第2章基因工程药物.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,重点：制备基因工程药物的基本过程,不能忘记的人,1953,年,4,月,25,日，英国,自然,杂志发表了沃森和克立克的文章,“,核酸的分子结构,DNA,的一个结构模型,”,。标志着,DNA,双螺旋结构的建立，从此，遗传学和生物学的历史从细胞阶段进入了分子阶段。,不能忘记的人,F Sanger W Gilbert,Sanger,（英国化学家）,最早测定胰岛素的氨基酸顺序,获得,1958,年诺贝尔化奖。,22,年后，他因测定了,一种噬菌体的一级结构,获,1980,年的诺贝尔化学奖。,Gilbert,在,DNA,测序,领域，因其卓越的工作获得,1980,年诺贝尔化学奖。,基因工程技术,定义：,狭义上又称,DNA,重组技术，将一种生物细胞基因分离出来，在体外进行酶切和连接并插入质粒、病毒等载体分子构成遗传物质的新组合，引入另一种宿主菌细胞后使目的基因得以复制和表达的技术。,基因工程技术,操作技术,1,、选择目的基因（生物体内获取、,PCR,）,2,、利用连接酶将外源,DNA,连接到载体上,3,、载体转入宿主细胞,4,、宿主细胞的鉴定筛选,5,、大规模培养,6,、分离纯化目的蛋白,基因工程技术,外源基因的筛选、合成技术,基因工程的核心内容是对不同来源的,DNA,进行重组。,1,、基因组文库：,物理或酶切法将染色体,DNA,降解，然后插入到载体内，再转入宿主细胞内，许多宿主细胞一起组成含有基因组各个,DNA,片段的集合体。,优点：信息全面。缺点：工作量大（尤其是基因组较大时）,基因组,DNA,文库,限制性内切酶,基因组,DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,鸟枪法（,shotgun,）,9,基因工程技术,2,、,cDNA,文库：真核细胞具有内含子和外显子。以,mRNA,为模板经过反转录酶合成与,mRNA,互补的,DNA,序列，再复制成双链,DNA,与载体连接转入受体细胞，构建,cDNA,文库。,优点：较基因组文库小，筛选目标相对简单。,cDNA,文库的组建,：,基因重组,反转录酶,mRNA,cDNA,逆转录法就是分离纯化目的基因的,mRNA,，再反转录成,cDNA,，然后进行,cDNA,克隆表达。,11,3,、,PCR,技术,PCR,技术：,1985,年由美国,Cetus,首创，可以将微量目的,DNA,片段扩增一百万倍以上。,优点：敏感度高、特异性强、产率高、重复性好以及快速简便能够，比较容易地对目的基因进行分析、鉴定。,获,1993,年诺贝尔化学奖。,PCR,的原理,：,用于扩增位于两段已知序列之间的,DNA,片段，类似于天然,DNA,的复制过程。以拟扩增的,DNA,分子为模板，以一对分别与模板,5,末端和,3,末端互补的寡核苷酸片段为引物，在,DNA,聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制沿着模板链延伸直至完成新的,DNA,合成，重复这一过程，即可使目的,DNA,片段得到扩增。,变性,：,加热使模板,DNA,双链间的氢键断裂而形成两条单链。,退火,(,复性,):,降温后模板,DNA,与引物按碱基配对原则互补结合，也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度，结构简单的特点，主要的结合发生在模板与引物之间。,55 30,3.,延伸：,将反应温度调节到,酶的最适温度,，在,DNA,聚合酶、,4,种,dNTPs,等存在的条件下，以引物的,3,端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新,DNA,链。,上述,3,步为一个循环，每经过一个循环，样本中的,DNA,量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过,25,40,个循环后,DNA,可扩增,10,6,10,9,倍。,PCR,的基本反应步骤,变性,95C,延伸,72,C,退火,Tm-5C,双链,DNA,分子,双链断开,循环,1,模板与引物结合,循环,1,Taq,Taq,循环,1,Taq,Taq,循环,1,循环,1,双链断开,循环,2,模板与引物结合,循环,2,Taq,Taq,Taq,Taq,循环,2,94,变性,双链断开,循环,3,循环,3,Taq,Taq,Taq,Taq,Taq,Taq,Taq,Taq,循环,3,循环,n,基因工程技术,4,、,DNA,的人工化学合成,目前常用的有磷酸二酯法、磷酸三酯法、固相亚磷酸三酯法。合成片段较小、价格昂贵。,基因工程技术,基因克隆酶学基础,1,、限制性内切酶,外切酶,：,从核酸的一端把核苷酸水解下来的酶,内切酶,：,从核酸链中间通过水解,3,-5,磷酸二酯键切断核酸链的酶。其中某些内切酶只能识别专一核酸序列并在识别位点或其周围切割双链,DNA,的一类内切酶，。,主要功能是限制外源,DNA,的存在,32,/35,E coli K,株,噬菌体,E coli K,株,其他 E coli 菌株,限制现象,微生物的噬菌体不能交叉感染，如,E coli,K,株的噬菌体只能感染,E coli,K,株，不能感染其他株，反之亦然。这种现象称为“限制现象”。,33,/35,限制性内切酶,能识别并切断外来,DNA,分子的某些部位，使外来,DNA,失去活性，限制外来噬菌体的繁殖。,34,/35,细菌能将外来的,DNA,片段在某些专一位点上切断，保证其不为外来噬菌体所感染，而自身的染色体,DNA,由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护。,此酶在,5GATC3,序列中的腺嘌呤,N6,位置上引入甲基，使一些识别顺序中含有,5GATC3,的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的,DNA,。,此酶在序列,5CCAGG3,或,5CCTGG3,中的胞嘧啶,C5,上引入甲基,.,（,1,）,dam,甲基化酶,（,2,）,dcm,甲基化酶,甲基化酶：在专一位点上甲基化，与限制性内切酶相对应,经修饰的,DNA,不再被限制酶降解。,35,/35,I,类 识别位点，并切开之，但识别位点并非严格专一，,ATP,依赖,II,类 识别位点严格专一，并在识别位点内将单链切断,III,类 识别位点严格专一，但切点不专一，往往不在识别位点内部，,ATP,依赖,基因工程中具有实用价值的是,II,类限制性内切酶,分类,基因工程技术,基因工程中的应用：识别位点不专一的用处不大，识别和切割专一位点，可用于分离构建来自不同基因组的,DNA,片段，是,DNA,重组技术中最常用的工具酶,37,/35,第,1,个字母取自产生该酶的细菌属名，大写；,第,2,，,3,二,个字母是该细菌的种名，小写；,第,4,个字母代表株；,用,大写,罗马数字表示发现的先后次序。,命名,H,in,d,属,种,株,序,H,aemophilus,in,fluenzae,d,株,从,流感嗜血杆菌,d,株,中分离到,的第,3,个限制酶,前三个字母用斜体表示。,以限制酶来源的微生物学名进行命名,属名,+,种名,+,株,/,型,+,发现序号,38,/35,5,-,GAATTC,-,3,3,-,CTTAAG,-5,EcoR,的识别序列,粘性末端,：,DNA,链被交错切开形成凸起末端，这种凸起末端的核苷酸序列互补，可形成氢键结合，故称为粘性末端,39,/35,5,NNNNNN,GTTAAC,NNNNN,3,3,NNNNNN,CAATTG,NNNNN,5,5,NNNNN,GTT,pAAC,NNNNN,3,3,NNNNN,CAAp,TTG,NNNNN,5,另一种是垂直切割形成平末端,40,/35,1970,年,Smith,等,流感嗜血杆菌株中分离出,Hin,dII,和,Hin,dIII,已分离,400,余种,II,类酶,商品化的约有一百种,实验室常用的二十种,核糖核酸（,RNA,）酶：,RNaseA,：,RNA,专一的内切酶，可特异的作用于嘧啶核苷酸，主要用于除去,DNA,制备物中的,RNA,。,RNaseH,：是一种核糖核酸内切酶，它能够特异性地水解杂交到,DNA,链上的,RNA,磷酸二酯键，,但该酶不能消化单链或双链,DNA,，也不会降解单链,RNA,。,DNA,连接酶：,既可以连接两个具有粘性末端的,DNA,片段，也可以连接两个具有平末端的,DNA,片段,DNA,聚合酶,：是细胞复制,DNA,的重要作用酶。,DNA,聚合酶,以,DNA,为复制模板，从将,DNA,由,5,端点开始复制到,3,端的酶。,脱氧核糖核酸酶：,是将单链或双链,DNA,同等程度地随机分解，生成具有,5-P,末端寡核苷酸的脱氧核糖核酸内切酶。在,Mg,2+,存在时，能在双链,DNA,上随机地产生切口；而在,Mn2+,存在下能将双链,DNA,同时切断，使,DNA,片段化。,44,基因载体：,是一类能自我复制的,DNA,分子，其中的一段,DNA,被切除而不影响其复制，可用以置换或插入外源,(,目的,)DNA,而将目的,DNA,带入宿主细胞。,基因工程载体,45,（,1,）在宿主细胞内能独立复制。,（,2,）有选择性标记，指示重组,DNA,分子是否进入到宿主细胞内。,（,3,）有一段多克隆位点以供外源,DNA,插入，外源,DNA,插入,其中不影响载体的复制。,二、基因工程对载体的要求,（,4,）分子量小，拷贝数多。,46,多克隆位点,ori,复制起始点,遗传标记,Amp,polylinker,基因载体,47,多种酶切口,多克隆位点,限制性内切酶,单一酶切口,多克隆位点,：供外源,DNA,插入的位点，这个位点称为克隆位点，一般为限制性内切酶位点。该酶切位点在整个载体上是唯一的。多克隆位点集中在一个很短的序列内,48,抗,Amp,宿主细菌,含,Amp,培养基,49,宿主细胞,ori,50,基因工程中常用的载体：,三、载体的种类,质粒（,plasmid,）,单链,DNA,噬菌体,动物病毒（,virus,）,51,基因工程中常用的载体：,三、载体的种类,质粒（,plasmid,）,单链,DNA,噬菌体,动物病毒（,virus,）,DNA,重组,外源基因与载体连接,粘性末端连接,：,同一限制性内切酶酶切，,DNA,连接酶催化。,平末端连接,：目的片段与载体没有共同的粘性末端限制性内切酶位点。不同酶酶切，用适当的酶补平或是消去末端。平末端内连接效率低,加尾连接,：,末端核苷酸转移酶催化，在,3,端加上,polyG,（,A,），设计出互补的核苷酸多聚物粘性末端,在另一条链上加,polyC,（,T,），,重组,DNA,导入受体菌,1.,转化：,细菌获得外源质粒,DNA,，产生新的遗传性状的过程。自然状态下外源,DNA,进入细胞的效率很低。一般采用热激法（感受态细胞）和电穿孔法,2.,感染（转导）：,以噬菌体为媒介，将外源,DNA,导入细菌的过程。,3.,转染,指感受态的受体细胞捕获和表达以噬菌体为载体的重组,DNA,分子的过程。,转导和转染的区别,转导：通过,噬菌体（病毒）颗粒感染宿主细胞的途径把外源,DNA,转移到受体细胞的过程。,转染：,噬菌体,DNA,分子直接导入受体细胞的过程,。,平板培养基培养细菌,10-100,L,转化液,涂于含抗菌素的平板,37,过夜,重组菌的筛选,1,、,根据重组菌的标志直接筛选（抗性）,2,、核酸杂交法（核酸探针）,3,、,PCR,法,4,、,DNA,限制内切酶法,5,、,核苷酸序列测定法,DNA重组,基因工程菌表达水平的优化,高效基因工程菌：具有高的产物表达水平、稳定的遗传特性和较强的目标产物积累能力。,1,、启动子的优化；,2,、密码子优化；,3,、表达系统优化（菌株选择）等,微生物培养技术,作业,基因工程操作技术的基本流程。,基因工程工具酶的种类及其特征,外源基因与载体的连接方式有哪些,微生物培养技术,以重组,DNA,技术为标志的现代生物技术极大的促进了生物制药技术的发展，微生物作为常用的宿主表达系统，广泛的应用于特殊药物的合成，构建基因工程菌是必要的上游步骤，外源基因编码的目标产物大大量积累必须在后续的微生物培养阶段实现，因此微生物的培养过程的优化与否关系到外源基因的表达效率。,高产菌株的选育与基因工程菌的构建,菌种选育常用的方法是,自然选育,和,诱变选育,基因工程菌的构建属于,定向选育,第一个获得商业化的基因工程菌时转入,胰岛素基因的大肠杆菌,血红蛋白也得到了应用,分批培养中细菌的群体生长,(131xing),分批培养,：,采用完全封闭的容器，一次接种，一次性加入培养基进行培养的方法，是实验室培养微生物最常用的方法。单批培养、批式培养或密闭培养。,生长曲线,：,分批培养细菌时，以时间为横坐标，以菌数对数为纵坐标的相关曲线。能反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线。包括延滞期、对数期、稳定期和衰亡期等四个生长时期。,1,、分批式操作,特点：体积不变；没有输入，也没有输出，非衡态过程发酵体系的组成（基质、产物及细胞浓度）都随发酵时间而变化。,2025/10/19 周日,62,将少量单细胞的纯培养，接种到一恒定容积的新鲜液体培养基中，在适宜条件下培养，每隔一定时间取样，测菌细胞数目。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数为纵坐标，绘制所得的曲线。,2025/10/19 周日,63,生长曲线可分：,延迟期,对数期,衰亡期,稳定期,延迟期：,延滞期、停滞期等,特点,合成代谢活跃，易产生诱导酶；,细胞形态变大或增长，生长速率是零；,细胞内,RNA,特别是,rRNA,含量增高，原生质嗜碱性增强；,对外界不良条件敏感,。,影响延迟期长短的因素：,菌种,：繁殖速度快，延迟期较短；,接种量,：一般来说，适当增大接种量可缩短甚至消除延迟期（发酵工业上一般采用,1/10,的接种量）；,培养基成分,：,在天然培养基上生长的延滞期比在合成培养基上的短；,接种后培养基成分有较大变化时，会使延滞期加长。,在发酵工业上需设法尽量缩短延迟期,对数期：,细胞数目以几何级数增加，其对数与时间呈直线关系。,特点,：,代谢最旺盛，营养消耗最快；,生长速率最大，即,代时,最短；,菌体大小、形态、生理特征等比较一致；,细胞对理化因素较敏感。,1,、,此时期的菌种比较健壮，是增殖噬菌体的最适菌龄；生产上用作接种的最佳菌龄,；,2,、是生理代谢及,遗传研究或进行染色、形态观察等,的良好材料,。,3,、发酵工业上尽量延长该期，以达到较高的菌体密度。,4,、食品工业上尽量使有害微生物不能进入此期。,2025/10/19 周日,68,稳定期,特点,1,、,细胞分裂速度下降，开始积累内含物。,2,、,新增殖的细胞数与老细胞的死亡数几乎相等,，,培养物中的细胞数目达到最高值。,4,、,此时期的微生物开始,合成次生代谢产物,，在稳定期的后期产物积累达到高峰，是最佳的收获时期,。,2025/10/19 周日,69,应用意义,：,1,、生产上应尽量延长此期，提高产量，可以补充营养物质（补料）、调,pH,、调整温度,;,2,、稳定期细胞数目及初级产物积累达到最高,是收获的最佳时期。,2025/10/19 周日,70,衰亡期,特点：,出现“负生长”。,细胞出现多形态、畸形或衰退形，芽孢开始释放。,菌体开始死亡、自溶。,注：衰亡期比其他各时期时间长，它的长短也与菌种和环境条件有关。,2025/10/19 周日,71,初级代谢产物,：,是指微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质，如氨基酸、核苷酸、多糖、脂类、维生素等。,形成往往与微生物细胞的形成过程同步，稳定期是这些产物的最佳时机。,次级代谢产物,：,生长到一定阶段后通过次级代谢合成的分子结构十分复杂、对该生物无明显生理功能，或并非是该生物生长和繁殖所必需的小分子物质，如抗生素、毒素、激素、色素等。一般来讲在分批培养中，它们的形成高峰往往在稳定期的后期或衰亡期。,补料分批培养,概念,：装入大部分培养液，一次性接种，在培养过程中连续不断补充新培养基，但不取出培养液。,是目前微生物药物和基因工程药物生产最常用的方法,开始,流加,结束,半连续式操作,概念,：培养液一起装入发酵罐，一次性接种。间歇取出部分发酵培养物（带放），同时补充同等数量的新培养基；然后继续培养，直至发酵结束。,连续式操作,概念：,培养液装入发酵罐，培养过程中，不断补充新培养基,同时取出包括培养液和菌体在内的发酵液，直至发酵结束,。,恒化器,：流入速度,=,流出速度,=F,反应器内,(V),全混流溶质浓度相等,微生物培养过程中的优化控制,微生物合成药物的生产水平取决于生产菌的,遗传特性,（内在条件）和,参数控制,（外在条件）。,当限制性底物的补料速率等于菌体对对限制性底物的消耗速率时，菌体稳定生产。,动物细胞培养技术,对具有特殊要用活性的蛋白，如生长激素、单克隆抗体以及病用疫苗，通过传统的生物化学技术进行提取已经无法满足，同时微生物在转录修饰方面存在缺陷，因此大量培养动物细胞可得到批量生产药物的目的,动物细胞培养历史,德国植物学家,Schleiden,和动物学家,Schwann,创立细胞学说,1885,年,Roux,用生理盐水成功培养鸡胚组织,1906,年,BeeBe,和,Ewing,培养狗淋巴细胞，存活,72h,1907,年,Harrison,成功培养了离体的蛙胚神经组织，并观察到神经细胞突起的生长过程，开创现代细 胞培养的新纪元。,1923,年,Carrel,发明卡士瓶培养法，培养鸡胚心肌组织,34,年,1950s,，,Earle,首创单细胞克隆培养法，设计了,Earle,培养基；,Gay,建立宫颈癌,Hela,细胞系；,Dulbecco,单层细胞培养技术,1962,年,Capstick,大规模悬浮培养小鼠肾细胞,1975,年，,Kohler,与,Milstein,培养出杂交瘤细胞，可以分泌单克隆抗体,动物细胞制药发展历史,1949,年，,Enders,用动物细胞生产灭活脊髓灰质炎病毒疫苗,1980s,，基因工程技术和细胞融合技术迅速发展，动物细胞开始作为宿主细胞生产多肽与蛋白。,1986,年，淋巴母细胞,Namalwa,生产干扰素批准用于临床；,Vero,细胞生产狂犬病疫苗和脊髓灰质炎疫苗。,1987,年，杂交瘤细胞生产的,OKT3,单克隆抗体,1988,年后，大批动物细胞生产重组基因药物批准上市：,EPO,，组织纤维酶原激活剂、凝血因子,等。,目前动物细胞制备药品有：,疫苗；单克隆抗体；激素；细胞因子；生长因子；酶类,基因工程技术,定义：,狭义上又称,DNA,重组技术，将一种生物细胞基因分离出来，在体外进行酶切和连接并插入质粒、病毒等载体分子构成遗传物质的新组合，引入另一种宿主菌细胞后使目的基因得以复制和表达的技术。,基因工程技术,定义：,狭义上又称,DNA,重组技术，将一种生物细胞基因分离出来，在体外进行酶切和连接并插入质粒、病毒等载体分子构成遗传物质的新组合，引入另一种宿主菌细胞后使目的基因得以复制和表达的技术。,基因工程技术,定义：,狭义上又称,DNA,重组技术，将一种生物细胞基因分离出来，在体外进行酶切和连接并插入质粒、病毒等载体分子构成遗传物质的新组合，引入另一种宿主菌细胞后使目的基因得以复制和表达的技术。,基因工程技术,定义：,狭义上又称,DNA,重组技术，将一种生物细胞基因分离出来，在体外进行酶切和连接并插入质粒、病毒等载体分子构成遗传物质的新组合，引入另一种宿主菌细胞后使目的基因得以复制和表达的技术。,基因工程技术,定义：,狭义上又称,DNA,重组技术，将一种生物细胞基因分离出来，在体外进行酶切和连接并插入质粒、病毒等载体分子构成遗传物质的新组合，引入另一种宿主菌细胞后使目的基因得以复制和表达的技术。,基因工程技术,定义：,狭义上又称,DNA,重组技术，将一种生物细胞基因分离出来，在体外进行酶切和连接并插入质粒、病毒等载体分子构成遗传物质的新组合，引入另一种宿主菌细胞后使目的基因得以复制和表达的技术。,基因工程技术,定义：,狭义上又称,DNA,重组技术，将一种生物细胞基因分离出来，在体外进行酶切和连接并插入质粒、病毒等载体分子构成遗传物质的新组合，引入另一种宿主菌细胞后使目的基因得以复制和表达的技术。,基因工程技术,定义：,狭义上又称,DNA,重组技术，将一种生物细胞基因分离出来，在体外进行酶切和连接并插入质粒、病毒等载体分子构成遗传物质的新组合，引入另一种宿主菌细胞后使目的基因得以复制和表达的技术。,基因工程技术,定义：,狭义上又称,DNA,重组技术，将一种生物细胞基因分离出来，在体外进行酶切和连接并插入质粒、病毒等载体分子构成遗传物质的新组合，引入另一种宿主菌细胞后使目的基因得以复制和表达的技术。,基因工程技术,定义：,狭义上又称,DNA,重组技术，将一种生物细胞基因分离出来，在体外进行酶切和连接并插入质粒、病毒等载体分子构成遗传物质的新组合，引入另一种宿主菌细胞后使目的基因得以复制和表达的技术。,基因工程技术,定义：,狭义上又称,DNA,重组技术，将一种生物细胞基因分离出来，在体外进行酶切和连接并插入质粒、病毒等载体分子构成遗传物质的新组合，引入另一种宿主菌细胞后使目的基因得以复制和表达的技术。,基因工程技术,定义：,狭义上又称,DNA,重组技术，将一种生物细胞基因分离出来，在体外进行酶切和连接并插入质粒、病毒等载体分子构成遗传物质的新组合，引入另一种宿主菌细胞后使目的基因得以复制和表达的技术。,基因工程技术,定义：,狭义上又称,DNA,重组技术，将一种生物细胞基因分离出来，在体外进行酶切和连接并插入质粒、病毒等载体分子构成遗传物质的新组合，引入另一种宿主菌细胞后使目的基因得以复制和表达的技术。,基因工程技术,定义：,狭义上又称,DNA,重组技术，将一种生物细胞基因分离出来，在体外进行酶切和连接并插入质粒、病毒等载体分子构成遗传物质的新组合，引入另一种宿主菌细胞后使目的基因得以复制和表达的技术。,