第四章DNA长度多态性1RFLP.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,限制性片段长度多态性 RFLP,限制性片段长度多态性RFLP,1 RFLP技术的简介,2,RFLP的实验步骤,3,RFLP技术在法医物证学的应用,RPLF技术的简介,个体差异大多数都是由于不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域发生中性突变。这些突变构成的差异成为DNA多态性。,假如DNA 顺序中的某个碱基发生了突变，使突变所在部位的DNA 序列产生（或缺失）某种限制性内切酶的位点。这样，利用该限制性内切酶消化此DNA 时，便会产生与正常不同的限制性片段。在同种生物的不同个体中会出现不同长度的限制性片段类型，即限制性片段多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP）。,RFLP技术的步骤,Southern杂交,转膜,凝胶电泳分开DNA片段,酶切,不同个体,DNA的提取,谱带显示,基因座,片段断裂,抽提DNA或PCR扩增后的DNA经内切酶酶,切,然后在琼脂糖凝胶电泳分析，适合较,大分子的DNA分析,DNA先酶切，电泳分离，变性后转移到尼龙膜,或硝酸纤维膜，然后与同位素标记的探针杂交，,最后做放射自显形，就可检测出多态性条带。,实验步骤,一、不同个体,DNA的提取,1.采用适当的化学试剂裂解细胞，或者用组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞；,2.用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA；,3.用有机试剂（酚/氯仿）抽提方法去除蛋白质。,二、限制性核酸内切酶,消化,一般选择一种限制酶来切割DNA分子，但有时为了某些特殊的目的，分别用不同的限制酶消化基因组DNA。,切割DNA的条件可根据不同目的设定，样本DNA必需充分消化，否则将影响分型结果。,消化DNA后，加入EDTA，65加热灭活限制酶,样品即可直接进行电泳分离，必要时可进行乙醇沉淀，浓缩DNA样品后再进行电泳分离。,限制性核酸内切酶,限制性内切酶（restriction endonuclease）是来源于细菌体内的一类酶，能够识别双链DNA中特殊回文序列并且能在识别序列内将DNA双链切断。,多在原核生物中存在，能识别46个特苷酸特定的碱基序列。,EcoRI把GAATTC在GA之间切开，形成粘性末端。也有一些限制酶作用的结果产生不含粘性末端的平整末端，如HapI。,常用的限制性内切酶一般是Hind，BamH,EcoR,EcoRV,Xba,选择条件：限制酶活性稳定；识别序列靠近VNTR序列的两翼；特异性稳定，条件易控制；DNA片段不易受甲基化的影响。,两断端分别有突出的,碱基个数称为黏性末,端,两断端无突出的,碱基个数称为平端,三、电泳分离,原理：DNA是两性电解质，在同一电场强度下DNA片段长度与片段的迁移率成反比。,在低压恒定电压下，将DNA样品放在0.60.8%琼脂糖凝胶中进行电泳，标准的琼脂糖凝胶电泳可分辨3.023.0kp的DNA片段，故可对DNA片段进行分离。,分辨大片断的DNA需要用浓度较低的胶，分辨小片段DNA则需要浓度较高的胶。,另外为了便于测定待测DNA分子量的大小，往往同时在样品邻近的泳道中加入已知分子量的DNA样品即标准分子量DNA（DNA marker）进行电泳。,琼脂糖凝胶电泳,四、印迹转移,概念：分离的DNA片段从凝胶上原位转移到一张高机械强度的支持膜上，这个过程就叫印迹转移。,支持膜多用尼龙膜，常用的转移方法为真空转移,转移完毕后，尼龙膜漂洗需用0.4mmol/LNaOH处理,转膜,即将凝胶中的单链DNA片段转移到固相支持物上。而此过程最重要的是保持各DNA片段的相对位置不变。,DNA是沿与凝胶平面垂直的方向移出并转移到膜上，因此，凝胶中的DNA片段虽然在碱变性过程已经变性成单链并已断裂，转移后各个DNA片段在膜上的相对位置与在凝胶中的相对位置仍然一样，故而称为印迹（blotting）。,用于转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素膜（NC膜）、尼龙（Nylon）膜、化学活化膜和滤纸等，转膜时可根据不同需要选择不同的固相支持物用于杂交。其中常用的是NC膜和Nylon膜。,五、分子杂交,基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。,分类：,鉴别DNA的分子杂交称为,Southern印迹杂交,（Southern blot），待检的对象是DNA片段；,鉴别RNA的分子杂交称为,Northern印迹杂,交,（Northern blot），待检的对象是RNA片段；,鉴别蛋白的杂交称为,Western印迹杂,交,（Northern blot），待检的对象是蛋白；,实验步骤,1,预杂交：封闭固相滤膜上非特异性DNA结合部位，起到消除图谱的背景信号的作用。,2 杂交：将尼龙膜置杂交管内，加入含有探针的杂交缓冲液，进行探针和靶DNA杂交。,3 洗膜：固相膜经漂洗，去除杂交膜上未与靶DNA杂交的多余的探针，降低图谱的背景信号。,离子强度越低，温度越高，杂交的严格程度越高，也就是说，只有探针和待测顺序之间有非常高的同源性时，才能在低盐高温的杂交条件下结合。,多基因探针在低强度杂交洗膜的条件下进行，5SSC洗膜液，温度55C。,单基因探针在高强度杂交洗膜的条件下进行，0.1SSC洗膜液，温度65C。,探针,组成,：特异性单链DNA和标记分子,特异性单链DNA,：小卫星DNA的核心序列串联形成的多聚 体，分为单基因探针和多基因探针。,单基因探针：要求所测基因座的多态性高，探针特异性高能与靶片段的等位基因稳定杂交。,多基因探针：VNTR基因座核心序列具有同源性，探针特异性低，可与多个VNTR基因座基因杂交。,探针标记,：标记、探针、靶DNA形成一体，经标记分子检测 可以确定靶基因片段位置,六、谱带显示,原理：酶标记物的显示是通过,酶反应耦联化学发光的技术。酶,反应的发光底物被氧化剂及标记,酶催化，氧化成激发分子状态，,在跃迁回基态时释放出分子，,能被使X光片感光。,含义：在杂合子中一条带表示一个,等位基因，在纯合子中表示两个相,同的等位基因。在DNA指纹中，一条,带表示不同基因座相同长度的基因,片段。,RFLP技术的应用,1.,鉴定是否是需要的DNA片段,2.建立基因组图谱,3.遗传性疾病的研究和诊断,研究：根据多态性片段寻找与疾病相关的基因。,诊断：直接检测、连锁分析,。,4.,疾病易感或抵抗基因的检测,5.器官移植配型,6.病原体的分型,7.药物遗传学和药物基因组学,8.在法医物证学上应用,个体识别,亲子鉴定。,DNA纹印,在法医鉴定应用,1 个人识别,假如两个检材来个不同的两个个体，两个体完全一致概率,X,n,(X指共有同一片段概率，n指匹配片段数目）,2 亲子鉴定,无法确定片段指孩子某些片段既不是来自被控父亲，也是来自母亲，这些片段称为无法确定片,计算方法：1、计算无法确定片段/非母片段数的比值,认定生父关系的比值为0,0.2，非,生父关系的比值为,0.41，错判率小,2、计算AF与C的共有片段的比值,认定生父关系的比值为0,0.35，非,生父关系的比值为,0.451，错判率大,计算方法缺乏理论基础，不科学。,基本特征,1 高多态性,2 遗传规律,3 个体组织的同一性,4 群体遗传学特征。群体遗传学参数由群体调查获得，样本量不小于200个个体。一个基因座具体的等位基因数不确定，原因：1 凝胶电泳分辩有限。2 片段长度测量有误差。,5 高突变率 如一基因座的突变率超过0.2，不宜用于亲子鉴定。,6 种属特异性,量化DNA纹印的等位基因频率,原理：将连续随机变量的等位基因频率通过数据处理成为离散行变量,方法：固定箱分析法和滑动箱分析法,固定箱分析法是将片段长度范围从大到小人为分为若干个“箱”，位于一个箱的片段是一个等位基因。,DNA纹印应用,1 个人识别,经过检测，两份生物检材的遗传标记表型一致，称为匹配。,群体中两个无关个体因偶然而表型匹配的机会，称为匹配概率（Pm)。,2 亲子鉴定,认定父子关系的指标是父权指数（PI)相对父权机会（RCP),单基因座纹印,谢谢！_,