，沉于管底；,血小板因密度小而悬浮于血浆中；,单个核细胞的密度略小于分离液，悬浮于分离液上层与血浆层交界处，呈云雾状白膜层。,血浆,单个核细胞,分离液,粒细胞,红细胞,2,取分离液,2ml,置入灭菌离心管内，用毛细,吸管将稀释血液,4ml,沿管壁加入离心管，使,稀释血液重叠于淋巴细胞分离液上（分离液,与稀释血液体积比例为,1,：,2,）。,分离液,3,配平后将离心管置于水平式离心机内，,以,2000r/min,离心,20min,。,实验方法,4,离心后管内容物从上至下分为四层：,上层为血浆层,中层为细胞分离液,下层为红细胞和粒细胞,上、中层界面处呈现白色浑浊,即为单个核细胞层。,实验方法,血浆,单个核细胞,分离液,红细胞和粒细胞,5.,用吸管插到血浆与分离液的界面处，沿管壁周缘吸出单个核细胞。,6.,置入另一离心管中，加入倍体积的,Hanks,液混匀，,1500 rpm,离心,10min,。,7.,弃上清，将沉淀细胞振摇重悬后加,Hanks,液。,8.,按上述方法洗涤,2,次。,9.,末次离心后，吸尽上清，再加入,Hanks,液将细胞悬液体积还原至,1ml,。,10.,吸取,20,l,细胞悬液加,380,l,白细胞稀释液混匀,2,3min,。,11.,吸取,15,l,滴入血细胞计数板中，充池计数白细胞数。,实验方法,4,个蓝色区域为白细胞计数池,活细胞可排斥染料不被着色，折光性强,死细胞着蓝色，体积略膨大。,正常情况下，活细胞比例大于,95%,。,结果判断,1,分离不同种类动物外周血单个核细胞时，对分离液的密,度要求不同。,人的细胞密度为,1.077,0.001,。,大鼠为,1.088,0.001,。,小鼠为,1.092,0.001,。,兔为,1.096,0.001,等。,2,将血液稀释后分离可降低血液粘稠度和红细胞聚集，提,高单个核细胞的回收率。,注意事项,3,向分离液管加稀释血液时，应沿管壁缓缓加入，使血液 与分离液形成明显界面。注意轻拿轻放，避免冲散界面。,4,为保持淋巴细胞活性，采血后应在,2h,内分离细胞，尽快完成操作全程。,5,离心时，离心机转速的增加或减少要注重均匀、平稳，以免影响分离效果。,1.,本法制备的单个核细胞悬液能满足许多细胞免疫实验的要求，若需要进一步进行,T,细胞、,B,细胞及单核细胞的纯化，可考虑采用哪些方法？,2.,如何检测细胞得率与淋巴细胞纯度？,实验讨论,福建医科大学 陈敏,实验二,T,淋巴细胞转化试验,（验证性实验）,T,淋巴细胞,增殖分化、,DNA,等大分,子物质合成增加,淋巴母细胞,刺激物,PHA,体积变大,胞浆增多、空泡,核仁明显,核染色质疏松,基本原理,有丝分裂,同位素法,MTT,法,形态法,1.,实验目的,2.,实验原理,3.,试剂与器材,4.,操作步骤,5.,结果判断,6.,注意事项,7.,实验讨论,教学内容,一、形态学计数法,实验目的,1.,掌握,T,淋巴细胞转化试验的原理。,2.,熟悉淋巴母细胞的形态特征及判定方法。,T,淋巴细胞在有丝分裂原,PHA,等刺激后，细胞的形态和代谢发生变化，发生一系列增殖反应，如出现细胞体积增大、核染色质疏松、蛋白质和核酸合成增加，并转化为淋巴母细胞。,实验原理,1.RPMIl640,培养液。,小牛血清,10%,、青霉素,100u/m1,、链霉素,100ug/m1,，用无菌,3%NaHCO,3,调,pH,至,7.2,7.4,。,2.,植物血凝素（,PHA,）。,用含,10%,小牛血清的,RPMI,培养液稀释至,500,1000,g/ml,。,3.,姬姆萨染液。,4.,标本,肝素抗凝人外周静脉血。,5.,器材,细胞培养瓶、,CO,2,培养箱、超净台、高压灭菌器、无菌过滤装置、离心机、显微镜等。,试剂与器材,5%CO,2,37 72h,1500rpm,离心,10min,染色镜检,观察细胞形态,PHA,无,PHA,外周血,0.2ml,吸取白细胞层涂片,操作步骤,1,取肝素抗凝血,0.2ml,，注入预先加有,1.8 ml RPMI 1640,培养液的培养瓶内，同时加入,PHA(500,g/ml)0.1 ml,，对照瓶内不加,PHA,。混匀后置,37,C,、,5%CO,2,培养箱内孵育,72h,，期间每天旋转摇匀一次。,2,培养结束后，弃去上清，混匀细胞，加入离心管中，,1500rpm,离心,10min,。,操作步骤,3,弃上清，吸取白细胞层制片，自然干燥。,4,甲醇固定,1,2min,后，姬姆萨染色,15,20min,，水洗，干燥。,5,油镜下计数,200,个淋巴细胞，观察淋巴细胞的形态变化，计算淋巴细胞转化率。,淋巴细胞标志及功能检测 龚道科,2002.4,未转化的淋巴细胞,淋巴母细胞,结果判断,未转化和转化淋巴细胞的形态特征,转化的淋巴细胞,未转化的淋巴细胞,淋巴母细胞 过渡型,细胞大小,(,直径,m),1220,1216,68,核大小、染色质,增大、疏松,增大、疏松,不增大、密集,核仁,清晰、,14,个,有或无,无,有丝分裂,有或无,无,无,胞质、着色,增多、嗜碱,增多、嗜碱,极少、天青色,浆内空泡,有或无,有或无,无,伪足,有或无,有或无,无,结果判断,1.,分离不同种类动物外周血单个核细胞时，对分离液的密度要求不同。,如分离人的细胞密度为,1.077,0.001,。,大鼠为,1.088,0.001,。,小鼠为,1.092,0.001,。,兔为,1.096,0.001,等。,2.,将血液稀释后分离可降低血液粘稠度和红细胞聚集，提高单个核细胞的回收率。,注意事项,3.,向分离液管加稀释血液时，应沿管壁缓缓加入，使血液与分离液形成明显的界面。注意轻拿轻放，避免冲散界面。,4.,为保持淋巴细胞活性，采血后应在,2h,内分离细胞，尽快完成操作全程。,5.,离心时，离心机转速的增加或减少要注重均匀、平稳，以免影响分离效果。,1.,本法制备的单个核细胞悬液能满足许多细胞免疫实验的要求，若需要进一步进行,T,细胞、,B,细胞及单核细胞的纯化，可考虑采用哪些方法？,2.,如何检测细胞得率与淋巴细胞纯度？,实验讨论,二、,MTT,比色法,实验目的,：,熟悉,MTT,比色法进行淋巴细胞转化试验的原理及其操作方法。,T,淋巴细胞受到,PHA,作用后发生活化增殖，其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，四甲基噻唑蓝（,MTT,）作为其底物参与反应，被催化形成蓝紫色结晶甲臢,(fomazan),，经盐酸异丙醇或溶解后为蓝色溶液。甲臢的形成量与细胞增殖活化的程度呈正相关。,实验原理：,1.RPMIl640,培养液。,2.,植物血凝素（,PHA,）。,3.,标本,肝素抗凝人外周静脉血。,4.,器材,超净工作台、,96,孔细胞培养板、,CO,2,培养箱、高压灭菌器、无菌过滤装置、振荡器、酶联免疫检测仪等。,试剂与器材,5%CO,2,37 68h,1500rpm,离心,10min,酶联免疫检测仪,A,570nm,盐酸异丙醇,100,l/,孔,操作步骤,分离外周血,单个核细胞,1,10,6,/ml,培养板,（含,PHA,）,培养板 （无,PHA,）,加入,MTT,20,l/,孔,4h,100,l/,孔,1.,先采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，并用含,10%,小牛血清的,RPMI 1640,培养液调整细胞浓度至,1,10,6,/ml,。,2.,将细胞悬液加入,96,孔培养板中，,100,l/,孔，每个样品三个复孔，并设相应对照孔。实验孔加含,50,g/ml,的,PHA(,终浓度,5,g/ml)100,l,，对照孔加不含,PHA,的,1640,培养液,100,l,。,3.,混匀后置,37,C,、,5%CO,2,培养箱内培养,68h,。,操作步骤,4,将培养板,1500 rpm,离心,10min,，吸弃上清液，每孔,加,MTT 20,l,，混匀，继续培养,4h,后，每孔加,100,l,盐酸异丙醇，低速振荡,10min,。,5,充分溶解后，采用酶联免疫检测仪双波长,570nm/,630nm,测定各孔,A,值，测定值为,A570nm,减去,630nm,的最终结果。,结果判断,以刺激指数,(SI),判断淋巴细胞转化程度：,1.,实验过程注意无菌操作，避免细菌污染。,2.,淋巴细胞要新鲜制备,一般在采血后,2h,内进行实验。操作时动作要轻柔、迅速，以免损伤细胞。,3.,加入盐酸异丙醇后要在,30 min,内进行测定，若规定时间内来不及测定，可将未加盐酸异丙醇的培养板置,4,C,保存。测定前取出，室温静置,10min,后再加盐酸异丙醇。,注意事项,1.,试讨论,MTT,比色法检测淋巴细胞转化的优缺点？,2.MTT,比色法容易因细菌污染导致实验失败，应采取哪些措施可减少实验误差，使结果可信？,实验讨论,福建医科大学 陈敏,实验三 细胞吞噬率与 吞噬指数测定,（验证性实验）,分类：,大吞噬细胞,单核,-,巨噬细胞系统,小吞噬细胞,中性粒细胞,细胞吞噬率与吞噬指数测定主要检测机体吞噬细胞的功能。,实验目的,实验原理,试剂与器材,操作步骤,结果判断,注意事项,实验讨论,教学内容,一、中性粒细胞吞噬功能测定,观察细胞吞噬现象，熟悉中性粒细胞吞噬作用的原理和检测方法。,实验目的,根据中性粒细胞具有吞噬功能，将吞噬细胞与细菌等颗粒性异物混合孵育一定时间后，推片、染色，于油镜下观察细胞吞噬细菌的情况，计算吞噬率和吞噬指数。,实验原理,1,白色葡萄球菌悬液 浓度,510,8,/ml,，置,4,备用。,2,肝素抗凝管,(,含,20U/ml,肝素,20l),。,3,Hanks,液。,4.,瑞氏染液、,75%,酒精、碘酒、香柏油。,5.,器材,水浴箱、,37,温箱、显微镜、滴管、一次性采血针、试管、玻片、微量移液器、无菌干棉球、洗耳球、接种环等。,试剂与器材,操作步骤,全血与菌液混匀,1.,用碘酒和酒精棉球先后消毒采血针和无名指。,2.,用一次性采血针刺破消毒部位皮肤，取,40l,血加入肝素抗凝管中。,3.,用滴管取一滴菌液加入血试管中，轻摇混匀。,4.,取轻轻取出试管，用微量移液器从试管底部细胞层吸取,5l,于载玻片上，用另一载玻片推成薄血片，晾干。,5.,将瑞氏染液滴于上述血片，先染,30,60s,。然后加等量蒸馏水，用洗耳球吹打混匀，继续染,10,15 min.,6.,水洗，晾干后油镜下观察。,中性粒细胞吞噬时，可见细胞核与被吞噬的细菌均染成紫色，而细胞浆则为淡红色。,结果判断,结果判断,1.,所用器材要洁净、无油污。,2.,白色葡萄球菌悬液中若含有,10%,的小牛血清，可提高吞噬率和吞噬指数。,3.,吞噬细菌的中性粒细胞往往在血片的尾部较多，因此计数时应取血片的前、中、后三段计数，以减少实验误差。,注意事项,1.,中性粒细胞吞噬细菌时，有时难以计数吞入的细菌颗粒。试讨论可从哪些方面改进实验，方便计算吞噬率和吞噬指数？,2.,在实验过程中应注意哪些事项可减少实验误差？,实验讨论,二、巨噬细胞吞噬功能测定,熟悉小鼠腹腔巨噬细胞的制备方法。,了解巨噬细胞吞噬作用的原理和检测方法。,实验目的,巨噬细胞具有很强的吞噬异物及细菌的功能，在体内外均能吞噬颗粒物质。将巨噬细胞与鸡红细胞（,CRBC,）混合后孵育一定时间后，观察巨噬细胞吞噬,CRBC,的百分率和吞噬指数，可了解其吞噬功能。,实验原理,1.,实验动物,昆明种小白鼠，,7,周龄左右，体重,18,22g,，雌雄不限。,2.5%,淀粉肉汤。,3.2%,鸡红细胞（,CRBC,）悬液。,4.,瑞氏染液、,75%,酒精、碘酒、香柏油。,5.,器材,一次性注射器、有齿镊、吸管、手术剪、解剖盘、试管、恒温水浴箱、玻片、离心机、显微镜等。,试剂与器材,操作步骤,1,在实验前,3d,，自小鼠腹腔注射,5,淀粉肉汤溶液,1ml/,只，以,诱导巨噬细胞游离至腹腔。,2,实验时，经腹腔给小鼠注射,2,鸡红细胞悬液,lml,，轻揉,小鼠腹部，使悬液分散。,3.30 min,后，麻醉处死小鼠。,4.,将小鼠置于解剖盘中，常规消毒后，先剪开腹部皮肤，然后提起腹壁斜剪一小口，用不装针头的注射器或吸管吸取腹腔液。,5.,将收集的腹腔液置于离心管中，以,1500rpm,离心,10min,。,6.,弃上清，吸取沉淀细胞涂片，待自然干燥。,7.,将瑞氏染液滴于上述涂片，先染,30,60s,。然后加等量,蒸馏水，用洗耳球吹打混匀，继续染,10,15 min,，水,洗，晾干后油镜下观察。,油镜下可见圆形或不规则形状核呈蓝紫色的巨噬细胞，,CRBC,多为椭圆形胞浆呈淡紫红色有核的细胞。,结果判断,被吞噬消化的鸡红细胞核模糊，核肿胀，染色淡，胞质浅染，胞核呈浅灰黄色。,结果判断,1.,腹腔注射,CRBC,后，要注意掌握好吞噬作用时间。,时间太长,CRBC,可被消化，时间过短则尚未被吞噬。,2.,剪开小鼠腹腔吸取腹腔液时应避免出血，否则将影响试验结果。,3.,涂片的薄厚要适当，否则将影响结果观察。,注意事项,1.,为何在实验前,3d,要给小白鼠腹腔注射,6%,淀粉肉,汤，有何作用？,2.,临床上若需要检测巨噬细胞功能，应如何采集,人巨噬细胞？,实验讨论：,福建医科大学 陈敏,实验四 血清总补体活性测定,（验证性实验）,实验目的,实验原理,试剂与器材,操作步骤,结果判断,注意事项,实验讨论,教学内容：,观察血清补体介导的溶血现象，了解补体系统在免疫反应过程中的效应作用。,实验目的,绵羊红细胞（,SRBC,）与相应抗体（溶血素）结合形成的致敏红细胞可通过经典活化途径激活补体，从而导致,SRBC,溶解。当红细胞与溶血素的浓度恒定时，在规定的反应时间内，补体的量及其活性与溶血程度正相关。,实验原理,溶血程度与补体含量的关系,由于溶血程度在,30%,70%,时，补体的用量稍有变化就会对溶血程度产生很大的影响，所以通常以,50%,溶血程度（,CH50,）作为判定反应终点的指标，而不用,100%,溶血程度。,1.,巴比妥缓冲液（,BBS,，,pH7.4,）。,2.2%SRBC,悬液。,3.,溶血素（抗,SRBC,抗体）按效价用,BBS,稀释至,2,个单位。,4.,待检血清、生理盐水、,17g/L,高渗盐水。,5.,器材 离心机、试管、刻度吸管、恒温水浴箱、,721,分光光,度计、比色杯等。,试剂与器材,操作步骤：,1.,稀释待检血清 吸取新鲜待检血清,0.2ml,，,加入,BBS3.8ml,，将血清进行,1:20,稀释。,2.,制备,50%,溶血标准管 吸取,2%SRBC,悬液,0.5ml,，加蒸馏水,2.0ml,，混匀使红细胞全部溶解，为,100%,溶血管；加入,17g/L,高渗盐水,2.0ml,使之成为等渗溶液，再加入,2%SRBC,悬液,0.5ml,，即成为,50%,溶血管。,3.,取试管,10,支按顺序编号，然后按照下表所示加入各试剂，将各管混匀，置,37,水浴,30min,后测定补体活性。,试管号,BBS,缓冲液（,ml,）,1:20,稀释血清,（,ml,）,2%SRBC,（,ml,）,2U,溶血素（,ml,）,补体溶血活性,（,U/ml,）,1,1.40,0.10,0.5,0.5,37,水浴,30 min,200,2,1.35,0.15,0.5,0.5,133,3,1.30,0.20,0.5,0.5,100,4,1.25,0.25,0.5,0.5,80,5,1.20,0.30,0.5,0.5,66.6,6,1.15,0.35,0.5,0.5,57.1,7,1.10,0.40,0.5,0.5,50,8,1.05,0.45,0.5,0.5,44.4,9,1.00,0.50,0.5,0.5,40,10,1.50,0.00,0.5,0.5,-,结果判断,4.,将各反应管经,2500 r/min,离心,5min,分光光度计波长,542nm,比色,血清总补体活性（,CH50 U/ml,）,1/,血清用量,(ml),血清稀释倍数,选择溶血程度与标准管最接近的管,1.,待检血清应无溶血、无污染、无乳糜血。,2.,待检血清必须新鲜，如放置室温,2h,以上，可使补体活性下降。,3.,补体性质不稳定，其溶血活性可受多种因素的影响，因此，缓冲液、绵羊红细胞等试剂应新鲜配制，所用实验器材应清洁，残留的酸碱等化学物质均可使补体受破坏。,注意事项,4.,绵羊红细胞浓度和溶血素的量应尽可能准确。否则可直接影响溶血程度。,当用高浓度溶血素致敏时，溶血程度则随红细胞浓度的增,加而增加。,红细胞浓度增加一倍，可使,50%,溶血补体量增加,25%,左右。,注意事项,1.,补体的溶血活性为何以,50%,溶血程度（,CH,50,）作为判定反应终点的指标，而不用,100%,溶血程度？,2.,哪些因素可造成,CH,50,结果发生偏差？,实验讨论,福建医科大学 陈敏,白细胞杀菌能力测定,（设计性实验）,白细胞杀菌能力主要检测外周血中性粒细,胞或单核细胞的吞噬和杀菌功能。,实验目的,实验基本原理及背景知识,设计性实验要求,实验设计策略,实验注意要点,设计方案的总结和讨论,教学内容,自主设计并完成实验全过程,观察白细胞的吞噬功能及其代谢变化,熟悉与白细胞杀菌能力相关的指标,学会分析并探讨胞内杀菌机制,实验目的,吞噬细胞可通过趋化、调理、吞噬和杀伤等步骤清除病原体、死亡细胞等异物，是机体非特异免疫的重要组成部分。,与细胞吞噬过程相关的趋化、吞噬、呼吸爆发、脱颗粒等任何阶段功能缺陷均可影响吞噬细胞的杀菌活性。,实验基本原理及背景知识,白细胞杀菌能力的检测方法：,1.NBT,还原试验,2.,细菌计数法,3.,化学发光法,实验基本原理及背景知识,根据实验目的、基本原理以及所提供的实验条件,自主设计,1,2,种检测白细胞杀菌功能的实验方案。,阐明实验原理、观察指标、操作步骤和实验的注意事项。按最佳实验设计方案完成实验全过程，完成实验报告，并进行结果分析与总结。,实验要求,1.NBT,还原试验,设计策略,当细菌感染时，中性粒细胞在吞噬杀菌过程中发生呼吸爆发，糖代谢活性增强。此时，被吞噬进入胞质内淡黄色的,NBT,，可被细胞糖氧化过程中所脱的氢还原成蓝紫色的甲臜,(formazan),，以折光性很强的点状或斑块状颗粒沉积于胞浆内。在镜下检测,NBT,阳性细胞数量，可推知中性粒细胞的杀菌功能。,2.,细菌计数法,设计策略,将一定量的白细胞与细菌按比例混合、培养。作用一段时间之后，在培养体系中加入抗生素杀死胞外细菌，而吞入胞内的细菌则不被抗生素杀灭。定时取样，将白细胞溶解，释放出胞内细菌进行培养，计数生长的菌落即可直接判断中性粒细胞的杀菌功能。,3.,化学发光法,设计策略,当中性粒细胞在吞噬细菌过程中，随着呼吸爆发，产生大量活性氧代谢产物，包括过氧化氢、超氧阴离子、羟自由基等，后者又能激发细胞内某些物质产生化学发光反应，细胞的杀菌能力与发光强度相平行。因此可通过化学发光仪测量发光信号，从而推算细胞吞噬杀菌功能。,1.,实验用的无菌试管、离心管、吸管等应使用硅油处理，以防止细菌和白细胞黏附。,2.,要设实验对照，以排除因细胞溶解或其他原因释放的酶所引起的非特异性反应。,3.NBT,还原与被吞噬过程在时间上是一致的，因此要注意控制白细胞与染料的时间,(30min),，以便得到准确的结果。,注意要点,4.NBT,染料在盐水中不易溶解，故配制,NBT,原液时要过滤去除未溶解的,NBT,颗粒，否则将被吞噬细胞吞噬，从而影响试验结果。,5.,发光剂要注意,4,、避光保存。,注意要点,NBT,还原试验是临床上常用的检测的方法。具有操作简单、快速等优点，但特异性差，影响因素多，容易出现假阴性或假阳性。,试讨论,NBT,试验的原理及其临床意义。,总结和讨论,细菌计数法是检测中性粒细胞胞内杀菌能力的最直接方法，可用于诊断慢性肉芽肿、髓过氧化物酶缺陷症等中性粒细胞杀菌功能缺陷病。但该法操作麻烦、费时，临床较少应用。,化学发光法可在生理温度和中性环境下测定，能较好地反映生理条件下吞噬细胞的功能，具有准确灵敏、简便快速等优点。其敏感性高于,NBT,还原试验。,福建医科大学 陈敏,流式细胞分析系统,（临床见习）,流式细胞分析：,是以流式细胞仪（,FCM,）为检测手段的一种能高速精确地对单个细胞的理化及生物学特性进行多参数定量分析的先进技术。,特点：,单个细胞分析,速度快,多参数,灵敏度高,准确性好,临床分析型,流式细胞仪,综合,(,分选,),型,类型,实验目的,基本原理,见习内容,见习报告,教学内容,熟悉,FCM,的工作原理和技术流程。,了解,FCM,在血液学、细胞遗传学、肿瘤生物学等学科中的应用。,实验目的,基本原理,FCM,在荧光标记探针协助下，对悬浮的单个细胞或微粒表面或内部的化学成分特性进行快速分析或纯化分选。,流动室,计算机系统处理、分析,散射光和特定的荧光信号,待测样品制备,细胞排成单列,激光检测区,先制备待测的单细胞悬液，经过荧光抗体标记后，让待测细胞在气体压力的驱动下流经充满鞘流的流动室。细胞排成单列逐个依次通过激光检测区。,被荧光染色的细胞在垂直入射的激光束照射下，产生了细胞的散射光信号和特定波长的荧光信号。,单细胞悬液,荧光抗体标记,光电倍增管,通过不同的检测器和特定波长选择通透性的滤光片，可获得不同方向的散射光和不同波长的荧光信号来，经过一系列的的光电倍增管放大后，由计算机系统收集、数字化处理，最后通过计算机软件分析结果。,基本原理,单细胞液流柱,流动室振动,液流断裂成液滴,空白液滴,含细胞的液滴,废液容器,偏转落入收集器,超声压电晶体,高频振动,不充电,充电,细胞分选是通过,分离含有单细胞的液,滴而实现的。,FCM,的结构及主要部件,样品制备,免疫荧光标记方法,技术流程,质量控制,设备维护,结果判定,见习内容,流式细胞仪,目前临床型流式细胞仪主要有,FACS Calibur,、,EPICS XL,和,Cytomics FC500,，,两家公司的仪器在使用上有所不同,。,EPICS XL,Cytomics FC500,FACS Calibur,1.,液流系统,2.,光学系统,3.,计算机控制系统,FCM,的基本结构及部件,喷嘴,荧光信号,激光束,鞘液,液流系统,FCM,的液流系统（如何形成单个细胞流）,样本管,鞘液管,FS,前向角散射光检测器,SS,侧向角散射光检测器,FL1,荧光检测器,液滴,激光束,光学系统,FL2,荧光检测器,FL3,荧光检测器,FL4,荧光检测器,散射光信号,:,FS,：反映颗粒的大小,SS,：反映颗粒的内部结构复杂程度,荧光信号,FL1-FL4,：,反映细胞或颗粒上荧光量的多少,数据参数,主要由计算机数据处理及分析软件组成，可进行实验数据的分析、存储与显示。,计算机控制系统,单参数直方图,双参数散点图,二维等高图,假三维等高图,数据显示方式,数据显示方式,三参数散点图,单参数直方图：,由一维参数,(,散射光或荧光,),与颗粒计数,(COUNT),构成。横轴为该参数测量强度相对值，单位是道数。纵轴一般是细胞数或细胞出现的频数。,数据显示方式,双参数散点图：,X,轴代表第一个测量参数,Y,轴代表第二个测量参数,每个点代表一个细胞,数据显示方式,二维等高图：,用等高线来表示细胞数,在一条等高线上细胞数相同,不同的等高线上细胞数不同,数据显示方式,假三维等高图：,纵轴与横轴分别代表被,测细胞的两个测量参数,Z,轴为细胞数。,数据显示方式,FS,SS,三参数散点图：,三维坐标均为参数,（散射光或荧光）,而非细胞数。,数据显示方式,FS,CD45-FITC,CD34-PE,Gate,设置：,指在某张选定参数的直方图上，根据其细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并使该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。,设门分析技术,线性门,矩形门,圆形门,十字门,多边形门,任意形状门,设门分析技术,根据门的形状分为：,外周血,骨髓,组织块,培养细胞,脱落细胞,。,常用抗凝剂：,EDTA,：,2mg/ml,枸椽酸钠：,0.38%,肝素：,15IU/ml,样品制备,标本来源：,标本浓度：,单细胞悬液：,10,6,个,ml,荧光素在流式细胞仪上的检测通道,FITC,，,GFP,，,Alexa Fluor 488,，,YFP,CFSE,Vybrant Green,，,PKH67,PE,，,YFP,PKH26,DsRed,Vybrant orange,PI,PE-Texas Red,，,PE-Cy5,，,PerCP,，,PerCP-Cy5.5,，,PE-Cy7,APC,，,Alexa 647,FL1,FL2,FL3,FL4,常用的荧光染料,常用的荧光染料,FITC,，,AlexaFluor 488,GFP,YFP,CFSE,Vybrant Green,，,PKH67,PE,，,YFP,PKH26,DsRed,Vybrant orange,PI,ECD,PI,AlexaFluor 594,PE-AF610,PE-Cy5,PerCP 7-AAD,FL1,FL2,FL3,FL4,PE-Cy7,FL5,BD,FACSCalibur,的荧光通道,Beckman Coulter,Cytomics FC500,的荧光通道,技术流程,（,1,）分别将鞘液盒及清洁液盒加满，废液桶倒净。,（,2,）依次开启总电源、计算机、显示屏。,（,3,）打开电源箱门，检查：,WATER TRAP,液体不能超过,1/3,VACUUM TRAP,液体不能超过,1/4,AIRFILTER,与,VACUUM FILTER,必需干燥无水,1.,开机程序,技术流程,（,4,）检查,SYSTEM VACUUM,表，负压应在,-1730in.Hg,之间。,（,5,）检查,SYSTEM PRESURE,表，调节压力为,2832PSI,之间。,（,6,）确认仪器,LASER ON,灯亮。,（,7,）确认仪器启动,1030min,后,READY,灯亮（绿色）。,（,8,）确保,LASER HEAD,的风冷气流通畅。,1.,开机程序,技术流程,（,9,）检查样品进样头有负压。,(10),确认计算机屏幕无显示异常的报警。,(11),选择检测,Flow Check,的,PROTOCOL(,方案,),进行,光路与流路的检测、校准。,(,12),选择,Flow-Set Protocol,校准光电倍增管，调,试仪器进入最佳检测状态。,1.,开机程序,(1),选择待测参数 于屏幕右下方用鼠标将需要的参数点成,黄色。选择参数后，可利用屏幕右上方的,User Name,将所选择的信号改成用户需要的名称。,(2),利用参数建立直方图 用鼠标将屏幕右上方的参数点,亮，然后放在直方图的,X,、,Y,轴，创建需要的直方图。,2.,选择相应的,PROTOCOL,或新建方案,(3),界定每张直方图的分析区域,单参数直方图分析区种类：线性,(Lin),双参数直方图分析区种类：矩形,(Rec),任意形,(Amo),十字形,(Qua),数字形,(Num),：,在单参数直方图中为线性在双参数直方图中为矩形。,(4),利用,GATING,建立直方图之间的关系 在设立分析区域的界面下，返回多张直方图显示状态。选择所要的分析区域，将其点亮，放在所要的,GATING,直方图上方。,(5),选择数据采集的停止方式、存储方式、打印方式。,（,6,）存贮方案,SAVE AS,文件名。,（,7,）运行待测标本，调整以下仪器参数：,PMT(,光电倍增管,),、电压,(Volts),增益,(Gain),、检测速度,(Flow Rate),阈值,(Discriminator),颜色补偿,(Color Compensation),（,8,）重新存储方案，将原方案覆盖。,（,1,）选择预先存储的方案。,（,2,）仪器提示,Insert Sample Tube,。,（,3,）将阴性对照的样本管放入样本台上，仪器会自,动检测样本管并进行数据采集。,3.,标本测定,（,4,）电压的调整 用鼠标左键点击,FASTSET,，出现十字标记后，将鼠标移至所需调整的细胞群，按住左键进行调整，松开左键后,仪器会自动重新进行数据采集，相应的电压及增益值会随之改变。,（,5,）样本测试 与上述相同条件下，上样品管进行样本测试。若为双色以上分析，注意调整颜色补偿。,（,6,）调整颜色补偿：用鼠标点击,FAST COMP,将鼠标移置所需补偿的细胞群，拖至正常位置。,用计算机工作软件将串入相邻荧光通道的信号加以扣除，自动校正荧光染料光谱之间叠加所造成的误差。,（,1,）选择已储存的文件。,（,2,）将文件及图形打开。,（,3,）在原有参数的基础上重新建立直方图，设立 直方图打印方式。,4.,结果分析,质量控制,仪器设备,样本处理,试剂,操作过程,数据分析,主要包括：流路和光路的稳定性,荧光颜色补偿,光电倍增管转换的线性和稳定性,1.,仪器的校准,（,1,）光路与流路校准,可使用标准荧光微球（,Flow,Check,）对仪器的光路与样,品流进行校准验证，将变异,系数调整到最小范围。,将,Flow Check,在室温下放,10min,。,选择检测,Flow Check,的,ROTOCOL,。,取,0.5ml(15,20,滴,)Flow Check,放入试管中。,将试管放在样品台上进样检测，取数,5000(FS),。,记录,FS,及荧光,FL1,FL4,的,HPCV,值，核对是否,2%,，是否与以前记录相符。,（,2,）光电倍增管校准,多用质控品进行光电倍增管校准，以保证,FCM,在分析过程中处于最佳状态。,选择,Flow-Set Protocol,。,取,0.5ml(15,20,滴,)Flow-Set,，放入试管中，进样。,取数,10000,，检查,Mean(PEAK)Channel,与所设定的,Flow-Set,的参考值是否相符合。,若不符，则需调整,HV,，使,Flow-Set,的,Mean(Peak)Channel,与设定值相符。,（,1,）同型对照 选用相同源性的未标记单抗,CYTOTROL,作为阴性对照。,（,2,）全程质控 样品标记、溶血、洗涤、仪器质量控制和上机检测的过程都会直接影响检测结果。,一般采用标准质控样品,IMMUNOTROL,来进行全程质控。,2.,实验操作过程的质控,设备维护,在完成样品测试，清洗真空管路之前进行。,（,1,）将漂白水与双蒸水,1:1,稀释，吸,3ml,加入一支试管内。,（,2,）准备,3ml,双蒸水放入试管内。,（,3,）在,ACQUISITION,状态栏下选择,PANEL-Cleaning,Panel,。,（,4,）按照提示，分别将装有稀释的漂白液和双蒸水的试管依次放入样本台。,（,5,）上机执行清洗程序。,1.,日常清洗程序,在每一批样品测试后，关机前进行。,（,1,）按,Cytometer,主机上的,RUN,键，使其处于闪烁状态。,（,2,）将真空管洗器内加满双蒸水，放在样本台上，如此反复,3,次。,（,3,）按下,Cytometer,主机的,CLEANSE,键，进行清洗循,环，结束后整个管道内充满清洁液。,2.,真空管清洗程序,（,1,）完成日常清洗程序。,（,2,）完成真空管清洗。,（,3,）清洁样本台和样本针探头。,（,4,）将装有,2ml,双蒸水的试管放在样本台上。,（,5,）退出,SYSTEM,软件。,（,6,）依次关闭显示屏、计算机、打印机、总电源开关。,3.,关机程序,在操作中较常出现的故障为喷嘴堵塞。排除故障的步骤：,（,1,）放开托臂，用,10%,的次氯酸钠反复冲洗再放回托臂机，如果故障还未排除就应关掉主机。,（,2,）用注射器接上胶管套，在喷嘴上反复抽吸，一般堵塞现象可以排除。,4.,常见故障及排除,白血病,AML-M0,的骨髓细胞,CD,抗原检测结果,结果判定,见习报告,1.,结合见习流式细胞分析系统，简述流式细胞仪的基本结构和工作原理。,2,结合见习流式细胞分析系统，简述流式细胞仪的技术流程。,3.,结合见习流式细胞分析系统和病例报告，简述流式细胞仪的功能及其在临床上的应用。,福建医科大学 陈敏,细胞免疫检测技术的现状及发展,（单元讨论）,细胞免疫是由致敏,T,淋巴细胞及其释放的细胞因子所引起的一系列免疫反应的表现，也包括自然杀伤细胞（,NK,）及,NKT,细胞的杀伤靶细胞作用与吞噬细胞的吞噬作用。,细胞免疫检测技术现状,细胞免疫检测技术发展趋势,概括与总结,讨论内容,淋巴细胞及其各亚群数量和比例,T,细胞增殖试验,细胞因子测定,T,细胞介导的细胞毒试验,NK,细胞杀伤活性,吞噬细胞功能,细胞免疫检测常用项目,:,间接荧光免疫法,酶免疫组织化学法,形态学方法,同位素法,流式细胞术,体外试验常用方法,:,容易出现假阳性和假阴性,不能够真实完整地反映,T,细胞功能。,体内试验常用方法为：迟发型超敏反应,细胞免疫检测技术发展趋势,1.,传统检测方法的改进与新方法建立,2.,应用领域扩展,细胞免疫检测新技术的研究现状及其发展方向。,讨论,细胞免疫技术将更多地利用微控流技术和纳米技术建立细胞免疫检测的新方法，越来越注重细胞组分与表面受体的检测，参数从相对定量绝对定量的方向发展，并强调其在临床疾病诊断中的应用。,概括与总结,福建医科大学 陈敏,