酶化学III作用机制.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,酶的作用机制和活性调节,一,、,酶的活性部位,1、,活性中心的概念,酶是蛋白质，研究表明，酶的特殊催化能力只局限于在大分子的一定区域，也就是说只有少数特异的氨基酸残基参与底物结合及催化作用。这些特异的氨基酸残基比较集中的区域，即与酶活力直接相关的区域称为酶的,活性部位,(active site)或,活性中心,(active center)。,参与构成酶的活性中心和维持酶的空间构象所必需的基团称为酶分子的必需基团(necessary group),组成酶活性中心的氨基酸侧链基团主要有Glu和Asp的,-COOH，Lys的-NH,2,，His的咪唑基，Ser的-OH，Cys的-SH，Tyr的侧链基团,结合部位,催化部位,酶活性中心,结合部位：,负责与底物结合，决定酶的专一性,催化部位：,负责催化底物键的断裂形成新键，决定,酶的催化性质和催化能力,2、,活性中心与必需基团,结合部位,(Binding site)：,调控部位,(Regulatory site):,酶分子中存在着一些可以与其他分子发生某种程度的结合的部位，从而引起酶分子空间构象的变化，对酶起激活或抑制作用,3、,活性中心的特点,活性部位在酶分子的总体中只占相当小的部分,，通常只占整个酶分子体积的1%2%,几乎所有的酶都由100多个氨基酸残基组成，而活性部位只有几个氨基酸残基所构成，酶分子的催化部位一般只由23个氨基酸残基组成，而结合部位的残基数目因不同的酶而异，可能是一个，也可能是数个,酶活性部位的结构互补性,酶的活性部位并不是和底物的形状正好互补，而是在酶与底物结合的过程中，底物分子和酶分子或者两者的构象同时发生了一定的变化后才互补的，这时催化基团的位置也正好在所催化底物键的断裂和即将生成键的适当位置，这个动态的辨认过程称为诱导契合,(induced-fit),酶与底物的诱导契合,酶活性部位的位置,酶的活性部位位于酶分子表面的一个裂缝,(Crevice),内，底物分子(或一部分)结合到裂缝内并发生催化作用。裂缝内是相当疏水的区域，非极性基团较多，也含有某些极性的氨基酸残基以便于底物结合发生催化作用。非极性性质在于产生一个微环境，提高与底物的催化能力有利于催化，在此裂隙内底物有效浓度可达到很高,酶活性部位的柔性或可运动性,在研究酶的变性过程中发现，当酶分子的整体构象还没有受到明显影响之前，活性部位已大部分被破坏，因而造成活性的丧失，说明酶的活性部位相对于整个酶分子来说更具柔性，这种柔性很可能正是表现其催化活性的一个必要因素,酶和底物之间的作用力,酶与底物之间通过次级键相互识别和结合,4、,研究酶活性部位的方法,(1)、,酶分子侧链基团的化学修饰法,(共价标记法),缺点：,化学修饰可能使活性部位以外的氨基酸残基被修,饰，影响酶分子的正常空间结构，从而导致酶活,性的丧失,、,采用特定的化学修饰剂将活性部位的氨基酸侧链进行共价修饰，造成酶活性的丧失,酶分子中可以被修饰的基团很多，如巯基,、,羟基,、,咪唑基,、,氨基,、,羧基和胍基等，可以做化学修饰的试剂也很多，目前已有70多种，但非常专一的并不多,非特异性共价修饰：,修饰剂和氨基酸残基的侧链基团反应引起共价结合,、,氧化或还原等修饰反应,非必需基团：,修饰后不引起酶活力的变化,必需基团：,修饰后引起酶活力降低或者丧失,必需和非必需基团的鉴别,判断必需基团的实验依据：,酶活力丧失程度和修饰剂浓度成一定比例关系,底物或与活性部位结合的可逆抑制剂可保护共价修,饰剂的抑制作用,例1：,DFP或DIFP(二异丙基氟磷酸)对丝氨酸的共价修饰,特异性共价修饰：,修饰剂专一地修饰酶活性部位的某一氨基酸残基，使其失活,例2:,TPCK(N-对甲苯磺酰苯丙酰氯甲基酮),TPCK修饰His，使His烷基化,(2)、X-射线晶体结构分析法,X-射线晶体结构分析可以解析酶分子的三维结构，有助于了解酶活性部位氨基酸残基所处的相对位置和实际状态，以及与活性部位有关的其他基团,1965年Phillips等人解析溶菌酶的空间结构及其作用机制,通过三维结构可以看出：,活性部位有关氨基酸的排列位置,酶-底物复合物中，底物周围氨基酸的排列状况,根据被水解的糖苷键邻近氨基酸分析，确定催,化基团为Glu,35,和Asp,52,胰凝乳蛋白酶活性部位的分析,Ser,Asp,His,Ser,195,、,His,57,、,Asp,102,联在一起形成“电荷中继网”，,使得Ser,195,的羟基具有非常高的亲和性,Ile,16,是,胰凝乳,蛋白酶原转变成酶的关键,(3)、定点突变法(site-directed mutagenesis),根据蛋白质结构研究结果，采用定点突变技术改变编码蛋白质基因中的DNA序列，研究酶活性部位的必需氨基酸,如果被取代的氨基酸不影响酶的活性，则该位置的氨基酸残基不是必需基团,如果被取代的氨基酸导致酶活性降低或者丧失，则该位置的原有氨基酸残基是必需基团,V,max,不变，K,m,升高，该位置氨基酸是结合基团,V,max,降低，K,m,不变，该位置氨基酸是催化基团,酶活性完全丧失，该位置氨基酸是必需基团,1985年Gardell将羧肽酶A突变：Tyr,248,Phe,248,，,结果：,k,cat,和天然酶一样，K,m,值高出6倍,说明Tyr,248,主要参与底物的结合，与催化活性无关,1987年Craik将胰蛋白酶突变：Asp,102,Asn,102,，,导致,k,cat,低5000倍，水解酯的活性仅为天然酶的10,-4,说明对蛋白酶的催化活性是必需的,定点突变研究活性中心的实例：,二,、影响,酶催化效率的因素,(一)底,物和酶的邻近效应与定向效应,邻近效应,(approximation,proximity),指两个反应的分子，它们反应的基团需要互相靠近，才能反应,咪唑催化“对硝基苯酚乙酸酯”水解反应(非酶促反应),如果改用酶催化反应，底物结合于活性中心，活性中心,的His与底物邻近(相当于分子内反应)，反应将能高效率,发生,邻近效应的实例：,定向效应,(orientation),定义：,由于活性中心的立体结构和相关基团的诱导和,定向作用，使底物分子中参与反应的基团相互,接近，并被严格定向定位，使酶促反应具有高,效率和专一性特点,定向效应包括：,反应物的反应基团之间(双底物反应基团邻近),酶的催化基团和底物的反应基团,活性中心内的定向使反应变为分子内反应,(二)底,物的形变和诱导契合,底物的形变,(distorion),当酶遇到底物时，酶中某些基团或者离子可以使底物分子内敏感键中的某些基团的电子云密度增高或者降低，产生“电子张力”，使敏感键的一端更加敏感，底物分子发生形变,(接近于过渡态),诱导契合,(induced fit),酶与底物结合时，酶构象发生改变的同时，底物分子也发生形变，从而形成一个互相契合的酶-底物复合物，进一步转换成过渡态，大大增加酶促反应速率,酶在发挥作用前，必须与底物密切结合,酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和,相互适应，进而相互结合,酶的构象改变有利于底物结合；底物在酶的诱导下发,生变形，处于不稳定状态(过渡态)，易受催化基团进攻,过渡态的底物与酶的活性中心结构最相吻合,(三)酸碱催化(acid-base catalysis),定义：,酸碱催化是通过瞬时的向反应物提供质子或者从反,应物接受质子从而稳定过渡态，加速反应的一类催,化机制,专一的酸碱催化(狭义酸碱催化),在水溶液中通过高反应性的H,+,和,OH,-,进行的催化，即强酸强碱的催化。细胞一般处于中性pH条件下，H,+,和,OH,-,浓度很低，因此细胞环境通常不是专一的酸碱催化,总酸碱催化(广义酸碱催化),通过H,+,和OH,-,以及能够提供H,+,和OH,-,的供体进行的催化，生理条件不是强酸强碱而是近于中性的环境，因此高反应性的H,+,和,OH,-,环境不存在，因此广义的酸碱催化指的是细胞内的弱酸弱碱参与的接受H,+,和提供H,+,的催化,许多酶的活性部位存在几种参与总酸碱催化作用的功能基团，如氨基,、,羧基,、,巯基,、,酚羟基以及咪唑基，它们能在近中性的,pH,范围内作为质子受体或者供体,胰凝乳蛋白酶通过酸碱催化使肽键断裂,影响酸碱催化反应速率的因素：,酸或者碱的强度(,pK,值),质子传递速率,例：,His,的重要性,咪唑基,pK 约,为,6.0,，,在生理,pH,下,酸和碱形式共存，,可接受质子和提供质子,质子传递速率十分迅速，其半衰期小于1,0,-10,s,从,进化上推测,His,不是作为蛋白的结构成分，而是被,选择作为酶分子的催化结构而保留下来,(四)共价催化(covalent catalysis),定义：,又称亲核催化(nucleophilic catalysis)或亲电催化,(electrophilic catalysis)，在催化时，亲核催化剂或,者亲电催化剂能够分别放出电子或汲取电子并作用,于底物的缺电子中心或负电中心，迅速形成不稳定,的共价中间复合物，降低反应活化能，使反应加速,亲核催化,未成键电子对进攻缺电子中心形成共价结合，迅速形成不稳定的共价中间复合物，降低反应活化能，促使产物生成,(五)金属离子催化,需要金属,的酶,(,1/3,的酶),金属酶,(metalloenzymes)：,含紧密结合的金属离子，多属于过渡金属如,Fe,2+,、,Fe,3+,、,Cu,2+,、,Zn,2+,、,Mn,2+,、,Co,3+,金属激活的酶,(metal-activated enzymes)：,含松散结合的金属离子，通常为碱和碱土金,属离子，如Na,+,、,K,+,、,Ca,2+,、,Mg,2+,金属离子以3种主要途径参与催化过程,通过结合底物为反应定向,与底物分子形成络合键，作为金属桥参与催化,通过可逆地改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应,金属离子价键的变化，作为酶的辅助因子参与电子的转,移，如Cu,2+,、,Fe,3+,通过静电稳定或屏蔽负电荷,激酶的底物是Mg,2+,-ATP复合物,(六)活性部位微环境的影响,活性部位的疏水环境导致反应活性和反应速率的改变,非极性环境中的介电常数较水介质中要低,非极性环境中两个带电荷基团间的静电作用比在极性,环境中要显著提高,底物分子与酶的活性部位结合后，被埋没在疏水裂隙,中，增强了底物分子与催化基团之间的作用力,疏水环境大大有利于酶的催化作用,三,、,酶活性的调节,(一)别构调节(allosteric regulation),某些酶分子在活性中心外存在另一配体的结合部位(别构,部位),别构部位与配体的结合使酶活性中心构象轻微变化而影响,酶的功能,能与别构部位结合的配体称为别构效应剂，具有别构效应,的酶称为别构酶,别构效应有别构激活(正协同效应)和别构抑制(副协同效应),代谢底物经常是别构激活剂，而代谢产物往往是别构抑制剂,别构酶通常是寡聚酶,催化亚基,调节亚基,别构激活,别构酶动力学不符合米式方程,(二)酶原激活,酶原：,某些活性酶的无活性前体蛋白,酶原激活：,无活性的酶原形成活性酶的过程,酶原激活的实质：,活性中心的形成或暴露过程,酶原激活的常见形式：,切下一段多余的肽链,蛋白(酶)原,活性蛋白(酶),蛋白(酶)原,活性蛋白(酶),胃蛋白酶原,胃蛋白酶,凝血酶原,凝血酶,胰凝乳蛋白酶原,胰凝乳蛋白酶,胰岛素原,胰岛素,胰蛋白酶原,胰蛋白酶,纤维蛋白原,纤维蛋白,羧肽酶原,羧肽酶,胶原酶原,胶原酶,弹性蛋白酶原,弹性蛋白酶,胃蛋白酶原的激活,胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活,胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活,活性最高，但不稳定,40%,活性,胰蛋白酶对胰腺分泌的各种蛋白酶原的激活作用,胰蛋白酶原,弹性蛋白酶原,胰凝乳蛋白酶原,羧肽酶原,肠激酶,六肽,弹性蛋白酶,胰蛋白酶,羧肽酶,胰凝乳蛋白酶,(三)共价修饰,酶的共价修饰,酶蛋白肽链上的一些基团可与某种化学基团发生可逆的共价结合，从而改变酶的活性，这种酶活性的调节方式称为共价修饰，能进行共价修饰的酶称为共价修饰酶,共价修饰的特点：,在修饰过程中，酶的活性在无活性(或低活性)和有活性(高,活性)两种状态中改变,共价修饰的互变是由不同的酶所催化的,酶活性属于快速调节,有激素信号启动的共价修饰会引起级联放大效应,常见的共价修饰形式,磷酸化与去磷酸化(最常见形式),甲基化与去甲基化,腺苷酰化与去,腺苷酰化,尿苷酰化与去尿苷酰化,乙酰化与去乙酰化,-SH与-S-S-互变,磷酸化,腺苷酰化,尿苷酰化,ADP,-糖基化,甲基化,磷酸化与去磷酸化,磷酸化与去磷酸化,四,、,同工酶,(,isoenzyme or isozyme,),同工酶,催化相同的化学反应，但其蛋白质分子结构,、,理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶,同工酶的特点：,同工酶都是寡聚酶,同工酶存在同一种属或同一个体的不同组织或者同一细胞,的不同亚细胞结构中,同工酶是长期进化的产物,同工酶对进化,、,发育和细胞分化的研究具有重要意义,同工酶可用于疾病的诊断,乳酸脱氢酶(,lactate dehydrogenase,LDH,),是了解最清楚的同工酶,它催化乳酸脱氢生成丙酮酸,LDH是四聚体蛋白，由两种亚基M(肌,肉型)和H(心肌型)组成,LDH,1,H,4,LDH,2,H,3,M,LDH,3,H,2,M,2,LDH,4,HM,3,LDH,5,M,4,LDH存在组织特异性，因此通过血清,中LDH的浓度变化诊断疾病,乳酸脱氢酶的组织特异性,LDH同工酶的电泳行为,HHHH,(LDH,1,),HHHM,(LDH,2,),HHMM,(LDH,3,),HMMM,(LDH,4,),MMMM,(LDH,5,),H,型富含酸性氨基酸，,M,富含碱性氨基酸,LDH同工酶在疾病诊断中的应用,心脏疾病：,LDH,1,和LDH,2,上升，LDH,3,和LDH,5,下降,急性肝炎：,LDH,5,明显上升，随病情好转而逐渐恢复正常,慢性肝炎,：,一般处于正常范围，部分病例可见LDH,5,有所升高,肝硬变：,LDH,1,、,LDH,3,和LDH,5,均升高,原发性肝癌：,LDH,3,、,LDH,4,、,LDH,5,均上升，但LDH,5,LDH,4,转移性肝癌：,LDH,3,、,LDH,4,、,LDH,5,均上升，但LDH,4,LDH,5,酶学作业题,简答题：,简述酶催化反应的特点,简述酶学常数,K,m,的物理意义和特点,比较可逆抑制和不可逆抑制作用的不同点,比较竞争性和非竞争性抑制作用的不同点,简述酶活性中心的概念和特点,名词解释：,比活力，纯化倍数，回收率，酶原，同工酶,