食品中微生物数量的检测技术和指示菌类培训课件.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,一、食品中的菌数检测技术及其新进展,二、指示菌类,三、其他菌类数量的检测方法,2,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,第一节 食品中的菌数检测方法及其新进展,一、显微镜直接计数法,二、平皿菌落总数测定法,三、最近似数测定法,四、还原试验法,五、其它方法,3,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,中华人民共和国食品卫生法,第四条指出：“食品应当无毒、无害，符合应当有的营养要求，具有相应的色、香、味等感官性状”。,这一条就明确地规定了食品的卫生要求。,食品的卫生要求,4,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,检测食品中微生物数量的卫生学意义：,可作为食品被微生物污染程度的标志（或食品清洁状态的标志）。,预测食品贮存期限（保质期）。,食品中细菌总数还能反映食品的新鲜程度、是否发生变质。,5,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,理想情况,：,理想的检测方法是对所有食品都适用，并在短时间内获得准确结果。,实际上：,至今还没有一种通用的方法能准确测出食品中的实际活菌数，都有一定的误差、适用范围和优缺点。,6,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,一、显微镜直接计数法,（,DMC,）,1、,直接涂片计数法,（1）操作方法,将,0.01mL,经适当稀释的样品,均匀涂布,于载玻片上的,1cm,2,面积的方格内，经干燥、固定、革兰氏染色后，用显微镜观察计数。,在计数前先用物镜测微尺测出油镜视野的直径，再观察计算,1015,个视野的细菌总数，求出平均数。,r,显微镜油镜视野的半径,（mm）,B,稀释倍数,7,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,涂片：接种环，挑取菌落，生理盐水一滴，涂匀,热固定：通过火焰若干次,初染：结晶紫一滴，,1min,，水洗,媒染：碘液一滴，,1min,，水洗,脱色：,95%,乙醇，约,30s,复染：复红一滴，,30s,8,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,9,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,10,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,11,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,12,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,13,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,14,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,（2）,特点,操作简便、快捷,不能区分活菌与死菌，计数结果偏高，,只适用于菌数较高的样品,只适用于计数单细胞的微生物,15,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,2,、,血球计数板计数法,将适当稀释的样品注入血球板的计数室中。由于计数室的容积是已知的（,0.1mm,3,），计算一定微小体积内的菌数，即可计算出每克或每毫升样品中的菌数。,16,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,菌体细胞数（,cfu/ml,）,=,小格内平均菌体细胞数,40010,4,稀释倍数,17,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,特点,操作简便、快速，可在十分钟内得到结果。待测标本未经火焰固定杀死细胞，故所测结果为,活菌数,。,此法适用于计数单细胞的酵母菌。,18,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,二、平皿菌落总数测定法,（,SPC,）,平皿菌落总数测定法,是最常用的一种,活菌计数法,，也是我国卫生标准规定的公认可行的方法，因此又称标准平皿活菌计数法,。,19,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,菌落总数：,食品检样经过处理，在一定条件下（如培基基、培养温度和培养时间等）培养后，所得,每,g,（,mL,）检样中形成的微生物菌落总数。,只包括一群在平板技术琼脂上生长发育的嗜中温需氧或兼性厌氧菌的菌落总数。,菌落总数不等于细菌总数。,CFU,：,菌落形成单位,20,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,国标,（GB）,规定,：,在需氧条件下,：,细菌：,PCA,36,1 48h,霉菌、酵母：,PDA,或孟加拉红培养基,281 5d,21,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,酵母菌、霉菌在孟加拉红培养基上典型特征,22,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,菌落总数的测定,平板菌落计数法程序,菌落计数,选择23个适当稀释度悬液各1,ml，,加入无菌空培养皿内，每个稀释度做23个培养皿,用生理盐水进行无菌稀释，做成几个适当稀释倍数的悬液,每个培养皿中倾注约15,ml,熔化并冷却到4,6,左右的平板计数琼脂培养基，冷却后，于37培养48,h,被检样品,报告结果,23,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,（一）样品采集,1、,采样原则：,确定性、随机性、,代表性,、无菌操作、原始性,2、采样方法,：,无菌操作，分类操作,有包装食品 应采用,完整的未开封,的样品,粉末状样品 边混合边取样,液体样品 振摇均匀取样,冷冻样品 保持冷冻状态,非冷冻样品 保存在,05,24,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,3、,采样数量和部位：,（1）即食类预包装食品：,取相同批次最小零售原包装,（2）非即食类预包装食品：,500mL,液态食品 混匀后，从相同批次的不同,容器中取,5,倍检验单位样品,500g,固体食品 从同一包装的不同部位分别取样,（3）,散装或现场制作食品,根据食品不同类别和性质，取,5,倍检验单位样品,25,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,4,、采样标记：,及时、准确、清晰填写采样单（包括采样人、采样地点、时间、样品名称、来源、批号、数量、保存条件等信息）。,5、采样的贮存和运输：,应在接近原温条件下尽快送检，并保持样品完整。如不能及时运送，应在接近原温条件下贮存。,26,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,代表单位（章）代表单位（章）,签字 签字,日期年月日 日期 年月日,采样单,27,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,（二）送检,认真核对登记样品信息,应按要求尽快检验。如不能及时检验，应采取必要措施保持样品原有状态,冷冻食品,45,以下不超过,15,分钟，或,2,5,不超过,18h,解冻后检验,不得加入防腐剂保存,28,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,（三）样品的处理和稀释,1）,取样,无菌操作,25g,（,mL,）放入,225mL,无菌生理盐水或磷酸盐缓冲液中（,1:10,稀释液）,2）均匀混合,无菌均质杯,800010000 r/min,均质,12 min,，或用拍击式均质器拍打,12 min,29,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,30,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,3,）稀释,31,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,4,）,倾注平板,稀释液移入平皿后，将,4,6,左右的平板计数琼脂培养基注入平皿约,15,ml,，,转动平皿。,32,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,33,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,34,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,5,）,倒置,培养,琼脂凝固后，翻转平板,细菌：一般食品,36,1 48h,水产品,3,0,1 72h,霉菌：,281 5d,35,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,（四）菌落计数法,肉眼观察（直接、放大镜）,利用自动影像分析菌落计数仪,36,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,10,-1,均数,10,-2,均数,描 述,最终结果,255,36,均在,30300,间则按计数公式,2.610,3,多不可计,345,各平板均,300,，取稀释度最高者报告，余计为多不可数,3.510,4,12,2,均小于,30,则取稀释度最低者报告,1.210,2,330,29,所有平板均不在,30300CFU,且一部分,300,者以最接近,30,或,300,者报告,2.910,3,0,0,所有平板均无菌落则记为,1,乘以最低稀释倍数报告,110,即,10,结果表述,37,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,（五）菌落计数的报告,报告单位：,cfu/g(mL),1、,平板菌落数的选择：,30300cfu,2、菌落数的计算：,3、菌落数的报告：,低于,30,时 按实数报告,100cfu,以,内时 按四舍五入修约，采用两位有效,数字报告,100,时 第三位数四舍五入修约，取前两,位数字,例：,205043,21000,0,or 2.110,5,38,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,先倒平板，待其凝固后，吸取0.1ml稀释液于平板表面上，用无菌玻璃刮铲在整个平板上均匀涂布，培养观察。,涂布平板法,39,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,40,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,涂布法的优缺点,可检测到,热敏性,菌株,菌落形态比较明显,更适合于严格的好氧菌,没有倾注法简便，易造成机械损伤,41,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,三、,最近似数测定法,（most probable number MPN）,对未知样品做连续的,10,倍稀释，选择,3,个,连续,的,10,倍稀释液，每种稀释液接种,3,管（,5,管）装有培养基的试管中培养，根据实验结果查,MPN,检索表，得到样品中微生物的数量。,42,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,43,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,根据经确证后的对应浓度阳性管数查,MPN,表,MPN,：最可能数，基于泊松分布的一种间接计数方法,阳性管数,MPN,95%,可信限,0.10,0.01,0.001,下限,上限,0,0,0,1100,420,-,44,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,45,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,MPN,的优点：,操作简便,与,SPC,相比，,相似率较高,采用选择性培养基可检测特殊微生物菌群,特别适用于检测食品内含菌量较少的样品,46,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,MPN,的缺点：,需要大量的玻璃器皿,不能观察微生物菌落形态,要注意严格的无菌操作,47,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,食品冷饮大肠菌群检验纸片冷饮、乳制品和调味品等大肠菌群的测定,48,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,餐具大肠菌快速检验纸片餐具卫生消毒效果检测,49,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,四、还原试验法,一种,估计活性微生物数量,的方法,原理：,微生物细胞在进行生物代谢的氧化还原过程中，有的被氧化，有的被还原，测定还原能力即可推测样品内的菌数。,某些指示剂和色素可反映这个变化，,这些成分的还原,时间同细菌数量成反比。,50,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,三种染料：,美蓝,：,美蓝（蓝色）无色,刃天青：,刃天青（蓝色）粉红色或无色,红四氮唑（TTC）：,红四氮唑（无色）粉色或红色,51,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,美蓝还原试验表,美蓝褪色时间,估计每毫升样品中的细菌总数,鲜乳的质量,20min,内,20 000 000,以上,很差,20min,至,2h,4 000 00020 000 000,差,较差,2h,至,5.5h,500 0004 000 000,一般,较好,好,5.5h,以上,500 000,以下,很好,美蓝,：美蓝（,蓝色,）无色,52,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,韧天青还原试验表,级别,鲜乳的质量,乳的颜色,相当于每毫升牛乳中的细菌总数,经,20min,经,60min,1,良好,青蓝色,青蓝色,小于,50,万,2,合格,青蓝色,蓝紫色,50400,万,3,不好,青蓝色或粉蓝色,粉红色,4002 000,万,4,很坏,白色,白色,大于,2 000,万,刃天青：,刃天青（,蓝色,）,粉红色,或无色,53,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,显色状态判断标准,显色状态,判 断,显色状态,判 断,未显色者,阳 性,微红色者,可疑,桃红色,-,红色,阴 性,红四氮唑（TTC）：,红四氮唑（无色）,粉色或红色,54,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,五、浊度测量法,原理,利用浊度计或分光光度计测定培养液中微生物的生长量。当某一波长的光线通过混浊的液体后，光的强度被减弱。因为菌体不透光，在一定浓度范围内，悬液中单细胞的数量与光密度（,OD,值）成正比。,56,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,当细菌浓度达到,10,7,个,/ml,时，培养基会浑浊,57,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,优点：,样品数量较多时，此法与,SPC,方法相比省时省力。,缺点：,若样品颜色较深或含有固体颗粒时，不宜采用。,58,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,菌数测定方法,直接法,间接法,显微镜直接计数法,平板菌落总数测定法,还原试验法,最近似数测定法,浊度测量法,ATP,生物发光法,试验测定法,电阻抗测量法,放射测量法,但至今没有一种常用的方法能准确测出食品中的实际活菌数，也没有一种方法对所有的食品都适用。,59,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,第二节 指示菌类,一般情况下，若要直接检查食品中的病原菌困难较大,实践中，常用某些指示菌类的办法来评定食品的卫生质量,60,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,表明食品被粪便污染和病原菌存在的,指示菌应具备的特征：,指示菌必须与肠道致病菌密切相关,；,指示菌对不良因素的抵抗力与病原菌大致相同；,指示菌与病原菌繁殖速度大致相同,；,培养、分离、鉴定方法简便，容易检验,61,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,1,、,大肠菌群,（,coliforms,）,卫生细菌领域用语,与粪便污染有关的细菌,定义：,一群在一定培养条件下可发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌。,62,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,典型大肠杆菌为粪便近期污染的标志,其它菌属则为粪便陈旧污染的标志,ETEC,EIEC,阴沟肠杆菌,EHEC,大肠菌群,耐热大肠菌群（粪大肠菌群）,大肠杆菌,产气克雷白氏菌,大肠埃希氏菌,柠檬酸杆菌,O157,：,H7,63,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,2,、,大肠菌群的食品卫生学意义,作为食品被粪便污染的指示菌,MPN,值愈低则说明食品受粪便污染程度及对人体健康危害程度愈低,作为食品被肠道致病菌污染的指示菌,大肠菌群数量越多则肠道致病菌存在的可能性就越高，但两者之间并不总是呈平行关系,要求食品中大肠菌群完全不存在是不可能的，重要的是其污染程度即菌量,64,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,3,、,大肠菌群检测方法与检测结果,检测方法,：,MPN,计数法：,LST,发酵试验,BGLB,发酵证实试验,平板计数法：,VRBA,平板计数,BGLB,发酵证实试验,见,GB/T4789.3-2010,检测结果：用每,1mL(g),样品中大肠菌群最近似数来表,示，简称大肠菌群MPN。,65,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,LST,发酵试验,BGLB,VRBA,平板,66,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,第三节 其他菌类数量的检测方法,一、嗜冷菌数量测定,采用,SPC,法,，,在,7,培养,10d,观察肉眼可见菌,适用于检验鱼类、贝类等冷冻食品和低温冷藏食品中的嗜冷菌,67,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,二、耐热菌与芽孢数量的测定,耐热菌：将少量样品,72,处理,15s,后，与,45,左右的已溶化的培养基混合，于,3032,培养,48h,计数。,芽孢数量：将样品分成几份，分别,80,处理,10min,，,85,处理,1015min,后，立即冷却至,10,以下，与,45,左右的已溶化的培养基混合。,嗜温菌芽孢,30,培养,72h,计数，嗜热菌芽孢,55,培养,48h,计数。,68,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,三、酵母菌与霉菌数量的测定,采用,SPC,方法，以,PDA,或孟加拉红培养基于,28,培养,5d,后观察计数。,选取菌落数在,10150CFU,之间的平皿计数，其它计数原则、报告方式与菌落总数相似。,69,食品中微生物数量的检测技术和指示菌类,