第三章-基因工程载体2.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第一节 基因工程载体的 一般特性及种类,可转移至受体细胞,具有自我复制的能力，并可以带动其下游外源序列一起复制,具有合适的筛选标记,含有多克隆位点(Multiple Cloning Site,MCS),安全，对受体细胞无害,在细胞内稳定性高,相对分子量要尽量小，拷贝数适当,1.,基因工程载体的一般特性,2.,基因工程载体的种类,按工作方式：,质粒载体、噬菌体载体、粘粒载体、人工染色体载体,按功能：,克隆型载体、表达型载体（表达载体又分胞内表达和分泌表达载体，或按受体细胞不同分为原核细胞和真核细胞表达载体）,按应用对象：,原核生物载体、真核生物载体、穿梭载体,1.质粒载体,是以细菌质粒(plasmid)的各种元件为基础组建而成的基因工程载体。,主要用途：,外源基因的转移、贮存、表达及基因文库的构建,1.5,构建质粒克隆载体的基本原则,（,1,）选用合适的出发质粒（亲本质粒）,出发质粒应含有质粒克隆载体的必备元件，这些元件也可以从多种出发质粒获得。,（,2,）正确获得构建质粒克隆载体的元件。,一般采用限制性核酸内切酶切割出发质粒,DNA,分子获得某种元件的,DNA,片段，选用的切割位点既要保证元件完整，又要使,DNA,片段最小。也可用,PCR,技术扩增所需元件的特异,DNA,片段。,1.5,构建质粒克隆载体的基本原则,（,3,）组装合适的选择性标记基因,根据转化的受体细胞的特性选择组装什么样的选择性标记基因。,（,4,）选用合适的启动子,构建表达质粒克隆载体，必须组装合适的启动子。真核基因在原核生物中表达时常用原核生物或病毒（噬菌体）的启动子。最好选用外界条件诱导的启动子，以便有效地控制目的基因的表达。,（,5,）能达到目的的前提下，构建过程力求简单。,lac,Z,vs lac,Z 或,lac,Z,-半乳糖苷酶基因产物不具酶活性，装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：链（,lac,Z N端146个氨基酸）和链。前者负责四聚体装配，后者具-半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为-互补作用。这两个部分可独立存在，分别由两个基因编码。,-互补法筛选重组子,载体质粒上带有-半乳糖苷酶基因(,lacZ,)的启动子序列和-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏,lacZ,的阅读框架,不影响其正常功能。宿主菌株带有-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。,在各自独立的情况下,载体和宿主编码的-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在质粒导入这类宿主菌体后可形成具有酶活性的蛋白质。,-互补法筛选重组子,当外源片段插入到质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变,表达蛋白失活,产生的氨基酸片段失去-互补能力,含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。,而没有插入外源片段的质粒转化子产生-互补，在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。,噬菌粒,phagemid,pUC118,和,pUC119,分别来自,pUC18,和,pUC19,。它们带有,M13,噬菌体,DNA,合成的起始与终止及,DNA,包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。,接受外源DNA区段后，可以像质粒一样以常规方式进行增殖。当带上这些质粒的细胞被适当的丝状噬菌体感染时，可合成质粒DNA的其中1条链，并包装进入子代噬菌体颗粒，从菌体内放出。,1.7质粒表达载体,典型的大肠杆菌表达载体,详见第六章,1.,噬菌体,载体,2.,单链丝状噬菌体载体,2.,噬菌体载体,2.1,噬菌体,载体,野生型,噬菌体,DNA,图谱,左臂：从,A,到,J,长约,20kb,其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。,中段：长约,20kb,，是,DNA,整合和切出，溶原生长所需的序列。,右臂,:,长约,10kb,是调控区,控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及,DNA,复制起始均在这区域内。,噬菌体,DNA,末端为长,12,个核苷酸的互补单链称为粘端,(cohesive end,，,cos),。,左右臂包含DNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；,对溶菌生长来说，中段是非必需的。,Since phage can accommodate only about 5%more than its normal complement of DNA,vector derivatives are constructed with deletions to increase the space within the genome.,插入型载体,本身可以包装形成噬菌斑，可插入外源DNA片段较小,取代型载体,本身不能包装形成噬菌斑，可插入外源DNA片段较大,大肠杆菌丝状噬菌体包括M13噬菌体、f噬菌体等，其基因组均是单链闭环DNA分子，其中M13mp系列克隆载体是对野生型M13加以改造，插入了多克隆位点和LacZ基因后的载体，同样可以利用IPTG和X-gal作蓝白筛选。,M13 噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的,RF DNA,。RF DNA 很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。,载体的插入位点,在 M13 噬菌体基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源 DNA（基因/和基因/之间）。,基因 和基因 之间的 508bp 间隔区是主要的外源片段插入位点。在基因 和基因 主要用作噬菌体展示。基因 也可用来克隆外源片段。,3.,粘粒(Cosmid)载体,如果将噬菌体左右臂和中段都去除，仅留下DNA两端不少于280bp并含有cos位点以及与包装相关的核苷酸序列，再加上质粒的复制序列、标志基因（氨苄青霉素抗性基因）、多克隆位点等，就可构成,cos质粒,或称为,粘质粒,的载体。,cosmid结合了质粒克隆载体和噬菌体载体的优点。,能像,l,-DNA,那样进行体外包装，并高效转染受体细胞,能像质粒那样在受体细胞中自主复制,重组操作简便，筛选容易,装载量大（,35-45kb,）且克隆片段具有一定的大小范围,不能体内包装，不裂解受体细胞,主要用于基因组文库的构建，适于做真核细胞大片段的克隆。,粘粒,(Cosmid),载体的特点,第三节 酵母基因克隆载体,广泛存在于酿酒酵母中，位于酵母细胞核内，拷贝数为50100个(也说20,80个),只携带与复制和重组有关的4个蛋白质基因（REP1，REP2，REP3，REP4），不赋予宿主细胞任何表型，属于隐蔽性质粒。它最显著的特征是质粒上有两个600bp的反向重复序列（IR）,在两个IR上各有一个专一性重组位点（FRT），由于这两个FRT间的相互重组，产生两种互变异构型的混合质粒，即A和B型,1.2m,质粒：,穿梭载体,所谓的穿梭载体是指一类人工构建的，具有两种不同复制起点和选择标记，可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的载体。,以大肠杆菌细胞为寄主进行基因操作具有技术成熟、方便实用等很多优点，而在其它的原核生物或真核生物细胞中进行直接的基因操作总是有很多麻烦的问题有待解决。所以，构建能够穿梭于大肠杆菌与其它生物细胞之间的载体就能解决这些难题了。,第四节 真核生物基因克隆的载体 和人工染色体,1.植物基因克隆的载体,目前的载体系统有病毒的载体系统和质粒的载体系统两大类。,（,1,）病毒载体系统：植物病毒作为植物遗传转化的载体系统是由植物病毒的侵染特性所决定的。以病毒作载体的表达系统为瞬时表达系统，其一般不能把外源基因整合到植物细胞基因组中。植物病毒的感染率很高，在较短时间内可获得较大的表达量。但因以病毒为载体的表达系统每个宿主材料都要接种病毒载体，故瞬时表达系统不易起始。,作为病毒载体的病毒最好是双链,DNA,植物病毒。,(2),农杆菌质粒载体系统：质粒载体系统中最常用的质粒有：,Ti,质粒和,Ri,质粒。农杆菌质粒是一种能实现,DNA,转移和整合的天然系统。,Ti质粒作为载体的优点：,Ti质粒的T-DNA能够自发地整合到植物染色体DNA上，诱导植物形成肿瘤。,Ti质粒能够转化裸子植物和双子叶被子植物。后来实验又证明，重要的禾谷类植物玉米，也能被T1质粒转化，这为Ti质粒发展成为单子叶植物克隆载体带来了希望。,Ti质粒中的T-DNA能整合到宿主ch-DNA上成为正常的遗传成分，世代相传。,T-DNA上的冠瘿碱(opine)合成酶基因具有一个强启动子，能启动外源基因在植物细胞中高效表达。,Ti质粒作为载体的缺点：,Ti质粒相对分子质量太大(约200kb)，限制酶位点多，不易进行体外重组DNA操作。,被T-DNA转化的植物细胞成为肿瘤细胞，不能进行分化，再生成植株。,对Ti质粒的改造：,保留T-DNA的转移功能；,取消T-DNA的致瘤性，使之进入植物细胞后不至于干扰细胞的正常生长和分化，转化体可再生植株；,通过简便的手段可使外源DNA插入T-DNA之中，并随着T-DNA整合到植物染色体上。,2.,动物细胞克隆载体,目前使用的动物细胞克隆载体主要有哺乳动物病毒载体和昆虫病毒载体。,(1)哺乳动物病毒载体,哺乳动物病毒作为载体的优点：,动物病毒能够识别宿主细胞,某些动物病毒载体能高效整合到宿主基因组中,高拷贝、强启动子，有利于真核外源基因的克隆与表达,SV40,，腺病毒、牛痘病毒、逆转录病毒等改造后的衍生物作为基因载体。,(2)昆虫病毒载体,昆虫中的杆状病毒的衍生物作为载体的优点：,为高克隆容量，克隆外源DNA片段大小可高达100kb；,具有高表达效率，外源DNA的表达量达到细胞蛋白质总量的25左右，甚至更多；,具有安全性，仅感染无脊椎动物，并不引起人和乳动物疾病。,3.,人工染色体,人基因组十分庞大，约含,310,9,bp,，建立和筛选人的基因组文库，要求有容量更大的载体，酵母人工染色体（,yeast artificial chromosome,YAC,）载体应运而生。,YAC,含有酵母染色体端粒（,telesome,）、着丝点,(centromere),及复制起点等功能序列，可插入长度达,1000-3000kb,的外源,DNA,，导入酵母细胞可以随细胞分裂周期复制繁殖供作克隆，成为人基因组研究计划的重要工具。,人工染色体,实际上是一种,“,穿梭,”,载体，含有质粒克隆载体所必备的第一受体（大肠杆菌）源质粒复制位点,(ori),，还含有第二受体,(,如酵母菌,),染色体,DNA,着丝点,(centromere),、端粒（,telesome,）及复制起点等功能序列，另外还含有合适的选择标记基因。,在第一受体细胞内按质粒复制形式进行高拷贝复制；在体外与目的基因重组后，转化第二受体细胞，然后按染色体,DNA,复制的形式进行复制和传递。,人工染色体的应用：,构建基因组文库：覆盖率高,基因治疗,基因功能鉴定,