HPV基因分型检测试剂盒常见问题优质PPT课件.ppt

,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,目 录,试验开展实验室要求,HPV,临床样本的采集方法及注意事项,临床试验操作注意事项,临床试验结果分析及常见问题,HPV,基因分型检测试验项目,试验开展实验室要求,临床基因扩增实验室设置的一般原则,各区独立,注意风向,因地制宜,方便工作,“十六字方针”,基因扩增检验实验室工作流程,进入各个工作区必须遵循严格的,单一方向顺序,!,最佳,的,HPV,基因分型实验室布局,出口,入口,工作流向,临床,样本,收集,与,储存,PCR,前区域,PCR,后区域,最佳,的,HPV,基因分型实验室布局,每间房间必须有其专用的工作服及一次性手套；,每个工作区都应有独立的一套仪器设备及耗材；,不同区域的仪器设备及耗材不能混用,;,临床样本,(,原始容器中,),样本制备区,试剂准备区,超净工作台,DNA,提取,PCR,扩增区,导流,杂交区,结果通知患者,基础,HPV,基因分型实验室布局（,1,）,临床样本,(,原始容器中,),样本制备区,超净工作台,DNA,提取,导流,杂交区,结果通知患者,PCR,区域,基础,HPV,基因分型实验室布局（,2,）,每个区域必须有其专用的工作服及一次性手套；每次操作必须更换；,涉及到公用仪器使用，必须注意防止交叉污染，定时使用次氯酸钠溶液擦洗；,实验室环境注意事项,工作区域必须始终保持清洁整齐；,所有实验台面及地面均应保持清洁；,所有实验废料及垃圾使用专用垃圾带装好后，封口处理；,在每次工作前后对工作台面进行消毒液（次氯酸溶液）擦洗、消毒酒精擦洗工作，并在完成工作后开启紫外灯进行灭菌；,实验室制度及人员配备,有效的临床结果,严格规章制度,并遵守,操作人员具有,专业技术知识,和经验,强烈责任感,工作态度,认真细心,严格遵守,HPV,基因分型,各项工作的,标准操作规程,实验所需仪器,HybirMax,医用核酸,分子快速杂交仪,PCR,扩增仪,超净工作台,水浴锅,离心机,旋涡混合仪,微量移液器,HPV,基因分型检测试验项目,HPV,临床样本的采集方法及注意事项,HPV,临床样本的采集方法及注意事项,标本收集,标本保存,标本收集,检查前告知病人注意事项：,月经正常妇女，在月经来潮后,10,18,天为最佳检查时间。,检查前,48,小时内不要作阴道冲洗，不要用避孕药膏等阴道内用药物。,检查前,48,小时最好不要行性生活。,检查前不进行醋酸或碘液涂抹。,标本收集,步骤,先脱掉裤子，然后按医生指示仰卧于一张检查床上。,步骤二,由医生以窥阴器或阴道张开器暴露宫颈。然后使用专用的,HPV,采样刷置于宫颈口采集标本。（最好在取样前先用棉签擦去宫颈分泌物）,标本收集,步骤四,慢慢取出宫颈刷，将其放入标有病人编号的取样管中，取样管内已加有专用细胞保存液，折断其刷头入管中，拧紧瓶盖。,步骤三,将专用宫颈刷置于宫颈口，轻轻搓动宫颈刷使其顺时针旋转,5,圈。,标本保存,样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室。,如若不能马上送检样本，请于,4,保存，请在,2,个星期之内进行检测。,标本收集,标准收集中注意事项：,使用凯普专用取样器及保存液，可抑制细菌生长，保持,DNA,完整性。,样本收集中为保留足够的宫颈细胞标本，注意切勿将宫颈刷头丢弃。,宫颈保存系统包装打开后，必须立即进行采样，并连同刷头置于取样管中。,如果同时进行细胞学检查，应先采细胞学样品。,宫颈刷头折断、试验取样时，请小心操作，切忌大力震荡取样管，造成试剂及样本溅出影响检测结果或造成污染。,取样管上标示的名称须与患者一一对应。,取样后，切记拧紧取样管管盖。,HPV,基因分型检测试验项目,临床试验操作注意事项,因操作欠规范导致的问题分析,移液器：,严禁大力来回拧动；,严禁调至容量之外使用；,第二档为排空档，不得作吸取之用；,吸头应浸入液面23,mm,处吸取；,严禁将有液体的移液器平放或倒置；,混匀沉淀时，将吸头紧贴于沉淀上方管壁，反复吸取液体，将沉淀反复混匀，溶解；,每周用75%乙醇清洗一次，若有污染随时清洗。,（二）实验室布局不合理引起的污染问题,1、样品处理不进行隔离，,样品中各种核酸片,段均会通过空气进行传播,。,2、,PCR,结果检测实验室和其它实验室在一,起，,会出现严重的扩增子污染,。,3、仪器设备及工作服等（尤其是加样器）公,用，,也会造成严重污染。,4、实验室操作垃圾（,吸头、离心管、样品杯 等,）乱,放，,飘散在空气中的核酸片段、病原微生物可造成实验室,污染。,（三）,PCR,操作中存在问题分析,1.,阳性变阴性,2.,阴性变阳性,3.PCR,结果不稳定,1.,阳性变阴性,(,1),有些阳性病人，经过,PCR,检测后为阴性，可能有两种情况：,一是采集标本方法或部位不正确，,二是如果病人取样部位病原体消失，需根据病人的病理情况采样。,(2),标本保存不当，可引起,PCR,失败。,收集的标本乱放（未放冰箱），病原体的破裂，检测的核酸降解，失去了,PCR,检测的模板或造成标本污染。,2.,阴性变阳性,常见的原 因有以下,5,点：,加样器通道易形成气溶胶，造成加样器通道污染，可通过使用有滤筛的吸头避免污染,（将模板,DNA,加入,PCR,系统时，注意切勿形成喷雾，后者有可能污染别的反应，所有并非即用管都应盖严）。,打开标本管盖引起样品飞溅,（打开前须瞬间离心）,操作时手套引起的交叉污染,（拿过模板,DNA,管后应更换手套）,不明原因引起公用试剂污染,（必须设置一个不含模板,DNA,但含,PCR,系统中所有其他成分的对照反应。这一对照管须在准备好所有其他,PCR,以后才进行吸加）。,实验室污染,临床试验操作注意事项,实验室建设方面,HPV,分型检测试验操作方面,DNA,提取,PCR,扩增,导流杂交,(,详见各项操作的,SOP,）,临床试验操作注意事项,实验室建设方面,一、实验室分独立房间操作,:,样本储存区（与试剂储存分开）,PCR,前区域,(,试剂贮存及准备区,样本处理区,),PCR,后区域,(PCR,扩增产物分析区,),仪器及耗材独立使用，切忌前后区域交叉！试验工作服及手套独立,二、单一工作流程,:PCR,前区域,PCR,后区域,三、实验室环境,（防止污染、保持清洁整齐、严格制定及执行各项规章）,四、试剂管理及标本管理,试剂按要求温度贮存、注意有效期，使用过的试剂拧紧归类放好；,样本清楚标记好样本号、与试剂分开贮存，使用过的样本归类放好,五、以谨慎的态度对待，并清楚记录实验結果及一些突发性问題；,临床试验操作注意事项,DNA,提取,使用移液器吸取临床样本时，避免移液枪头碰到样本管壁。所用移液枪头均为一次性用品，切忌重复使用；,防止造成样本交叉污染,防止造成试剂被污染,正确使用移液器,临床试验操作注意事项,DNA,提取,尽可能使用带有滤心的移液器枪头,防止形成气溶胶污染实,验室环境,防止样本,DNA,污染,移液器枪管,临床试验操作注意事项,DNA,提取,DNA,提取操作步骤注意事项：,加入溶液,之前,应确保溶液中没有沉淀出现,!,以免影响提取效率,.,加入临床样本时,最好在超净工作台前操作,且将用过的枪头打入到盛有,10,次氯酸钠的废液瓶中,以免样品交叉污染,影响以后的,PCR,检测,.,在煮沸样品时,切记不要让沸水溅入到样品管中,!,建议水沸腾后调低火力,.,每次去上清时,尽量去干净,特别是第,3,步骤,以免影响提取效果,.,在做,PCR,之前,最好将提取的样品离心,5,分钟,取样时尽量不要将枪尖碰到管底的沉淀。,临床试验操作注意事项,PCR,扩增,正确使用移液枪,防止造成样本交叉污染,防止造成试剂被污染,临床试验操作注意事项,PCR,扩增,尽可能使用带有滤心的长头移液器枪头,防止形成气溶胶,防止样本,DNA,交叉污染,防止样本污染试剂,临床试验操作注意事项,PCR,扩增,防止造成试剂被污染,移液枪头均为一次性用品,切忌重复使用,移液枪头尽可能为带有滤芯,每个区域必须用专用仪器、耗材。,进入不同房间必须穿专用工作服及带手套，离开时必须先脱去工作服及手套。,PCR,后操作区域房间内的所有耗材及仪器均不能与,PCR,前区域混合使用。,使用前后均以次氯酸消毒液清理。,临床试验操作注意事项,PCR,扩增,HPV 58,HPV 18,HPV 16,PCR,操作不当造成污染：,临床试验操作注意事项,导流杂交,杂交及杂交后清洗溫度（,45,C,）。,每次清洗膜后，抽液干净。,确保,PCR,产物变性成功。,遵守封阻反应温度及时间、酶标反应时间及显色反应时间，确保杂交结果背景正常。,正确使用移液器，移液枪及枪头专用。,HPV,基因分型检测试验项目,临床试验结果分析及常见问题,临床试验结果分析及常见问题,HPV,阳性正常结果,HPV,阴性正常结果,临床试验结果分析及常见问题,一、杂交结果中,IC,点不清楚，同时阳性点也不清楚或比较淡；,可能原因：,杂交温度控制不当，出现非特异性杂交点；,DNA,样本中有对,PCR,反应的抑制物质，影响了,PCR,扩增的效率；,确保,PCR,产物完全变性成单链，如有必要，在使,用前再次变性,PCR,产物。,病人样本是否取样前是否违反了取样要求？,将,DNA,样本稀释,10,倍后，重新,PCR,扩增及杂交反应可解决。,临床试验结果分析及常见问题,二、杂交结果中，在杂交膜上既无,IC,点，也没有,HPV,分型阳性点显色；,可能原因：,可能是因为,DNA,模板中存在抑制,PCR,反应的抑制物质，首先,通过抽提得到的,DNA,的纯度对,PCR,反应会有很大影响,所以必,须在做,PCR,模板的时候将其稀释从而降低,DNA,溶液中抑制剂的,浓度,使得,PCR,反应能正常进行，在一家新的医院开始试验的时,候均需要摸索本院样本自身的特点。,或者所取样本，不符合凯普,HPV,分型检测说明书中对样本的,要求，样本之前经过碘染色或者病人使用了阴道冲洗药物，均,会对,PCR,反应产生抑制。,确保,PCR,产物完全变性成单链，如有必要，在使用前再次变,性,PCR,产物。,如果这些情况的时候，建议对样本稀释,10,倍重新,PCR,，然后杂交，,结果仍然不成功的情况下，建议按照凯普说明书要求重新取样,检测。,临床试验结果分析及常见问题,402721,403022,403040,403078,稀释,1:10 DNA,模板重复,PCR,HPV 58,HPV 18,IC(+)HPV 51,弱,IC,HPV 52,临床试验结果分析及常见问题,三、杂交结果中,IC,点没有，同时阳性点淡或不清楚；,可能原因：,样本中含有抑制,PCR,反应的物质；,样本中,HPV DNA,浓度较低，同样本中,含有抑制,PCR,反应的物质；,病人样本不符合凯普分型试验要求，样本本身,为阴性结果，但因为样本中有抑制,PCR,反应的物,质，同时操作人员对杂交温度又控制不当，出,现非特异性杂交点；,建议增加用于扩增,DNA,浓度，重新,PCR,扩增及杂交反应。,临床试验结果分析及常见问题,四、,IC,点弱或者没有，但,HPV,分型阳性点显色正常,可能原因：,由于,IC,和,HPV DNA,之间存在竞争，高,浓度的,HPV DNA,可能会对,IC,点的扩增反,应产生竞争性抑制，此现象出现时如,HPV,分型点显色正常，则认为分型结果,正确。,临床试验结果分析及常见问题,六、,Biotin,（生物素）点不显色,可能原因：,请确认所使用试剂是否仍在有,效期内。尤其是酶标液及显色,液是否按要求使用及储存。,确定实验操作是否严格按照说,明书进行、且试剂是否按要求保,存使用。,临床试验结果分析及常见问题,七、阴性对照显现,HPV,分型阳性点,可能原因：,PCR,试剂可能被污染，取,5,l,PCR,扩增产物进行琼脂糖凝胶电,泳分析。,重复进行,PCR,及杂交试验,。,临床试验结果分析及常见问题,八、杂交膜有很高的背景,可能原因：,可能由于封闭不足，使未结合,的酶标残留在膜上。确保封闭液,完全覆盖整个杂交膜。,也可能因为没有完全将未结合,的试剂清洗干净，请确保在显色,过程中杂交膜充分清洗，无剩余,残留液体。,临床试验结果分析及常见问题,九、封阻液抽不动,可能原因：,仔细观察封阻液是否有絮状微,生物或澄淀，如果有则证明封阻,液有发霉迹象，是由于操作中没,有使用灭菌枪头而造成的。,重新购买封阻液，同时确保试验中使用已灭菌的移液枪头,临床试验结果分析及常见问题,十、什么时候需要做阳性及阴性对照,当一个新的医院，一个新的地方开展试验的时候，或更换试验地点的时候，需要进行阴阳性对照试验；,当使用的检测试剂批次改变的时候需要做,1,次阴阳性对照；,当杂交结果出现令人疑惑，比如多个样本的杂交结果一样，或者杂交结果出现过多的多重感染，以及杂交试验后出现许多无,IC,点及阳性杂交点的结果等情况下，需要使用同批试剂进行阴阳性对照试验以验证问题所在；,临床试验结果分析及常见问题,十一、导流杂交试验中的污染主要会出现在那一步中，应该怎样防范？,首先，污染情况主要由,PCR,操作中样本,DNA,的交叉而产生；对于此种情况，应严格按照,SOP,操作，确保,PCR,加样的试验器材均为专用，特别是移液枪和枪头。,其次，杂交结果中出现的比较弱的杂交点不是污染造成，而是杂交温度不符合要求而造成的非特异性点。对于此种情况，应在杂交操作的时候，确保杂交液的,45,条件，以及杂交仪的温度是否符合说明要求的误差范围显示。,最终结果如果出现杂交点较弱的情况,(,肉眼很难看出,),，此点可以不用判读。,临床试验结果分析及常见问题,HPV 58,HPV 18,HPV 16,PCR,操作不当造成污染：,HPV 34,弱,IC,HPV(-),电泳阳性,其他,HPV,亚型,临床试验结果分析及常见问题,十二、,HPV,杂交结果为阴性，但电泳结果为阳性,可能原因：,PCR,产物变性操作失败。,导流杂交操作失败。,电泳所检测到的,HPV DNA,不包含在凯普试剂,盒所能检测到的,21,种亚型内，此种情况较少。,临床试验结果分析及常见问题,十三、杂交后的杂交膜没有形成均一的杂交边缘，而且出现同一次杂交结果互相污染的现象。,可能原因：,在放分隔膜的时候没有放好，没有形成每个样本独立的杂交,间，所以出现了杂交膜之间的互渗、反渗以及下渗现象；,验证方法：,在进行预杂交的时候，首先要将杂交膜上的残留溶液全部抽干净，然后先将杂交液加入不相邻的几个杂交孔中，观察其他几孔杂交膜,1,2,分钟后，如果杂交膜没有出现润湿或者杂交膜表面出现水珠现象（注意杂交膜边缘），则可以继续试验。,预杂交结束后，开泵将预杂交液完全抽干，然后继续开着泵抽,1,2,分钟，关泵，等待,1,2,分钟，再加,PCR,产物及杂交液，将会减少反渗现象。,分隔室有渗漏,临床试验结果分析及常见问题,谢谢！,