10 食品中有害微生物快速检测技术食品安全检测技术 教学课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十章 食品中有害微生物,快速检测技术,主要内容,相关食品微生物国家标准,食品微生物常规检验内容与步骤,菌落总数检验,大肠菌群检验,病原菌检验,定量,PCR,检测技术,ELISA,快速检测技术,芯片快速检测技术,引言,国内外食品安全形势严峻，恶性事件不断发生。,欧洲“二噁英”、“疯牛病”（,20,世纪,90,年代）,日本大肠杆菌,O157:H7,中毒（,1996,）,中国,SARS,（,2003,）、东南亚国家禽流感（,2004,）,美国菠菜大肠杆菌,O157:H7,污染事件（,2006,）,食品中的微生物,来自土壤,自然界中微生物的分布极为广泛，水中、高山、海底、荒漠、极地、空气等到处都生存着各种各样、形形色色的微生物。,土壤是微生物的天然培养基，它具备微生物正常发育所必须的一切条件：土壤中含有一定的无机物和有机物；土壤中含有适当的水分；大多数中性偏碱,适合大多数微生物生长；土壤中还含有气体，主要是,CO,2,、,O,2,和,N,2,；温度变化不大（,10-25,）。,土壤中含有大量的微生物，土壤中的细菌来自天然生活在土壤中的自养菌和腐物寄生菌以及随动物排泄物及其尸体进入土壤的细菌。,土壤中微生物的分布：表层受日光照射和干燥的影响，不利于其生存，所以细菌数量少，离地面,10-20,厘米土层微生物最多,.,土层越深，菌数越少。,食品中的微生物,来自水源,水也是微生物存在的天然环境，水中的细菌来自土壤、尘埃、污水、人畜排泄物及垃圾等。水中微生物种类及数量因水源不同而异。,受到污染的水中含有大量的有机物，适合微生物的生存。静水中的微生物多，流水中的少；离岸近处微生物多，离岸远处少；经过大城市的河流，水受到污染，含有大量的粪便,.,并含有大量的致病菌。,井水和泉水中细菌少，雨水、雪水中也少，城市上空的雨水细菌多，乡村上空雨水细菌少。,国家规定，自来水中，细菌总数每毫升不得超过,100,个，大肠菌群不得超过,3,个,/,升,.,食品中的微生物,来自空气,在冬春季节，更容易发生感冒等传染病，就是因为空气的传播，特别是在公共场所，人多，空气流通差，细菌多；,大城市上空微生物数量最多，乡村少；森林、草地和田野上空空气清洁，海洋、高山、冰雪覆盖的地面上空，微生物更为稀少。雨后空气特别新鲜。,食品中的微生物,来自人体,人自出生后，外界的微生物就逐渐进入人体。在正常人体皮肤、粘膜及外界相通的各种控道（如口腔、鼻咽腔、肠道和泌尿道）等部位，存在着对人体无害的微生物群，包括细菌、真菌、螺旋体、支原体等。,皮肤：表皮葡萄球菌、类白喉杆菌、绿脓杆菌、耻垢杆菌等,口腔：球菌（甲型或乙型）、乳酸杆菌、螺旋体、梭形杆菌、白色念球菌、（真菌）表皮葡萄球菌、肺炎球菌、奈瑟氏球菌、类白喉杆菌等,胃：正常一般无菌,肠道：类杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌、厌氧性链球菌、粪链球菌、葡萄球菌、白色念球菌、乳酸杆菌、变形杆菌、破伤风杆菌、气荚膜杆菌等,鼻咽腔：甲型链球菌、奈氏球菌、肺炎球菌、流感杆菌、乙型链球菌、葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、变形杆菌等,眼结膜：皮表葡萄球菌、结膜干燥杆菌、类白喉杆菌等,微生物引起食品腐败变质,食品中含有蛋白质，脂肪，碳水化合物，这些成份是微生物的生长基质，所以微生物在食品中能够生长繁殖。食品腐败变质的原因有物理学、化学、生物化学和微生物学方面的原因，但最普遍、最主要的因素是微生物。,环境中无处不存在微生物，食物在生产、加工、运输、储存、销售过程中，很容易被微生物污染。只要温度适宜，微生物就会生长繁殖，分解食物中的营养素，以满足自身需要。这时食物中的蛋白质就被破坏了，食物会发出臭味和酸味，失去了原有的坚韧性和弹性，颜色也会发生变化从而造成食品变质。,新鲜果蔬和果汁的腐败变质,开始引起新鲜水果变质的微生物是酵母菌和霉菌。引起蔬菜变质的主要是酵母菌、霉菌和少数细菌。起初霉菌在果蔬表皮，或其污染物上生长，然后霉菌侵入果蔬组织，首先分解细胞壁中的纤维素，进一步分解其中的果胶、蛋白质、有机酸、淀粉、糖类等，使其变成简单物质。在外观上出现深色斑点，组织变松、变软、凹陷，渐成液浆状，并出现酸味、芳香味或酒味等。,果汁中主要发生乳酸菌以果汁中糖分、柠檬酸、苹果酸等有机酸为发酵基质的乳酸发酵和最常见的酵母菌引起的酒精发酵。在浓缩果汁中，一般性细菌难以忍受高浓度的糖分。果汁常见的霉菌是青霉，其次是曲霉。果汁变质后会呈现浑浊、产生酒精和有机酸变化，结果原有风味被破坏或产生一些不愉快的异味。,乳及乳制品的腐败变质,乳及乳制品的营养成分比较完全，都含有丰富的蛋白质、极易吸收的钙和完全的维生素等。因此极易为微生物所腐败变质。,鲜乳中污染微生物主要来源于乳房内的污染微生物和环境中的微生物。主要有乳酸细菌、胨化细菌、脂肪分解细菌、酪酸细菌、产气细菌、产碱细菌、以及酵母和霉菌。它们在鲜乳中的生长有一定的顺序性，可以分为抑制期、乳酸链球菌期、乳酸杆菌期、真菌期和胨化细菌期，,pH,值也是先下降再逐步回升。,含水量合格的奶粉不适宜微生物生长。但原料奶污染严重，加工又不当的奶粉中可能污染有沙门氏菌（,Salmonella,）和金黄色葡萄球菌（,Staphylococcus,aureus,）等病原菌。这些病原菌可能产生毒素而易引起中毒。微生物引起淡炼乳变质，一是产生凝乳，即使炼乳凝固成块。由于作用的微生物不同，凝乳又可为甜性凝乳和酸凝乳；二是产气乳，即使炼乳产气，使罐膨胀爆裂；三是由一些分解酪蛋白的芽孢杆菌作用，使炼乳产生苦味。,微生物引起甜炼乳变质也有三种结果：一是由于微生物分解甜炼乳中蔗糖产生大量气体而发生胀罐；二是许多微生物产生的凝乳酶使炼乳变稠；三是霉菌污染时会形成各种颜色的钮扣状干酪样凝块，使甜炼乳呈现金属味和干酪味等。,肉、鱼、蛋类的腐败变质,禽畜肉类的微生物污染，一是在宰杀过程中各个环节上的污染，二是病畜、病禽肉类所带有的各种病原菌，如沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、结核杆菌、布鲁氏菌（,Brucella,）等。腐生性微生物污染肉类后，在高温高湿条件下很快使肉类腐败变质。肉类腐败变质，先是由于乳酸菌、酵母菌和其他一些革兰氏阴性细菌在肉类表面上的生长，形成菌苔而发粘。然后分解蛋白质产生的,H,2,S,与血红蛋白形成硫化氢血红蛋白而变成暗绿色，也由于各种微生物生长而产生不同色素，霉菌生长形成各种霉斑。同时可产生各种异味，如哈喇味、酸味、泥土味和恶臭味等。,鱼类极易为水生微生物所引起腐败变质。假单胞菌、无色杆菌（,Achromobacter,）、黄杆菌（,Flavobacterium,）、产碱杆菌（,Alcaligenes,）、气单胞菌（,Aeromonas,）等，是新鲜鱼类的主要腐败菌。新鲜鱼类变质后组织疏松，无光泽，由于组织分解产生的吲哚、硫醇、氨、硫化氢、粪臭素等，而常有难闻恶臭。腌鱼由于嗜盐细菌的生长而有橙色出现。,鲜蛋也由于卵巢内污染、产蛋时污染和蛋壳污染而发生微生物性腐败变质。污染鲜蛋的微生物有禽病病原菌、其他腐生性细菌和霉菌等。它们使鲜蛋成为散黄蛋，并进一步分解产生硫化氢、氨、粪臭素等，蛋液成灰绿色，恶臭或粘附于蛋壳、蛋膜上。,罐藏食品的腐败变质,罐藏食品也会发生腐败变质，其原因在于杀菌不彻底，罐内仍残留有一定量的微生物，或者罐头密封不良而漏罐，外界进入微生物。,由于灭菌不彻底而残留的微生物，一般以嗜热性芽孢杆菌为主。它们所引起的罐头腐败变质有三种：一是罐头外观正常，但内部,pH,值可下降,0.10.3,，称为平酸变质；二是,TA,（,thermo-anaerobes,）嗜热性厌氧菌腐败，产气、产酸并可使罐头胀裂；三是产生硫化物腐败食品。如罐头中未杀灭的是厌氧性梭状芽孢杆菌，则可能会进行丁酸发酵，并产生氢气和,CO,2,，不产芽孢细菌的污染主要是由于罐头漏罐所引的，它们使罐头内食品发生浑浊、沉淀风味改变和产气胀罐。,对于发生腐败变质的罐头食品，必须根据腐败变质的现象作微生物学分析，如是否产气胀罐，是否浑浊沉淀，是否变酸或,pH,上升等等，以便作出正确判断，避免腐败变质的进一步发生。,一、相关食品质量标准,表,2,微生物指标,表,2,罐装植物蛋白质饮料微生物指标。,项 目,指 标,菌落总数（个,/,mL,）,100,大肠菌群（个,/100mL,）,3,致病菌（系指肠道致病菌及致病性球菌）,不得检出,霉菌、酵母（个,/,mL,）,20,植物蛋白饮料卫生标准,【GB 16322-1996】,3.3,微生物指标 微生物指标罐装植物蛋白质饮料应符合商业无菌，其他包装应符合表,2,的规定。,常见微生物检测项目,常规微生物项目：细菌总数、大肠菌群、大肠杆菌、酵母总数、霉菌总数,致病微生物项目：沙门氏菌、李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌,O157,：,H7,、,弯曲杆菌、致病弧菌、副溶血弧菌、志贺氏菌、假单胞菌等,二、食品微生物常规检验内容与步骤,样品,感官观察,菌落总数,大肠菌群,病原菌检验,三、菌落总数检验,检样稀释及培养,（,1,）以无菌操作，将检样,25g,（或,25mL,）剪碎以后，放于含有,225mL,灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预先置适当数量的玻璃珠）或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨做成,1,：,10,的均匀稀释液。,固体检样在加入稀释液后，最好置灭菌均质器中以,8000r/min-100000r/min,的速度处理,1min,，做成,1,：,10,的均匀稀释液。,（,2,）用,1mL,灭菌吸管吸取,1,：,10,稀释液,1mL,，沿管壁徐徐注入含有,9mL,灭菌生理盐水或其他稀释的试管内（注意吸管尖端不要触及管内稀释液，下同），振摇试管混合均匀，做成,1,：,100,的稀释液。,（,3,）另取,1mL,的灭菌吸管，按上项操作顺序作,10,倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用,1,支,1mL,灭菌吸管。,（,4,）根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择,2-3,个适宜稀释度，分别在作,10,倍递增稀释的同时，即以吸取该稀释度的吸管移,1mL,稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度作两个平皿。,（,5,）稀释液移入平皿后，应及时将凉至,46,营养琼脂培养基,可放置在（,461,）,）水浴锅内保温,注入平皿,15mL-20mL,，并转动平皿使混合均匀，同时将营养琼脂培养基倾入加有,1mL,稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。,（,6,）等琼脂凝固后，翻转平板，置（,361,）,恒温箱内培养（,482,）,h,取出，计算平板内菌落数目乘以倍数，即得,1g,（,1mL,）样品所含菌落总数。,样品稀释程序,菌落计算方法,（,1,）菌落计数方法,做平板菌落计数时，可用肉眼观查，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落数后，求出同稀释度的各平板平均菌落总数。,（,2,）菌落计数的报告,平板菌落数的选择,选取菌落数在,30,300,之间的平板作为菌落总数测定标准。一个稀释度使用两个平板，应采用两个平板平均数，其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数，若片状菌落不到平板的一半，而其余的一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘,2,以代表全皿菌落数。平皿内如有链状菌落生长时（菌落之间无明显界线），若仅有一条链，可视为一个菌落数；如果有不同来源的几条链，则应将每条链作为一个菌落计。,稀释度的选择,应选择平均菌落数在,30,300,之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之。若有两上稀释度，其生长的菌落数均在,30,300,之间，则视两者之比如何来决定。若其比值小于或等于,2,，应报告其平均数；若大于,2,则报告其中较小的数字。,若所有稀释度平均菌落数均大于,300,，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。,若所有稀释度的平均菌落数均小于,30,，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。,若所有稀释度均无菌落生长，则以小于,1,乘以最低稀释倍数报告之。,若所有稀释度的平均菌落数均不在,30-300,之间，其中一部分大于,300,或小于,30,时，则以最接近,30,或,300,的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。,菌落数的报告,菌落数在,100,以内时，按其实有数报告，大于,100,时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，以四舍五入方法计算。为了缩短数字后面的零数，也可用,10,的指数来表示。,其他检验方法,1,.,涂布平板法,2,.,点滴平板法,与涂布平板法相似。不同的是点滴平板法只是用标定好的微量吸管或注射器针头按滴,(,使每滴相当于,0,025m1),将检样稀释液滴加于琼脂平板上固定的区域,(,预先在乎板背面用标记笔划成四个区域,),。,四、大肠菌群检验,1.,大肠菌群概念,大肠菌群系指一群在,37,度能发酵乳糖、产酸、产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性的无芽胞杆菌。,从种类上讲，大肠菌举包括许多生化及血清学特性均很不相同的细菌，其中有埃希氏菌属，枸椽酸菌属、肠杆菌属和克雷伯氏菌属等等以埃希氏菌属为主，大肠菌群,MPN,是指在,100mL(,或,100g),食品检样中听含的大肠菌群的最近似或最可能数。,2.,大肠菌群指示作用,作为（判断食品是否被肠道致病菌所污染及污染程度的）指示菌的条件：,和肠道致病菌的来源相同，并且在相同的来源中普遍存在和数量甚多，以易于检出。,在外界环境中的生存时间与肠道致病菌相当或稍长。,检验方法比较简便。,大肠菌群在数量和检验方面均符合指示菌的三项要求，,3.,大肠菌群数量的表示方法,1,）大肠菌群,MPN,大肠菌群,MPN,是采用一定的方法，应用统计学的原理所测定和计算出的一种最近似数值；,2,）大肠菌群值。,大肠菌群值是指在食品中检出一个大肠菌群细菌时所需要的最少样品量。,故大肠菌群值越大，表示食品中所含的大肠菌群细菌的数量越少，食品的卫生质量也就越好：在这两种表示方法中，目前国内外普遍采用大肠菌群,MPN,，而大肠菌群值逐渐趋于不用。,4.,大肠菌群检验方法,（,1,）检样稀释,1,）以无菌操作将检样,25mL(,或,25g),放于含有,225mL,灭菌生理盐水或其它稀释液的灭菌玻璃瓶内,(,瓶内预置适当数量的玻璃珠,),或灭菌乳钵内，经充分振摇或研磨作成,1,：,10,的均匀稀释液。固体检样最好用匀质器。以,8000-10000,转分钟的速度处理,1,分钟，做成,1,：,10,的均匀稀释液。,2,）用,1mL,灭菌吸管吸取,1,：,10,稀释液,1mL,，注入含有,9mL,灭菌生理盐水或其它稀释液的试管内，振摇试管混匀，作,1,：,10,的稀释液。,3,）另取,1mL,灭菌吸管，按上项操作依次作,10,倍递增稀释液，每递增稀释一次，换用,1,支,1mL,灭菌吸管：,4,）根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接 种,3,管。,（,2,）乳糖发酵试验,将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在,1mL,以上者，用双料乳糖胆盐发酵管；,1mL,及,1mL,以下者，用单料乳糖胆盐发酵管，每一稀释度接种,3,管，置,36+1,温箱内，培养,24+2,小时，如所有乳糖胆盐发酵管均不产气，则可报告为大肠菌群阴性。如有产气者，按下列程序进行。,（,3,）分离培养,将产气的发酵管分别转种到伊红美兰琼脂平板上，置,361,温箱内培养,18-24,小时，然后取出，观察菌落形态，并作革兰氏染色和证实试验。,（,4,）证实试验,在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落,1-2,个进行革兰氏染色。同时接种乳糖发酵 管，置,361,温箱内培养,24+2,小时，观察产气情况，凡乳糖发酵管产气、革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌，即可报告为大肠菌群阳性。,（,5,）报告,根据证实为大肠群阳性的管数，查,MPN,的检索表，报告每,100mL,（,g,）大肠菌群的最近似数,(MPN),。,5.,其他方法,疏水网膜法,TTC,（,2,、,3,、,5-,氯化三苯四氮唑）显色法,DC(,去氧胆酸钠,),半固体法,纸片法。,五、病原菌检验,食品生产是一个时间长、环节多的复杂过程。总之，与食品有直接和间接关系的致病性微生物都可能污染食品。（以乳制品为例）,1,、能引起人类疾病和食物中毒的致病性微生物。,沙门氏菌、葡萄球菌、链球菌、副溶血性弧菌，口蹄疫病毒等。,2,、能产生毒素并引起食物中毒的微生物。,肉毒梭菌、葡萄球菌和产气荚膜杆菌，也包括一些真菌，都会产生毒素。,致病菌快速检测方法,显色培养基法：,技术成熟，产品很多。,分子生物学方法：,以基因探针检测法和,PCR,法为主。,免疫学方法：,产品最多，特异性和敏感性都很高，但有假阳性存在，阳性结果需要确认。通常的原理有,EIA(,酶联免疫,),，,ELISA(,酶标记免疫吸附测定法,/,酶联免疫吸附测,),，,GLISA,，荧光酶免疫、免疫磁分离等方法。市场上的产品多，如,BioMeriux,Tecra,Neogen,Biocontrol,Matrix,等。,基因芯片：,研究热点。,致病微生物快速检测产品,免疫磁分离法,Matrix,公司的,Pathatrix,致病菌快速检测系统,ELISA,方法,澳洲,TECRA,公司的免疫捕获快速检测,分子生物学方法,【,基因探针,(,基因芯片,),及,PCR,方法,】,GLISA-,胶体金免疫层析致病菌快速检测条,荧光酶免,Vidas,系列产品,(,略,),显色培养基,法国,AES,公司,分子生物学方法,基因探针法及,PCR,方法在国外已经有相当成熟的表现。,有普通,PCR,，,荧光,PCR,，,实时荧光,PCR,（,定量,PCR,）,等多种方法。,基因探针法一般也需要增菌，然后加探针试剂杂交，然后在荧光显微镜荧光检测器下获得结果。,PCR,方法一般不需增菌太长时间，通过,PCR,方法对待测微生物的特征片断进行扩增，然后通过凝胶电泳或荧光,PCR,技术判断结果。,食品中致病菌传统检测方法是先采用非选择性和选择性增菌,然后进行分离培养、生化反应和血清学鉴定,检验程序十分繁琐；且肠杆菌科细菌间生化反应多有交叉,一般需4d,-,7d才能完成,因此传统检测方法在快速、敏感与特异性等方面都有自身局限性。随着分子生物学及分子细菌学发展,荧光定量PCR技术应用为致病菌检测提供一种新的手段,。,例：,副,溶血弧菌,副溶血弧菌是我国沿海地区弧菌性腹泻和食物中毒的主要致病菌。是食品卫生中水产品、食品微生物检测的主要监测对象。目前食品中副溶血弧菌检测,方法主,要,以国,家标准及行业标准为依据,这些方法的检验周期长,受主观影响较多,不能满足食品卫生快速反应体系的需求。近年来,PCR技术被广泛应用于本领域。,传统,PCR,技术仍有不足之处：,一,是不能准确定量,二是容易产生交叉污染,三是分析的都是终极产物,实时荧光定量,PCR,实时荧光定量PCR,（,realtime fluorogenic quantitative,polymerase Chain Reaction，,RQPCR,）,是在定性PCR 技术基础之上发展起来的核酸定量技术，即在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析一种方法。该技术不仅实现对DNA 模板定量，且还具有灵敏度高、特异性和可靠性强、自动化程度高、污染性小、及实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于食品各个领域。,1,、,细菌培养,从食品原料中取样,，分,别划线到增菌平板上增菌。取分,离提,纯后的菌种，用生理盐水制备成菌悬液备用。,2,、,DNA的提取,取一定量菌悬液离心去上清后,加入DNA提取液混匀。沸水浴10min后，离心，留上清液待测。,3,、,定量PCR扩增,扩增反应总体积：模板DNA,+,、,下游引物,(,pmol,)+,荧光探针,(,pmol,)+,PCR缓冲液,+,4 X dNTPs,+,Taq DNA聚合酶,+,纯水。,在荧光定量PCR仪上设定扩增条件为：9,4,，,2 min预变性,;,9,4,30 S变性；55,1min退火及延伸,40个循环,4保存。,4,、测出样品的,C(t),值,分子生物学方法应用前景,试剂盒开发相对比较容易。只要找出特征的基因片断，合成出引物即可。,目前客户比较关注的致病菌，包括沙门氏、李斯特氏、大肠杆菌,O157,、,副溶血弧菌、霍乱弧菌、志贺氏菌等均有,PCR,试剂盒供应。,常见的基因探针方法或仪器,BAX,Gene-,trak,Gen-probe,Vermicon,分子生物学方法病原菌检测系统的优缺点,分子生物学方法检测致病菌，特异性较强，技术较为前沿，特别是相对国标方面来说。,但国外用户反映其假阳性概率仍然较高，因此只能作为一种初筛方法。,速度方面：仍然需要增菌，一般是第二天出结果，与免疫法比没有速度优势,目前不少产品已经通过,AOAC,的认证。,定义：,将抗原,-,抗体反应与标记技术相结合，用,放射性同位素、酶或荧光素,标记的已知抗体或抗原，通过检测标记物，间接测定未知的抗原或抗体。,分类：,放射免疫测定法：,131,I,，,32,P,免疫荧光技术：,FITC,，,PE,免疫酶测定法：,HRP,，,AP,免疫标记技术,免疫酶测定法,(,E,nzyme,I,mmuno,A,ssay,EIA,),用酶标记的抗原或抗体进行的抗原抗体反应。,辣根过氧化物酶,(HRP),，碱性磷酸酶,(AP),特点：,高度特异性：保持抗原抗体反应的特异性,高灵敏度：酶催化底物显色的高效性，,pg,水平微量检测,定性定量检测：反应液颜色深浅或光密度值,分类：,酶联免疫吸附试验：可溶性抗原或抗体,酶免疫组化法：组织中或细胞表面的抗原。,酶联免疫吸附试验,(Enzyme-Linked,ImmunoSorbent,Assay,ELISA,),用酶标记抗原或抗体检测液体（血液、细胞液）中未知抗体或抗原的方法。,1.,定义,2.,分类,间接法（,Indirect ELISA,）：,将已知抗原吸附于固相载体，酶标记二抗,检测液相中未知抗体,双抗体夹心法（,Sandwich ELISA),：,将已知抗体吸附于固相载体，酶标记一抗,检测液相中的可溶性抗原,竞争法（,Competitive ELISA),：,将已知抗体或抗原吸附于固相载体，酶标记抗原或抗体,检测液相中的可溶性抗原或抗体,ELISA,简介,1971,年瑞典学者,Engvall,和,Perlmann,，荷兰学者,Van,Weeman,和,Schuurs,分别报道将免疫技术发展为检测体液中微量物质的固相免疫测定方法，称为酶联免疫吸附实验（,ELISA,）,ELISA,原理,使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性,使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性，又保留酶的活性,结合在固相载体上的酶量与捡样中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关,ELISA,原理图,ELISA,基本的实验过程,包被：将已知抗原或抗体通过物理吸附到固相载体表面，使抗原或抗体固相化,抗原抗体反应：先后加入被检标本和酶结合物，使之与固相抗原或抗体发生免疫反应而被结合固定,酶促反应：在反应体系中加入酶作用的底物，使发生酶促反应而显色,ELISA,基本的实验过程,（以间接性,ELISA,为例）,：,显色,实验步骤,（示意图）,实验步骤,将包被孔编号，分别加入阳性对照、阴性对照及待测样品各,100,L,，,37,温育,30min,各孔分别加入洗涤液,2,滴，摇匀，弃去，用蒸馏水或自来水加满各孔甩掉，反复,5,次，然后在吸水纸上吸干（倒扣在吸水纸上）,在各孔内加入酶结合物,2,滴，,37,温育,15min,重复步骤,2,各孔内加入底物,1,滴，随即加入显色剂,1,滴，轻轻摇动混匀，室温避光反应,2-5min,，观察结果,结果判定,若待检孔显色浅于或等于阴性对照判定为阴性,若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判定为阳性,若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照孔之间则判定为弱阳性,ELISA,ELISA,用于单核细胞增生性李斯特菌检验,ELISA,分析基本步骤,将抗原（,Ag,）或抗体,Ab,结合到固相载体平板的孔里；,待测溶液的特殊抗原或抗体结合到敏化载体表面；,加入酶标抗体使之与抗原或抗体化合物相结合；,结合物通过标记酶催化底物的颜色改变而被检测；,通过最后溶液的颜色深浅对待侧抗原或抗体进行定量分析。,小结,ELISA,分析法的优点,特异性高，获得结果快，仪器简单，易于操作，对人员要求不高。免却了对样品进行核酸提取的麻烦，同时可降低检测的成本，由于酶既有很高的催化效率，可极大的放大反应效果，从而使测定达到很高的灵敏度和稳定性。,注意事项,加样应加在板孔的底部，避免产生气泡并迅速完成,洗涤必须彻底，防止产生假阳性,温浴的时间要严格控制,GLISA,胶体金免疫层析检测条,氯金酸,(HAuCl4),在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。,胶体金检测条在临床诊断中广泛使用。方法成熟，使用简便。,关键是制备单克隆抗体，然后与胶体金交联，在亲水纸层析条上固定。,胶体金微生物检测条在国内已经有不少产品，但用户并不多，主要是质量不稳定。,外来的胶体金微生物检测产品比较多。,常见的胶体金检测条举例,大肠杆菌,O157,李斯特氏菌,沙门氏菌,胶体金检测条的优缺点,胶体金检测方法属于免疫检测法，检测的是死菌和活菌。,一般需要增菌过夜。,增菌后的检测非常简单，约,10,分钟一般能完成。,无需专门的检测仪器。,进口的检测条的价格比较高，通常要,30,90,元。,食品中有害微生物的蛋白质芯片快速检测技术,生,物,芯,片,基因芯片,蛋白质芯片,微流控芯片,蛋白质芯片,又称,蛋白质阵列,或,蛋白质微阵列,，是指以蛋白质分子作为配基,将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列；用标记了荧光的蛋白质或其他它分子与之作用，洗去未结合的成分，经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度，来分析蛋白之间或蛋白与其它分子之间的相互作用关系。,Protein microarrays,2005,7.,蛋白质芯片的制备,固相载体及其处理,载体（滴定板、滤膜、凝胶、载玻片）,蛋白质的预处理,选择具有较高纯度和完好生物活性的蛋白进行溶解,点制微阵列,可使用点制基因微阵列的商品化点样仪或喷墨法等,固定微阵列上的蛋白样点,膜为载体：芯片放入湿盒，,37C 1h,载玻片为载体：化学修饰产生醛 基固定蛋白,微阵列的封闭,主要封闭试剂：,BSA,或,Gly,一、载体的选择及抗体或抗原的固化,一、载体的选择及抗体或抗原的固化,二,、捕获分子,二,、捕获分子,二,、捕获分子,二,、捕获分子,二,、捕获分子,二,、捕获分子,二,、捕获分子,三、微阵列设计与制备,四、抗原或抗体的标记,四、抗原或抗体的标记,四、抗原或抗体的标记,蛋白质芯片检测的种类,蛋白质芯片的检测方法根据蛋白质分子是否标记而分为两大类,一类是无分子标记的直接检测法,它是利用质谱、表面等离子体共振等不同技术直接分析芯片上靶蛋白的分子量和相对含量,如表面增强激光解吸离子化技术,(surface enhanced laser desorption/,ionization,SELDI,),、表面等离子体共振,(surface plasmon,resonance,SPR,),等,;,另一类是有分子标记的间接检测法,主要的标记方法有同位素标记法、荧光标记法和酶标法等,其中因为荧光标记的敏感、快速、无毒、对分子结构的非破坏性和相对经济等特点而使其成为芯片类型中最为广泛应用的检测技术。,五、蛋白质芯片检测方法,蛋白质芯片检测,探针标记检测法,无探针标记检测法,表面增强激光解吸离子化技术,(Surface enhanced laser desorption/ionization,SELDI),表面等离子体共振检测技术,（,surface,plasmon,resonance,SPR,）,原子力显微镜检测技术,（,atomic force microscope,AFM,）,同位素标记检测,荧光标记检测,化学发光检测,酶免疫标记检测,胶体金标记检测,蛋白芯片的检测,蛋白芯片的检测设备,蛋白芯片反应结果的检测要依据标记的报告分子种类来选择不同的检测设备。,荧光标记是芯片信息采集中使用最多也是最成功的报告标志。杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以进行分析，将荧光信号转换成数据，即可以获得有关生物信息。,蛋白芯片的应用,主要应用：,食品中真菌毒素的检测,食品中抗生素残留的检测,食品中农药残留的检测,食品中病原微生物的检测,蛋白质芯片技术应用于微生物学的研究,微生物是地球上出现最早、分布最广、种类最多的生物群体,蕴藏的可供人类开发利用的直接和潜在的生物资源十分丰富。微生物学是生物学中占有重要地位并发展进步较快的学科。,蛋白质芯片技术应用于微生物学的研究,不仅有利于诸如微生物次生代谢产物、微生物酶等微生物资源产品的开发,而且有利于更加详细地了解微生物的特殊代谢途径,揭示新的代谢调控机理及生理生化功能反应等生命过程的本质。,在微生物领域,蛋白质芯片的应用目前主要表现在两个方面,利用已知蛋白质分子的性质,通过蛋白质与其他生物活性分子的相互作用,实现对不同微生物的检测,其中应用最广的是抗体蛋白质芯片,;,开展微生物蛋白质组学研究,揭示蛋白质作用新的机理,开发未知蛋白质资源。,蛋白质芯片技术应用于微生物学的研究,用于微生物的检测,抗体蛋白质芯片在微生物检测方面的应用,因为抗体的高特异性、选择性和结合力,而使得抗体蛋白质芯片在微生物检测方面获得广泛的应用。抗体蛋白质芯片可用于对菌体抗原的直接检测。,抗原蛋白质芯片在微生物检测方面的应用,在芯片表面上直接固定抗原检测抗体引起了很多研究者的兴趣。,蛋白质芯片技术应用于微生物学的研究,存在的问题,成本过高,需一系列昂贵的尖端仪器,芯片的标准化问题,提高芯片的特异性、简化样品制备和标记操作程序、增加信号检测的灵敏度和消除芯片背景对于结果分析的影响等等,展望,蛋白质芯片未来的发展重点,建立快速、廉价、高通量的蛋白质表达和纯化方法，高通量制备抗体并定义每种抗体的亲和特异性。,改进基质材料的表面处理技术以减少蛋白质的非特异性结合。,提高芯片制作的点阵速度；提供合适的温度和湿度以保持芯片表面蛋白质的稳定性及生物活性。,研究通用的高灵敏度、高分辨率检测方法，实现成像与数据分析一体化。,DNA,芯片技术,将大量的探针分子固定于支持物上，然后与标记的样本分子进行杂交，通过检测标记样本与探针的杂交信号强度获取样本分子的数量和序列信息。,只有最适合，没有最好,!,谢谢！,