组织学制片技术9.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,目的要求,1、了解组织学制片的基本程序；,2、熟悉HE染色的步骤；,3、掌握HE染色结果的观察。,1切片标本：组织经固定、切片（包括冰冻切片、石蜡切片及火棉胶切片）染色、封固而制成的各种玻片标本。它为组织学中最常用的标本。,一,、组织学常用的几种标本类型,2铺片标本：将肠系膜或皮下组织铺于载玻片上，经固定、染色、封固而制成的标本,。,5分离标本：将极小组织块用化学药物的水溶液浸泡后，溶去其细胞间质，采用机械分离方法（如振荡、针拨等方式）使之分离成单个而又完整的细胞，经染色后涂于载玻片上进行镜检。,6压片标本：组织经化学药物软化及染色后，用盖片压封于载玻片上进行镜检的标本。如运动终板的制作。,7整装标本：一种是将很小的动物或早期胚胎经固定、染色后，封固于载玻片上。另一种是将小动物、胚胎或病变器官经固定后，保存于固定液中瓶装供肉眼观察用。可了解胚体的表面立体形态特征及病变部位与周围组织的毗邻关系。,8活体标本：在组织细胞生活状态下进行观察的标本，或生活状态下进行活体染色后制成的标本。,9血管注射标本：,一种是将树脂类铸形剂经血管灌注后，用强酸或强碱腐蚀血管周围组织而制成的血管铸形标本，可瓶装供肉眼观察或进一步处理后作扫描电镜观察。另一种是将染料加明胶配制成染色液注入血管内，然后取材、固定、包埋、切片和封固所制成的组织切片标本。这类标本主要用于了解血管的走行及其与所支配组织或器官的相互关系。,组织切片的制作方法有：石蜡切片法、冰冻切片法、火棉胶切片法、超薄切片（电镜标本）、树脂切片、碳蜡切片等。石蜡切片法是最常用的方法，本节将较详细讲授其制作步骤。,二、组织切片的常规制作,（一）概述,组织切片制作方法的基本程序为：,取材,固定,脱水透明包埋,切片,染色,封固,。,（1）颈椎脱臼法 （2）断头法 （3）麻醉法（4）空气栓塞法：,（二）动物的致死与取材,1、动物致死法：,2、组织取材时应注意：,(1),所取材料越新鲜越好；,(2),切取组织的刀剪刃口必须锋利；,(3),取材时必须考虑切面的方向；,(4),组织块应力求小而薄；,(5),收缩较大的新鲜组织；,(6)注意清洁；,使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，防止组织自溶；使组织成份转变为不溶性物质从而有利于保存。这就是固定的基本意义。,（三）标本的固定,1固定的目的,(1),组织块,不宜太大,，一般以厚度为,2,毫米，长度不超过,0.5,厘米,*0.5,厘米。,(2),固定液的量一般以组织块大小的,30,倍,为宜，最好在固定组织的瓶底垫上脱脂棉或几层纱布以使固定液能从上下左右前后各方都能渗入组织块。,(3),固定的时间，一般以,24,小时,为宜。,2,固定的注意事项,(4)后固定：,柔软组织在新鲜时不易切成小块，往往采用重新固定法处理。,（5）特殊固定：神经组织以在活体动物灌流固定后再重新投入固定液为佳，有些组织如肺则采用由气管注射固定液后再投入固定液为好。,常用的固定液有：,（1）10%福尔马林液：商品甲醛（36%40%甲醛水溶液）配成固定液其浓度为3.6%4%，也就是习惯上称为10%的福尔马林液。,（2）10%中性缓冲福尔马林液：商品甲醛10ml，,0.1mol/L pH7.4 PBS 90ml。,3,固定剂,用以固定组织的药剂，称为固定液。,（,3,）,4%,多聚甲醛磷酸缓冲液（,pH7.4,）,（,4,）,Bouins,液：苦味酸饱和水溶液,75,份，甲醛,25,份，冰醋酸,5,份配制而成。,（,1,）灌注法（,Irrigation method,）自左心室插入主动脉，先以生理盐水冲冼血液后，注入固定液，,30min,后取材，置同一固定剂后固定。,（,2,）,浸入法（,Immersion method,）,。,4,固定方法,材料固定后，药剂继续留在组织中，易使组织破坏，必须用水或酒精洗去。,5,固定后处理,三种方式进行处理：,（3）直接入脱水剂。,（2）酒精充分洗涤,（Bouins液含苦味酸）；,（1）流水冲洗,（铬酸或铬酸盐固定的组织）；,1,、目的,：脱水与透明的目的在于为石蜡渗透至组织块内部以便进一步包埋做必要的准备。,脱水必须从低浓度开始，逐渐转入高浓度脱水剂。另外脱水必须进行得很彻底。,2,、常用脱水剂：,（,1,）酒精：,（,2,）丙酮：,（四）脱水与透明,3、常用的透明剂有二甲苯、甲苯、氯仿等。,二甲苯：透明组织的能力强，但易使组织收缩和变脆，故在二甲苯中不宜搁置太久。,氯仿：其透明能力远比二甲苯慢，透明时间可以延长至,24,小时也无妨。,1,目的：由于生物体的组织有各种硬度不同的成份，必须,加石蜡等作支持物质渗入组织块内部,，并将组织块包埋起来，然后用切片机以制作极薄的切片。,2,种类：包埋物质目前广泛采用的除,石蜡,外，还有火棉胶、炭蜡、明胶以及环氧树脂、OTC(冰冻切片包埋剂）等。,（五）包埋,商品石蜡,的处理：,浸蜡,：,包埋：通常使用包埋盒。,石蜡包埋法：,反复溶化以增加石蜡的硬度和密度。,温度不能超过该石蜡的溶点的2以上；12h,。,包埋通常使用,组织包埋机、包埋盒及配套使用的不锈钢模具,。把熔蜡倒入模具内，再用加热的弯曲钝头镊子夹取已经过浸蜡的组织块，使切面朝下平正地置放于模具底面的中央处，然后放上包埋盒，继续加满蜡，待包埋盒表面的,熔蜡凝固后，将其移入,加冰块的冷水中加速凝,固，包埋即告完成。,1,70%乙醇,常温,1224h,2,80%乙醇,常温,1224h,3,90%乙醇,常温,23h,4,95%乙醇,常温,12h,5,95%乙醇,常温,12h,6,100%乙醇,常温,1h,7,100%乙醇,常温,1h,8,二甲苯,常温,2030min,9,二甲苯,常温,2030min,10,石蜡,4850,0.5h,11,石蜡,4850,0.5h,12,石蜡,5860,0.5h,13,石蜡,5860,0.5h,组织块处理时间表,石蜡切片机可分三个部分，一是,安装切片刀的部分,，有调节刀片斜度和固着刀片的螺旋。一是,安装材料的部分,，也有螺旋可以调节材料的位置。另一是,操纵在旋转中向前推进的部分,，控制着切片的厚薄，是比较重要而复杂的部分。,（六）组织切片技术,1、切片机简介：,德国冰冻切片机,冰冻切片机,制冷系统,自动进样,/,切片系统,照明系统,2,、载玻片和盖玻片处理：新载玻片上有油污，必须经过清洁液浸泡、充分漂洗、酒精浸泡、烤干备用。,(1)明胶液：这是粘片最常用的胶液，简便优良。,(2)蛋白甘油：鸡蛋清 50ml，甘 油 50m1，水杨酸纳 1g。,（3）树脂胶：又称白色乳胶，使用浓度为1%2%，以蒸馏水稀释即可。,（4）多聚赖氨酸，APES（3-氨丙基-乙氧基甲硅烷）。,3,、载玻片上涂粘附剂：,4切片步骤：,（1）切片刀或一次性切片刀必须锋利。,（2）将切片刀安装在持刀座上（以15为宜）。,（3）将蜡块（包埋盒）固定于支持器上，调整蜡块和刀刃至适当位置。,（4）细心移动刀座或蜡块支持器，使蜡块与刀刃接触，旋紧刀座和蜡块支持器。,（5）修整蜡块（粗切）：匀速旋转切片轮，修切蜡块表面至包埋其中的组织块完整地全部切到。,（6）调节切片厚度调节器（一般为,46,m,），进行切片，切出的蜡片应连续成蜡带。蜡带应完整无缺，厚度适宜、均匀，无刀痕、颤痕、皱折、开裂、缺损、松解等。,（7）以专用小镊子轻轻夹到蜡片，放入伸展器的温水中（42左右），使切片全面展开。,（8）将蜡片附贴于包被有粘附剂的载玻片上，蜡片应置放在载玻片右（或左）2/3处的中央，蜡片与载玻片之间无气泡。,（9）放入温箱中，4045约1小时烘干即可。,（七）染色:,1、染料及染色液简介：,（1）,苏木精,（2）洋红,（3）苏丹,（4）,伊红,（5）碱性品（复）红,（6）结晶紫,（7）亚甲蓝或美蓝,（,8,）甲基绿,2,、,Ehrlich,苏木精的配制,苏木精 2克、铵明矾 3克、无水酒精100毫升、甘油 100毫升、蒸馏水100毫升。,此液配成后，须经,1,2,月，待它氧化成熟以后才能应用，故必须先配制。,3,、伊红液配制：,伊红,2,克、,90%,酒精,（或蒸馏水）200,毫升。,（,1,）取组织块，经固定后，常规石蜡包埋，切片，厚,4,6m,。,（,2,）切片常规二甲苯脱蜡，下行酒精至水,（,3,）明矾苏木精液染色,5,10min,，自来水洗去浮色。,（,4,）,1%,盐酸乙醇分化,20s,（提插数下）。,（,5,）自来水浸泡,1 h,。,4,、,HE,染色,（,6,）上行酒精脱水：,70,乙醇,5min80,乙醇,5min90,乙醇,5min,。,（,7,）置,1%,伊红液,2,5min,。,（,8,）,常规脱水，透明，封片,胞核，嗜碱性，染为紫蓝色,胞质，嗜酸性，染为红色,5,、关于,HE,染色时注意事项：,（1）用含升汞的固定液固定的组织块,在切片染色前，应进行,脱汞,。具体方法：切片脱蜡，逐次进入70%酒精后，入稀碘液（碘1g，碘化钾2g，蒸馏水3000ml）内510min。蒸馏水稍洗，入5%硫代硫酸钠溶液内5min。蒸馏水充分洗后进入染色。,（2）切片必须要充分,干燥,后才能进行染色；而染色过程中切忌让切片干燥。,（,3,）用伊红水溶液染切片时，往往在经脱水的低浓度酒精时极易脱色，特别是对于细胞密集的组织更易出现这种情况。而用,95%,酒精配制的,1%,伊红染液,则可获较满意效果。,（,4,）切片染苏木精后，分色(,1%盐酸乙醇,)这一步骤极为重要，应在显微镜下控制进行，一般以细胞核染色清晰，而细胞质等基本无色为佳。如果发现过染，可以延长分色时间，若染色太浅，则应重新染色后再行分色，总之必需分色至,核很清楚而背景无色,才能往下进行。,（,5,）,当切片从酒精移入二甲苯透明时，产生,白色云雾,，致使切片呈现模糊不透明状态，是由于脱水不彻底或用于脱水的各级酒精不纯所致。应将切片退回无水酒精重新脱水，如再不透明时，则应更换无水酒精。,（6）封固时，,盖玻片一定要大于切片,，如有漏出部分则不久将会褪色。,