中药化学1.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,中药化学的应用：,一、扩大药源（促进新药开发与利用）,二、探索原理（中药治病原理，是在中医辩证施治下进行）,三、控制质量,四、改变剂型,五、中药现代化,麻黄,入肺、膀胱经,-松油醇 发汗散寒,麻黄碱和去甲麻黄碱,平喘,解痉作用,伪麻黄碱,利水,升压、利尿,肺,膀胱,在中药产业化的作用：,1、建立和完善质量评价标准,提示：道地药材有效部位的指纹图谱,2、改进剂型，提高疗效(注射双黄连),3、开发新药，扩大药源,小檗碱（黄连素):三棵针、古山龙、黄柏;,秋水仙生物碱:山慈菇、嘉兰,进样量：供试品及参照物各10UL,测试方法：,取待测溶液适量，注入液相色谱仪，按选定测试条件，测定色谱图，并进行实验方法学考察,流动相选择：经实验比较，水溶液与乙腈溶液梯度洗脱，能较好地使样品中各色谱峰分离且出峰最多，分析时间80min,样品2h图,谱显示,80min后无特征峰出现。,A 为水溶液，B为乙腈溶液 060min A%098%B%2100 060min A%00%B%100100,方法学考察：,1）稳定性实验：取同一批次供试品，在室温下放置，每隔一定时间进样后，测定用“中药指纹图谱相似度计算软件“计算，结果相,似度均大于0.91，表明供试品在测定的36h内保持稳定性。,2）精密度试验：取同一批次供试品，连续进样5次，考察进样精密度，用“中药指纹图谱相似度计算软件“计算结果相似度均大于,0.96，表明供试品进样精密度良好。,3）重现性试验：同一批次样品，按上法分别制备5份供试品测定，用“中药指纹图谱相似度计算软件“计算，结果相似度均大于,0.92，表明本法测定的重现性良好。,供试品测定：同一上述试验条件下，测定10批次供试品HLPC图谱。,指纹图谱：,根据10批次供试品测定结果所给出的峰数，峰值，（积分值）和峰位（相对保留时间）等相关参数，进行分析，比较，测定优化,的指纹图谱如下图,分析与评价,何首乌高效液相色谱可分离出约30多个色谱峰经与参照物对照以及比较所有测定和,记录折色谱图，选取其中9个共有峰作为指纹图谱的特征峰，其保留时间与峰面积如下,色谱峰序号：1 2 3 4 5 6 7 8 9,保留时间 4.787 22.169 22.773 33.08 36.434 45.936 47.579 48.482 64.964,峰面积 11.2 109.4 219.4 14.4 269.6 27.6 153.3 167.7 21.7,共有指纹峰标定，根据10批次供试品测定结果，标定共有指纹峰，何首乌HLPC指纹,图谱中，共有指纹峰9个，与大黄素参照峰5号峰相比，其他8个共有指纹峰相对保留时,间0.131、0.608、0.680、0.908、1.261、1.306、1.331、1.783。共有指纹峰面积,比，除大黄素参照峰以外，3.7.8号峰共有指纹峰面积（峰）超过总峰面积的10，规,定3号峰相对峰面积为0.3120.579，7号峰相对峰面积为0.3980.740，8号号峰相对,峰面积为0.4350.809,根据10批次供试品测定结果所给出的峰，峰值（积分值）和峰位（相对保留,时间）等相关参数，进行分析，比较，制定优化的指纹图谱如下,分析与评价,制何首乌HLPC可分离出约20个色谱，经比较所有测定和记录的色谱，选取其,中5个共有峰作为作为指纹图谱的特征峰。保留时间（min)、峰面积如下：,色谱峰序号：1、2、3、4、5,保留时间 30.831、36.41、41.148、53.678、73.958,峰面积 909.380、73.944、4125.628、1480.003、50.354,共有指纹峰标定，根据10批次供试品测定结果，标定共有指纹峰制首乌HLPC,指纹图谱中，共有指纹峰5个，与大黄素参照物峰（2号峰）相比，其他4个,共有指纹峰,相对保留时间依次为：0.853，1.138，1.485，2.041共有指纹峰,面积比，除参照峰以外，1、3、4号峰共有指纹峰面积（峰）超过总峰面积,的10，规定1号峰相对峰面积比为0.5791.109，3号峰相对峰面积比为,0.7971.497，4号峰相对峰面积比1.0401.9305,中药化学成分的溶解性：,三大类:水、亲水性溶剂、亲脂性溶剂,第二章 中药化学成分的一般研究方法,中药化学成分类型,生物碱,糖类,苷类,醌类,苯丙素类,黄酮类,萜类、,挥发油,甾体类,三萜类,鞣质,分类,糖类,：由单糖、低聚糖、多糖和苷组成。,单 糖,：不能再水解的糖，是糖的基本单位。,低聚糖,：是由29个单糖脱水缩合而成的化合物。,多 糖,：是由10个以上单糖缩合而成的高聚物。,苷类,：为一类经水解后可产生糖和非糖两部分的化合物非糖部,分叫苷元。苷具亲水性，苷元具亲脂性。,醌类,：是一类分子中具有醌式结构的化合物分子中多具有酚羟,基，有一定的酸性游离醌类多溶于乙醇、乙醚、苯、氯,仿等有机溶剂，微溶或难溶于水。,结合成苷后，极性增大，易溶于甲醇、乙醇中，在热水,中也可溶解。,苯丙素：是一类以苯丙基为基本骨架单位(C,6,-C,3,)构成的化合物,香豆素和木脂素为其典型化合物。,香豆素：其基本骨架可视为由邻羟基桂皮酸形成的内酯，在稀,碱溶液中内酯环可水解开环，生成能溶于水的顺邻羟,桂皮酸的盐，加酸后可环合成为原来的内酯。,黄酮类：泛指具有两个苯环通过中间三碳链相互联结而成的一,类化学成分。多具有酚羟基，显酸性。,萜 类：凡由甲戊二羟酸衍生、且其基本母核的分子式符合,(C,5,H,8,)n通式的衍生物为萜类化合物。,挥发油：又称精油，是一类可随水蒸气蒸馏、与水不相混溶的,油状液体物质。为无色或淡黄色的透明油状液体，具,芳香味，常温下能挥发，有较强的折光性和旋光性；,生物碱：为一类存在于生物体内分子中含有N的有机化合物,甾体类：是一类结构中具有环戊烷骈多氢菲甾核的化合物。,三萜类:是一类基本骨架由30个C原子组成的萜类化合物,鞣 质：又称单宁或鞣酸，为一类分子较大、结构复杂的多元酚,类化合物的总称。可与Pr结合成难溶于水的鞣酸蛋白。,为亲水性物质。其水溶液遇重金属盐如醋酸铅、醋,酸铜等能产生沉淀，还能与Pr,、多种ALK盐类形成沉淀,酸性成分,黄酮、蒽醌、香豆素、有机酸、鞣质,中性成分,强心苷、皂苷（甾体）,碱性成分,生物碱,两性成分,两性生物碱（含COOH、OH 等）,极性分类,脂溶性成分：苷元、生物碱,水溶性成分：苷、生物碱盐,按溶解性分类,生物合成途径,生物合成,一次代谢产物,叶绿素、糖、蛋白质、脂类、核酸,二次代谢产物,生物碱、黄酮、萜等,醋酸-丙二酸,途径：AA MA,乙酰辅酶,莽草酸,葡萄糖代谢,甲戊二羟酸,途径：MVA,桂皮酸,途径,氨基酸,途径,饱和,脂肪酸,酚类,蒽醌,萘醌,甲戊二羟酸,焦磷酸二甲烯丙酯,萜类 甾体,苯丙氨酸,（酪氨酸）,生物碱,香豆素 黄酮,木脂素,绿色植物含有叶绿素，光合作用将,乙酸-丙二酸途径(acetate-malonate pathway，AA-MA途径),(Cn+2，n为偶数),脂肪酸、酚类、醌类,生物合成假说,人类愿望：希望对同样类型的天然化合物分别归属并进行分类,且结构相似的多数情况下意味着生物在合成上可能,为同一起源。,假说：,1、ALK与AA生源关系,2：萜（异戊二烯定则后发现萜不符合这种定则，1953年修改，,在1956年提出了C,5,的甲戊二羟酸（MVA）上综述中比较二次,代谢与一次代谢，从其复杂结构上找出其共性,甲戊二羟酸途径(mevalonic acid pathway，MVA途径),单萜,倍半萜类,二萜类,甲戊二羟酸 MVA,三萜类 甾体,类胡萝卜素,反式角鲨烯,萜类、甾类,3、莽草酸途径(shikimic acid pathway),此途径由莽草酸通过苯丙氨酸，生成桂皮酸，再由桂皮酸生,成各种苯丙素类化合物。现也被称为桂皮酸途径,4、氨基酸途径(amino acid pathway),大多数ALK类成分由此途径生成。有些AA，如鸟(赖、苯丙、,酪及色)氨酸等，经脱羧成为胺类,再经过一系列化学反应,(甲基化、氧化、还原、重排等)生成各种ALK,5、,复合途径,许多二级代谢产物由上述生物合成的复合途径生成。即分子,中各个部分由不同的生物合成途径产生。如查耳酮类、二氢,黄酮类化合物的A环和B环分别由乙酸-丙二酸途径和莽草酸途,径生成。一些萜类生物碱分别来自甲戊二羟酸途径及莽草酸,途径或乙酸-丙二酸途径。,思考题：,1、何谓有效成分？植物中有效成分的含量高低与哪些因素有关,2、有效成分与无效成分之间的界定是什么？举例说明？,3、植物细胞内容物中含有哪些化学成分？,4、有效成分的结构和疗效之间的关系如何？试举例说明之。,5、什么是树脂、树胶、果胶、粘液质、粘胶质？它们有何共,性及个性？,一、概述,1、提取：采用适当的方法和适当的溶剂将有效成分从药材中尽,可能的提取出来的一种过程,2、步骤：提取 分离 鉴定检识,3、准备：查找文献，选择适当的溶剂与适当的方法,二、提取法,：,常用的提取法有溶剂提取法，水蒸汽蒸馏法等,1、溶剂提取法,1）选择溶剂的理论根据：相似相溶原则。,物质之间存在着吸引力称为范德华力，与分子间距有关，它,是由分子间的定向作用力，诱导作用力和分散作用力组成。,2)、对溶剂的要求,、溶解度,、不能发生化学反应,、沸点易适中，便于回收，反复使用,、安全无毒经济易得,水：,优缺点：价廉，易得，安全的强极性溶剂，对细胞穿透力强等,范围：生物碱盐、苷类、有机酸盐、糖、冷水：发生酶解反,应，杂质多、热水：效率高，挥发性成分损失，热敏性,成分易破坏,亲水性有机溶剂,：MeOH、EtOH、Me,2,CO等,优缺点：有较大的介电常数，与水混溶，对细胞穿透力强，溶,解性好有些具有毒性，易回收,范围：,3）常用溶剂：,溶剂提取法,常用溶剂极性,极性大,极性小,水,甲醇、乙醇,正丁醇,乙酸乙酯,氯仿,乙醚,苯,不溶于水,丙酮,二氯甲烷,四氯化碳,石油醚,亲脂性有机溶剂,：CHCl,3,、Et,2,O、Ben、Et,2,OAc,优缺点：不能与水混溶，对细胞穿透力弱，易燃，有毒，价贵，,设备要求高,范围,常用溶剂主要物理性质,溶剂 比重 沸点 溶解度（g),甲醇 0.792 64.6 混溶,乙醇 0.789 78.4 混溶,正丙醇 0.804 97.8 混溶,正丁醇 0.810 117.7 9,正戊醇 0.814 137.8 2.19,丙酮 0.792 56.3 混溶,乙酸乙酯 0.902 77.1 8.6,乙醚 0.713 34.6 7.5,石油醚,氯仿 1.484 61.2 1,四氯化碳 1.592 76.7 0.08,苯 0.879 80.1 0.08,甲苯 0.867 110.6 0.04,4）极性大小比较：,、,取代基相同时，羟基数越多极性则越大,、羟基数相同时，取代基质量越大则极性越小,、化合物分子母核大小（碳数多少）：分子大、碳数多，极,性小；分子小、碳数少，极性大。,、取代基极性大小：在化合物母核相同或相近情况下，化合,物极性大小主要取决于取代基极性大小。,常见基团极性；,酸酚醇胺醛酮酯醚烯烷,举例：判断下列各组化合物极性大小。,5）影响提取的因素,1、粉碎度：由于提取包括散、渗透、溶解等过程，因此中药粉,末的S,表,越大，这些过程就越快，提取效率就越高，,但太过细，药粉S,表,太大，吸附作用增强，,反而影响扩散速度。故要求在20目,2、温度：冷提杂质少，热提效率高，故增加温度，分子运动加,快，扩散、渗透、溶解速度好加快，但不能过高（有,些成分易破坏，杂质含量也增多）60100,宜。,3、时间：有效成分随提取时间的延长而提出量加大，直到药材,细胞内外有效成分达到平衡，但不必无限延长提取，,故水加热以煮沸051h,乙醇加热是1h.,2、提取具体方法：,冷提法,：,浸渍法,渗漉法,热提法,：煎煮法,回流提取法,连续回流提取法（索氏提取法）,浸渍法,方法：用适当的溶剂在常温下或温热60-80,浸渍出其中的成分,范围：用于遇热易破坏及含多量淀粉、树胶、果胶、粘液等提,缺点：提取率差，用水作溶剂易发霉，变质，故加防腐剂甲苯,渗漉法;,2、原理：形成一定的浓度差,3、操作步骤：,向中药粗粉中不断添加浸出溶剂使其渗过药,粉，从其下端流出的一种方法（溶剂渗进药粉,溶出成分比重加大，而向下移动，上层溶液或,稀浸液更换其位置，造成良好的浓度差，使其,更好的扩散。,4、缺点：溶剂消耗量大，费时，操作麻烦,5、优点：提取率高、浸出液较澄清（渗漉液体积相当于药材重,量的10倍时，则基本提取完全）、收集液能回收利用,6、注意事项：应控制好滴速每分钟在60滴,1、装置,煎煮法：,1、装置如图,2、容器：用陶器，沙器、,忌用铁器或铜器,3、原理：利用加热增加其有效成分溶解度,4、范围：对热稳定较好成分宜用（挥发性，成分易破坏不宜用、,多糖类成分也不用因煎煮后药液比较粘稠，过滤困难）,5、优缺点：操作简便，不宜用于有机溶剂,6、注意事项：直火加热时应常搅拌，以免局部受热过高而焦糊,连续提取法,1、装置（略）（脂肪提取器或索氏提取器）,2、操作方法：,a、溶剂装入圆底烧瓶内,b、药材装入制作的滤纸筒内，再放入提取器,内主要是防止在虹过程中药材阻塞虹吸管，,同时也会影响提取液的纯度）,3、优缺点：,适用具有挥发性有机溶剂提取有效成分剂量小，提取较完,全，对遇热不稳定不宜用，时间长，一般操作一次在4小时,影响提取的因素,1、粉碎度：由于提取包括散、渗透、溶解等过程，因此中药粉,末的表面积越大，这些过程就越快，提取效率就越,高，但太过细，药粉表面积太大，吸附作用增强，,反而影响扩散速度。故要求在20目,2、温度：冷提杂质少，热提效率高，故增加温度，分子运动加,快，扩散、渗透、溶解速度好加快，但不能过高（有,些成分易破坏，杂质含量也增多）60100,宜。,3、时间：有效成分随提取时间的延长而提出量加大，直到药材,细胞内外有效成分达到平衡，但不必无限延长提取，,故水加热以煮沸0.51h,乙醇加热是1h.,CO,2,超临界流体提取法,特点：,超临界流体密度液体,超临界流体粘度气体,优点：,1、萃取能力强，大大提高效率,2、温度低，热敏性、易氧化分,解的物质不易破坏,3、时间短，24h可完成,4、提取物无溶剂残留物,5、提取物质量稳定，标准易,控制,水蒸气蒸馏：只适用具有挥发性的，能随水蒸气蒸馏而不,被破坏，与水不发生反应，且难溶或不溶于水,的成分提取。此类成分沸点多在100,以上，,且在100,左右有一定的蒸汽压,其它方法：,升华法 组织破碎提取法,压榨法 超声提取法,第二章第二节：分离、精制、鉴定方法及技术,系统,溶剂法,层析法,分馏法,结晶法,透析法,盐析法,沉淀法,两相,溶剂萃,取法,方法,分离：将,提取液浓缩后,进一步除杂处,理的过程,分离原理,1、据物质溶解度差异进行分离：结晶法、重结晶法、沉淀法,2、据物质在两相溶剂分配比不同进行分离：,萃取法、反流分布法（CCD）、液滴逆流色谱法(DCCC)、,高速逆流色谱法（HSCCC）、气液分配色谱法（GC或GLC）,及液液分配色谱法（LC或LLC）,3、据物质吸附性差异进行分离：,物理性吸附（表面吸附）、化学吸附、半化学吸附,4、据物质分子大小差别进行分离：,透析法、凝胶过滤法、超滤法、超速离心法,5、据物质的解离程度不同进行分离：离子交换法、或电泳技术,分离精制方法,1、溶剂法,酸碱溶剂法,溶剂分配法,系统溶剂萃取法,逆流分溶法（CCD）,液滴逆流色谱（DCCC）,原理：物质在两相互不相溶的溶剂中因分配系数不同面分离,操作：用分液漏斗操作，剂量1/3盖好塞子，关好活塞,具体方法：盖好塞子，倒转，开启活塞 排气 关紧,轻轻振摇，反复操作，振摇2-3分钟，静置、分,层分离。,萃取溶剂：一般选择苯、氯仿、乙醚，偏亲水性成分用乙醇或,醋酸乙酯,注意事项：1、提取液相对密度1.11.2之间,2、萃取溶剂第一次用量一般为水提取液1/21/3,以后的用量可适当减少为水提取液1/41/6,3、分配系数差异较大的成分分离，一般萃取34次,4、易产生乳化现象，碱液下更严重,简单萃取法,分液漏斗,小量萃取法：,破乳方法,：,1、加热或冷冻;,2、将乳化层抽滤；,3、用金属丝搅拌,4、长时间放置（24h以上）,5、更换溶剂,6、加入饱和的食盐或戊醇,7、加入乳化剂乙醇,逆流连续萃取法,原理：主要利用流动穿过达到溶液,分离的技术,装置：a、高位容器,b、萃取管（管内有小的瓷环层,或不锈钢丝圈）,C、收集容器,注意事项：,相,1时，位于瓷环层内,相,1时，位于高位容器内,优点：操作简单，不易产生乳化现象,逆流分溶法（CCD）,是一种过程，如图114在多个分液漏斗中装入固定相，在No.1漏斗中溶质并加入流动相溶剂。振摇使两相溶剂充分混合。静置分层后，分出溜动相，令其移入No.1管，再在No.0管中补加新鲜流动相，再次振摇混合，静置分层并进行转移。如此连续不断地操作下去，溶质即在两厢溶剂相对作逆流移动过程中，不断的重新分配并达到分离的目的。进行多次转移时，使用分液漏斗十分不便，而需采用Craig逆流分溶仪，该仪器为由上百个萃取单元组成的全自动连续液-液萃取装置。每个单元相当于一个分液漏斗。CCD法因为操作条件温和、试样容易回收，故特别适用于中等极性、不稳定物质的分离。,液滴逆流色谱（DCCC）,该装置中分离管虽然是玻璃材料，但因为整组固定，不易破,损。并且分配用的两相溶剂不必震荡，因此不易乳化或产生泡,末，特别适合皂苷类的分离,原理：液液萃取,使流动相呈液滴形成垂直上升或下降。通过固定相的液,柱，进行分离,优点：不振摇，不易乳化或产生泡沫，适用于皂苷类成分。,沉淀法：,定义：在中药提取液中加入某些试剂使产生沉淀以获有效成分,或除杂的方法。,一）、试剂沉淀法,1、专属试剂沉淀法,生物碱类 生物碱沉淀物,甾体皂苷、三萜皂苷 甾体皂苷,2、分级沉淀法,水醇法：除去糖、蛋白质等水溶性杂质,醇水法：除去树脂、叶绿素水不溶性杂质,醇醚法：,沉淀皂苷成分与脂溶性杂质分离,雷氏氨盐,胆甾醇,二）、酸碱沉淀法,原理：某些成分能在酸或碱中溶解，继而又在碱或酸中生成沉淀,的性质而达到分离的目的,范围：内酯结构、黄酮类、难溶游离的ALK,三）、铅盐沉淀法（经典方法）,原理：利用中性或碱式醋酸铅在水或稀醇中能与多种成分生成难,溶性铅盐或络盐沉淀使其分离,范围：中性:有机酸、Pr、AA、鞣质、树脂、H,+,皂苷、部分黄,酮、香豆素和某些色素,碱式:除上述外还有中性皂苷、糖、异黄酮、OH,-,弱的ALK,注意事项：进行脱铅处理，用H,2,S法利于铅回收,另外：也可用硫酸、磷酸等，除铅不彻底；用强酸性阳离子快而彻底，但有些有效成,分也能被交换上去，同时脱铅树脂再生较困难,是利用混合物中各成分的沸点不同而进,行分离的,适用于液体混合物的分离,分馏法,（沸点）,利用天然或人工合成高分子膜，以,外加压力或化学位差为推,动力，对混合物中的化学成分进行分离、提纯等。反渗透、超,滤、微滤、电渗析为四大已开发应用的膜分离技术，其中反渗,透、超滤、微旅相当于过滤技术，溶剂、小分子能,透过膜而大,分子被截流。,大分子：蛋白质、多糖、鞣质,小分子：氨基酸、糖,膜分离法（外加压力或化学位差分子大小）,结晶法,原理：是分离精制固体成分的方法，利用各成分溶解度差异而达,到分离。,操作过程：,提取或分离物,溶于选择的溶剂，加热成饱和溶液，过滤,溶液,放置（冷藏）析晶，过滤,粗结晶,重复上述操作（重结晶）,结晶,影响结晶的因素：溶剂、温度、时间、最主要是合适,溶剂,结晶法溶剂的选择,1）要对被结晶成分热时溶解度大、冷时溶解度小，对杂质则冷,热都易溶解，或冷热都不溶解。,2）与被结晶成分不发生化学反应。,3）沸点不宜太高30150。,常用溶剂：水、MeOH、乙醇、异丙酮、乙酸乙酯、冰乙酸二,氧六环、CCI,4,、石油醚,混合溶剂：石油醚-乙醚、乙醇-乙醚、乙醇-丙酮、石油醚-苯、,乙醇-氯仿、乙醇-水,纯度测定：晶形、色泽、熔点、熔距,注意事项：,操作前要制备结晶液，有的采用抽气过滤，乙醚不宜用（因易,燃、易挥发使其被分离成分析出瓶壁上而影响纯度）,原理：利用小分子或小离子在溶液中可透过半透膜而大分子及,大离子不能通过借以达到分离。,透析膜：动物性膜、火棉胶膜、羊皮纸膜（硫酸纸膜）、玻璃纸,膜、Pr胶膜（明胶膜）,注意事项：,1、经常换水,2、确保一定的浓度差,3、加速则在两则加电压、速度可达10倍,透析法,定义,：固体物质加热不经过熔化就直接转变为蒸气，蒸气遇冷又,凝结为固体的称为升华。,注：某些中药含有升华性的物质，能利用升华的方法直接从中药中提取，在本草纲,目中已有记载（樟树中提取樟脑油）,影响因素,：,取决于该固体物质和杂质蒸气压的差别,1）若杂质是不挥发或挥发性较小的，而待纯化的物质有一定的,挥发性，则该物质可气化为蒸气状态而与不挥发的杂质分离,2）若被纯化的物质和所含杂质都是挥发性的，有时也可用不同,温度下蒸气压的差别，控制气化温度与冷凝温度来进行升华,升华法,（,Chromatography,色谱法),引言,又称色谱法或色层法,，是分离和鉴定化合物的有效方法,1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶,子的色素通过装填有吸附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动,后形成不同的色带而被分开，由此得名为“色谱法”,后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。,1944年出现纸层析。,以后层析法不断发展，相继出现气相层析、高压液相层析、,薄层层析、亲和层析、凝胶层析等。,层析法,基本原理:,利用混合物中各组分理化性质的差异（如吸附力、分子形状,及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（,一相,为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相,）中,的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离,的目的。,层析法的分类,按两相所处的状态分类：,流动相有两种状态：液体作为流动相,气体作为流动相,固定相也有两种状态：固体吸附剂作为固定相,以吸附在固体上的液体作为固定相,按两相所处的状态分为：,液相层析:液-固层析,液-液层析,气相层析:气-固层析,气-液层析,吸附色谱,凝胶过滤色谱,离子交换色谱,大孔树脂色谱,分配色谱,色谱分离法,按层析过程的机理分类：,吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能的差异，达到,分离鉴定的目的。,分配层析：利用不同组分在流动相和固定相之间的分配系数不,同，使之分离。,离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲和力的不同。,凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小的组分阻滞作用的,不同。,按操作形式不同分类：,柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离,纸层析：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展开，以达到,分离鉴定的目的。,薄层层析：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸层析类似的方法,进行物质的分离和鉴定。,吸附层析,吸附层析法（液-固色谱法，LSC）,一、组成三要素：,吸附剂、溶剂、被分离成分,二、基本原理：,原理：利用固定相的固体吸附剂表面对不同组分吸附力的大小,及洗脱液对它的溶解作用（解吸作用）差异进行分离。,特点：适合分离不同种类的化合物(醇类和芳香烃）。,三、吸附剂,1、定义：吸附剂是具有大表面积的活性多孔固体，与待分离物,质的极性官能团作用。,2、常用的吸附剂：,活性炭、硅石、AI,2,O,3,、羟基磷灰石等羟基磷灰石（HA）,Ca,10,(PO,4,),6,.(OH),2,可用于分离Pr与核酸。其表面有Ca,2+,和PO,4,3-,两种带电基团；酸性和中性Pr可与Ca,2+,结合；碱性Pr可与PO,4,3-,结,合。,HA柱层析最重要的用途之一是分离单链DNA和双链DNA，因为它对,双链DNA的亲和力大于单链DNA。,根据作用分,极性吸附：硅胶 氧化铝,非极性吸附：活性炭,氢键吸附：聚酰胺（酰胺羰基与酚类、黄酮类化合物的酚羟基，,或酰胺键上的游离胺基与醌类、脂肪羧酸上的羰基）,3、吸附剂分类,硅胶：,1）吸附原理：结构中含有硅醇基,2）影响因素：吸附能力大小与其含水量有关17，超过则失,去吸附能力,3）处理方法：在110干燥箱中活化30分钟，若温度超过150,500,时其结构变成硅氧基，则硅胶永久失去吸附,能力,4）适用范围：,为酸性和亲水性吸附剂,故适合酸性和中性成分的分离，,如挥发油、黄酮、蒽醌、强心苷、有机酸及酚性化合物、AA等,5）优缺点：吸附容量高，机械强度好，分离范围广，对碱性成,分分离不宜用,聚酰胺：,1、定义：又名绵纶，是由酰胺聚合而成的高分子化合物。常用,的有绵纶6（聚己内酰胺）绵纶66（聚已二酰已二胺）,2、原理：其分子内存在许多,酰胺基,与酚类的羟基、酸类的羧基,及醌类的醌基形成氢键而产生吸附。（如图210）,3、影响氢键大小因素,1）溶剂种类：其在水中最强，有机溶剂中较弱，碱液中最弱故,洗脱能力大小：水甲醇或乙醇丙酮稀氢氧化钠或稀氨,甲酰胺或二甲基甲酰胺尿素水溶液,2）分子结构有关：,a、形成氢键基团数目越多，被聚酰胺吸附越强,b、成键基团位置不同，吸附强度也不同,c、分子中芳香核、共轭双键多被吸附强度大，反之则小,d、能形成分子内氢键者被吸附强度小,4、范围：,常用于分离黄酮类、酚类、醌类、对鞣质的吸附因几不可,逆，故用于粗提物鞣质的除去。ALK、萜类、甾类、糖类、AA,类等分离也广泛应用,5、优缺点：,吸附强度大，适用于化合制备性分离,氧化铝,1、定义：为一种吸附能力很强的亲水性吸附剂,2、形式：有三种，酸性、碱性、中性,3、吸附能力：含水量用不同的活度级别来表示（如书中图),4、适用范围,用于碱性或中性亲脂性成分的分离如ALK、甾体化合物、强,心苷、尤是对ALK分离应用最多。,5、优缺点,分离效果好；再生容易；对醛、酮、酯、内酯类不宜用（因与某些酸性、酚性物质及色素发生异构化，氧化和消除反应等次级反应）,四、溶剂：,选择何种溶剂作为移动相对分离效果影响极大，应考虑下面几点,1、所选溶剂具备高纯度、不含水；,2、与试样吸附剂不起化学反应,3、对被分离成分有适当的溶解度,4、粘度小,5、易挥散,对极性吸附剂：流动相溶剂极性越大，展开或洗脱能力就越强,对非极性吸附剂，流动相溶剂极性越小，展开或洗脱能力就越强,五、被分离物质,其成分结构和极性大小决定与吸附剂、溶剂间作用,1、对极性吸附剂，被分离物质极性越大，被吸附越强，溶剂展,开或洗脱就越困难。,2、影响极性大小因素,化合物极性大小与官能团种类、数目、位置有关，还于分子,中电效应、立体效应有关。,常见官能团大小顺序：,RH（烷烃烯烃芳烃）RX（卤烃）-COOR C=O,-CHO-SH-NH,2,-OH Ar-OH-COOH,故极性吸附剂适用亲脂性成分，非极性吸附剂适用于亲水性成分,六、操作方法,1、TLC,制板（见实验）、点样、展开、显色、测定比移值,2、柱色谱,装柱、上样、洗脱、收集,原理：分子筛作用,是利用分子筛分离物质的一种方法，其所用的载体凝胶是,具有多孔隙网状结构的固体物质,如：葡聚糖凝胶,（sephadex G）,羟丙基,葡聚糖凝胶(sephadex LH-20),凝胶过滤色谱（凝胶渗透色谱、分子筛滤过、排阻色谱）,凝胶作用原理：,水中膨胀的球形颗粒，具有三维空间的网状结构。当在水中,充分膨胀后装入色谱柱中，假如试样混合物，用同一溶剂洗脱,时，由于凝胶网孔半径的限制，大分子不能渗入到凝胶颗粒内,部，因此在颗粒间隙移动，并随溶剂一起从柱底先流出来，小,分子进入到颗粒内部，通过色谱柱时阻力增大、流速变缓，将,较晚流出，所以，经过一段时间流动后并达到动态平衡后，分,子按着由大到小的顺序先后流出并得到分离。,羟丙基,葡聚糖凝胶,只适于在水中应用，而经羟丙基化处理,后得到的产物，不仅可以在水中使用，也可在极性有机溶剂或,它们有水组成的混合溶剂中湿润膨胀后使用,原理：吸附性和分子筛性原理相结合,吸附性：,范德华引力或氢键的,分子筛：,多孔性,应用：糖与苷的分离、生物碱的精制,大孔吸附树脂,原理：被分离成分在固定相和流动相之间的分配系数不同,正相分配色谱：流动相极性固定相极性,HPLC、MPLC、LPLC,分配色谱,中药有效成分化学结构的研究方法,从中药中提取、分离出的有效成分，必须经过化学结构的,鉴定，才有可能进行有效成分的生物活性、构效关系、体内代,谢、结构改造等研究，在结构研究之前，必须对成分的纯度进,行检验，来确定此化合物为单体化学成分，一般常用各种色谱,法如需要注意的是无论采用那种方法，不能仅用一种溶剂系统,或色谱条件，另外，对固体物质还可以通过测定熔点，考察溶,距（0.51.度），液体样品的沸程在5度以内，即可认为是较,纯的单体化学成分，可以进行化合物的鉴定和结构测定。,通过一定的依据判断化合物可能为已知化合物时，在有对照品的情况下，最好用对照品同时进行熔点、混合熔点、色谱、IR对照，如果熔点相同，混合后熔点有不降低，色谱中的RF值相同，IR谱相同，就可以去确定该化合物和对照品为同一化合物。,若无对照品，就需要多做些数据，或制备成衍生物，再进行测定，与文献数据进行核对，如果是未知的化合物，则需要进行以下的实验，进行结构测定。,核磁共振谱（NMR）,有机化合物又叫碳水化合物，决定有机化合物结构时，C谱起更,重要的作用，但C谱发展慢，原因如下：,1H-NMR：早,13C-NMR：晚,检测灵敏度太低,1）,13,C 的自然丰度低，自然界中,13,C 是,12,C的1.1%（而,1,H 是98.88%）,2）,13,C 磁旋比=6.726,1,H 磁旋比=26.752,NMR信号强度,3,碳谱的特点及提供的信息,1、优点：,化学位移范围大，分辨率高 13C:0250 ppm,1H:,020 ppm,谱线简单，易解析,直接提供C骨架信息（、J）,2、缺点：,需用样品多 测定时间长 仪器要求高,吸收强度不与C数目成正比，不代表C原子个数,解决办法：,脉冲付里叶变换技术和计算机，扫描次数累积，信号不断增强,3、提供信息,1）,13C,信号的化学位移,0250 ppm 信号之间很少重叠，识别,起来比较容易化学位移与C原子杂化方式、与周围化学环境,有关，可判断C原子类型,sp 3 sp sp 2,20100ppm 0130ppm 100200ppm,烷烃 炔烃 烯烃,杂化方式,诱导效应,共轭效应,取代基构象,影响因素,2),13,C的信号裂分,、,13,C与,1,H均为磁性核，自旋偶合互相干扰，使对方信号裂分,、H谱中,13,C核干扰极少，乎略不及，只有,1,H-,1,H同核偶合,、C谱中，,13,C自然丰度太低，,13,C-,13,C相连几率只有0.1%，同,核偶合影响一般忽略，但是异核,1,H-,13,C偶合十分突出,、H核,自旋偶合干扰产生的裂分数目遵守n+1规律，,13,C信,号表示为q(CH,3,)+(CH,2,)d(CH,2,)s(C ),B,A,(四),13,C-NMR技术图谱,1、噪音去偶谱（全氢去偶谱、宽带去偶谱）,特点：采用宽频（1000Hz）的电磁辐射照射样品，消除所有H核,对所磁核的偶合，所有,13,C信号，在图谱上作为单峰（单,线）出现,简化图谱，每个峰代表一种类型C，对判断,十分方便,照射H后，产生NOE效应，连有,1,H的,13,C信号强度增加，但季C不,连有 H，信号为较弱的吸收峰。,NOE效应：一对相关峰(A、B)照射A，则A消失，B峰增强，照射,B，则B消失,A峰增强。,2、偏共振去偶(ORD),质子噪音去偶消除了全部13C 1H偶合，得不到C与H相连,的许多结构信息，采用偏共振去偶测得C核信号由于连接H核,的数目不同而产生不同裂分，CH3(q)CH2(t)CH(d),季C(s)区别伯、仲、叔、季碳原子。,3、INEPT谱：不灵敏核极化转增强法,DEPT谱：无畸变极化转移增强法,新技术：通过改变照射1H核的脉冲宽度或设定不同的驰预时间,特点：在图谱上不同类型的13C信号呈单峰形成，分别朝上或朝下，灵敏度高，信号之间不重叠,一级解析过程,1、充分了解样品基本数据(分子量、分子式、可能含有的基团),2、求不饱和度=+/2+/2+1,(：四价原子C、S ：三价原子N、P：一价原子H、X),3、测,1,H谱,4、测,13,C谱,计算谱线数是否与C数相同,相同：没有对称结构，各C结构不同,不同：谱线数少于碳数，分子中有对称结构,谱线数多于碳数（溶剂峰，异构体峰，杂质峰，分子式测得,不准）,解析化学位移(分四大区),040 脂C区,4080 取代脂C区,80150 芳烯C区,150200 羰基区,200,150,100,90,80,40,20,0,第三节：结构研究法,一、化和物的纯度测定,方法：检查有无均匀一致的晶形，有无明确、敏锐的熔点（熔,距一般为12）及色谱法。其中色谱法包括：TLC、,PC、GC、HPLC。,二、结构研究的主要程序,1.初步推断化合物类型,2.测定分子式，计算不饱和度（,=-/2+/2+1,）,3.确定分子式中含有的官能团、结构片段、基本骨架,4.推断并确定分子的平面结构,5.推断并确定分子的主体结构（构型、构象）,文献检索、调研工作贯穿结构研究工作的整个过程利用中、,外文主题索引按中药拉丁文学名进行检索,来获得已分出化合物,的种类、个数、性质、用到的提取方法、提取溶剂、色谱的溶,剂系统、生物活性等信息 获得文献后，最好整理成一览表以,方便检索比较。,已知化合物：,还需做混合熔点测定和混合的IR光谱,未知化合物,：需按测定程序进行，如有不对称中心，还需测定,绝对构型。,三、结构研究中采用的主要方法,1.确定分子式，计算不饱和度,a.元素定量分析配合分子量测定,元素定性分析：如钠融法，分析化合物含有几种元素,元素定量分析：确定各元素百分含量，根据倍比定律确定分子,中的原子比,分子量测定：冰点下降法、沸点上升法、粘度法、凝胶滤过法,及质谱法。,如：刺果甘草中分离的一白色针晶，元素定性分析：含有C、H、O。,元素定量分析:C：79.35%,H：10.21%,O：10.44%；原子比为,10.16：15.58：1，约化为10：16：1；质谱得到其分子量为,456，（C,10,H,16,O）,n,=456所以最后确定其分子式为C,30,H,48,O,3,b.同位素丰度比法,c.高分辨质谱（HR-MS）法,HR-MS还可以给出化合物的精确分子量。,从氢核磁共振波谱和碳核磁共振波谱中可直接获得碳氢的个数，再结合质谱给出的分子量的信息，就可以得到氧的个数,，用这种方法也能确定化合物的分子式。,d.不饱和度,u=-/2/21,、分别代表一、三、四价原子的数目。,2.质谱法,常用的质谱有：电子轰击质谱（EI-MS）、场解析电离质谱（FD-MS）、快原子轰击质谱（FAB-MS）、电喷雾电离质谱（ESI-MS）等。,质谱常用于确定分子量，并可求算分子式和提供其它结构信。,3.红外光谱,利用分子中价键的伸缩及弯曲振动在4000625cm,-1,红外区域引起的吸收，而测得的吸收图谱。,包括特征频率区和指纹区,可用于鉴别羟基、氨基、双键、芳环等特征官能团以及芳环取代类型。（如下图）,4.紫外-可见吸收光谱,由电子能级跃迁产生的吸收图谱，在200700nm范围内含有共,轭双键、发色团及具有共轭体系的助色团分子的化合物具有紫,外-可见吸收。,主要用来推断化合物的骨架类型。,羟基,羰基,特征区,指纹区,5.核磁共振波谱（NMR）,核磁共振波谱是化合物分子在磁场中受到另一射频磁场的照,射，当照射场的频率等于原子核在外磁场的回旋频率时，有磁,距的原子核就会吸收一定的能量产生能级的跃迁，即发生核磁,共振，以吸收峰的频率对吸收强度作图所得到的图谱。,1,HNMR和,13,C-NMR，能提供分子中有关氢及碳原子的类型、,数目、互相连接方式、周围化学环境以及构型、构象等结构信,息。在进行中药有效成分的结构测定时，NMR谱与其它光谱相,比其作用更为重要。,1）,1,H-核磁共振（,1,HNMR）,1,H NMR通过测定化学