食品化验员微生物检测知识培训.ppt

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念,原核微生物,微生物的分类,非细胞型,真核微生物,无细胞结构，无产生能量的酶系统，由单一核酸和蛋白质衣壳组成，必须在活细胞内增殖，病毒属于此类微生物。,细胞核的分化程度高，有核膜、核仁和染色体，能进行有丝分裂，如真菌、藻类,细胞分化程度低，只有,DNA,盘绕而成的拟核，无核仁和核膜,包括细菌、衣原体、支原体、立克次体、螺旋体和放线菌。,微生物的主要特点,“,短,”,个体微小：,0.1mm,，需借助显微镜观察,“,平,”,构造简单：单细胞，简单多细胞或非细胞,“,快,”,繁殖快速：,20,分钟一代，一天内,1,个,10,亿,“,多,”,各类多样：细菌、真菌、病毒、原生动物,“,广,”,分布广泛：土壤、空气、水和极端环境,中,细菌,细菌的群体形态,在固体培养基上（内）的群体形态,菌落,单个或少数的细胞在固体培养基上（内）会形成的以母细胞为中心的一堆肉眼可见的，有一定形态、构造特征的子细胞集合。,细菌菌落常表现为湿润、粘稠、光滑、较透明、易挑取、质地均匀以及菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致等。,单位,:CFU,任务一,:,微生物培养基,任务分析,一、检测意义,培养基是供微生物、动植物组织生长和维持用的人工配制的养料。要制作培养基，就需要了解微生物的营养物质吸收方式以及常用的培养基配制技术。,二、检测方法,GBT4789.28-2003,食品微生物学检验染色法、培养基和试剂,学习目标,知识目标,1,、微生物生长所需要的基本营养及运输方式。,2,、培养基的概念、分类及配制原则,技能目标,1,、正确进行培养基的分装和无菌检验,2,、正确配制实验室常用培养基,相关知识,一、微生物的营养,1.,微生物的细胞化学构成,微生物细胞,水（,70%-90%,）,干物质,无机物（盐）,有机物,蛋白质、多糖、脂、核酸、维生素、有机酸等及其降解产物,微生物的营养构成,微生物的营养物质按照在机体的生理作用不同可分为：,碳源、氮源、能源、无机盐、水和生长因子,微生物、动物、植物之间存在营养上的统一性,二、培养基的定义,培养基提供微生物生长繁殖和生物合成名种代谢产物所需要的、按一定比例配制的多种营养物质的混合物，提供微生物所需能量，包括碳源、氮源、无机元素、生长因子及水、氧气等,三、培养基的分类,(1),按成分分类,天然培养基 合成培养基 复合（半合成）培养基,（,2,）按物理状态分类,半固体培养基 液体培养基 固体培养基,任务二,:,消毒与灭菌技术,任务分析,一、检测意义,在进行微生物检验前，可以通过消毒和灭菌技术，不同程度的将实验物品和实验环境中的微生物减少甚至完全杀灭，从而减少或消除外来微生物对试验结果的影响，生物检测结果的真实性和准确性,二、检测方法,（,1,）加热灭菌,干热灭菌 湿热灭菌,（,2),辐射灭菌,紫外线灭菌,干热灭菌法,原理：干热灭菌是在电热干燥箱内利用高温干燥空气（,160170,）进行灭菌，它是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌目的。此法适用于玻璃器皿如移液管、试管和培养皿的灭菌。培养基、橡胶制品、塑料制品不能采用干热灭菌。,细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固越慢。,干热灭菌所需温度要高，时间长1-2h，,但干热灭菌温度不能超过,180,，否则，包器皿的报纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。,干热灭菌法,1,、将培养皿、吸管等下班器皿洗净干燥后，用旧报纸包好，或装入特制的铁筒中,2,将包装好的玻璃仪器摆入烤箱中，彼此间留有一定的空隙以便流通空气。,3,、关紧箱门，接上电源,4,、设定温度。灭菌温度一般在,160,-170,保持,1-2,个小时,5,、待自然降温冷却后才能开门取出玻璃器皿，避免由于温度突然下降引起玻璃器皿碎裂。,湿热灭菌法,高压蒸气灭菌法主要是指将物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气，待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌锅内的压力，从而使沸点增高，得到高于,100,的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。,在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。因为在湿热情况下，菌体吸收水分，使蛋白质易于凝固；同时湿热的穿透力强，可增加灭菌效力。,讨论：,干热灭菌法和湿热灭菌法哪个杀菌效力大,?,湿热灭菌法,一般培养基用,0.1MPa,，,121.5,，,1530min,可达到彻底灭菌的目的。灭菌的温度及维持时间随灭菌物品的性质和容量等具体性况而有所改变。,打开锅盖,加水,放入待灭菌的物品,密封,设定温度时间,通电,加热灭菌,断电开盖,紫外线灭菌法,紫外线灭菌是用紫外灯进行的，波长为200-300nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌能力最强，它的杀菌效率与杀菌时间是成正比的，它的原理主要是抑制了DNA的复制，另一方面，由于辐射能使空所中的氧,电离成,【,0,】，再使氧气生成臭氧或使水氧化生成过氧化氢。臭氧和过氧化氢均有杀菌的作用。紫外线的穿透力不大，所以只适用于无菌室的空气及物体及物体表面的灭菌。紫外线灯距照射物不超过,1.2m为宜。,为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外灯前；可在无菌室内喷洒石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌，无菌室内的桌面、凳子可用,2%-3%,的来苏乐擦洗，然后再打开紫外灯照射,0.5-1h,，即可增强杀菌效果，达到灭菌目的,.,任务三,:,食品中菌落总数的检验,任务分析,一、检测意义,菌落总数主要作为判别,食品被污染程度,的标志,判定细菌在食品中繁殖的动态,二、检测方法,GB 4789.2-2010,食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定,菌落总数,指食品检样经过处理，在一定条件下培养后，所得,1ml,（或,1g,）被检样品中所含细胞菌落的总数，以,CFUg(ml),。,菌落总数,并不表示实际中的所有细菌总数，也不能区分其中细菌的种类，只包括一群在计数平板琼脂中生长发育、嗜中温的需氧和兼性厌氧的细菌菌落总数，所以有时被称为,杂菌数,，,需氧菌数,等。,食品中细菌,菌落总数越多,，则食品,含有致病菌,的可能性越大，食品,质量越差,；菌落总数越小，则食品含有致病菌的可能性越小。须配合,大肠菌群和致病菌,的检验，才能对食品做出较全面的评价,。,检验程序,检 样,25g(mL)样品+225mL稀释液，均质,10倍系列稀释,选择,2,个,3,个适宜稀释度样品匀液，,各取,1mL,分别加入无菌培养皿内,每个培养皿中加入,1520mL,平板计数培养基，混匀,361,48h2h,计算各平板菌落数,计算菌落总数,报告,培养基与试剂,:,平板计数琼脂培养基,无菌生理盐水,操作前，用镊子取酒精棉消毒桌子、消毒手。,从培养皿筒中取出培养皿。,培养皿筒,取出,培养皿,在培养皿上编号,提示：培养皿上的标记为稀释倍数。,固体样品,半固体样品：稀释倍数为,10,-1,、,10,-2,、,10,-3,液体样品：稀释倍数为,10,0,、,10,-1,、,10,-2,-1,-1,-2,-2,-3,-3,空白,空白,0,0,-1,-1,-2,-2,空白,空白,固体,半固体样品称量,用镊子取酒精棉擦手，点燃酒精灯；,取,25g(ml),样品加入,225ml,生理盐水中（对样品进行,10,倍稀释）,25g+225mL,生理盐水,10,-1,-1,-1,-2,-2,-3,-3,空白,空白,10,-2,10,-3,灭菌生理盐水,固体,半固体样品,1mL,1mL,1mL,1mL,1mL,在培养皿中加入平板计数琼脂培养基（,1520mL,），轻摇培养皿，使试样与培养基混匀。,提示：,倒培养基时，培养皿的开口尽量要小；同时，开口对着酒精灯。,提示：,摇动培养皿时，切勿使培养基溅到培养皿盖上。,待培养基凝固后，将培养皿放入恒温培养箱。,提示：培养皿放入培养箱时要倒置。,注意选择设置为,361,的培养箱,。,任务四,:,食品中大肠菌群的检验,任务分析,一、检测意义,大肠菌群是作为粪便污染的,判定指标,大肠菌群是评价食品卫生质量的重要指标之一,二、检测方法,GB 4789.3-2010,食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定,大肠菌群系指一群在,32,37,下,24hr,内，能发酵乳糖产酸、产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌群主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标，来评价食品卫生质量，具有广泛的卫生学,意义。,大肠菌群的检测,第一法,大肠菌群,MPN,计数法,第二法,大肠菌群平板计数法,第一法：大肠菌群,MPN,计数法,培养基与试剂,:,月桂基硫酸盐胰蛋白胨（,Lauryl Sulfate,Tryptose,，,LST,）肉汤,煌绿乳糖胆盐（,Brilliant Green,Lactose Bile,，,BGLB,）肉汤,无菌生理盐水,无菌,1 mol/L NaOH,无菌,1 mol/L HCl,初发酵试验,每个样品，选择,3,个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种,3,管月桂基硫酸盐胰蛋白胨（,LST,）肉汤，每管接种,1mL,（如接种量超过,1 mL,，则用双料,LST,肉汤），,361,培养,24 h2 h,，观察倒管内是否有气泡产生，,24 h2 h,产气者进行复发酵试验，如未产气则继续培养至,48 h2 h,，产气者进行复发酵试验。未产气者为大肠菌群阴性。,LST,判定结果,大肠菌群的产气量，多者可以使发酵倒管全部充满气体，少者可以产生比小米粒还小的气泡。如果对产酸但未产气的乳糖发酵如有疑问时，可以用手轻轻打动试管。,复发酵试验,用接种环从产气的,LST,肉汤管中分别取培养物,1,环，移种于煌绿乳糖胆盐肉汤（,BGLB,）管中，,36 1,培养,48 h2 h,，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。,大肠菌群最可能数（,MPN,）的报告,确证的大肠菌群,LST,阳性管数，检索,MPN,表（见附录,B,），报告每,g,（,mL,）样品中大肠菌群的,MPN,值,第二法：大肠菌群平板计数法,实验步骤及操作要点：,1,）样品的稀释,：如第一法,2,）平板计数,选取,2,个,3,个适宜的连续稀释度,每个稀释度接种,2,个无菌平皿，每皿,1 mL,。同时取,1 mL,生理盐水加入无菌平皿作空白对照。,3,）及时将,15 mL,20 mL,冷至,46,的结晶紫中性红胆盐琼脂（,VRBA,）约倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后，再加,3 mL,4 mLVRBA,覆盖平板表层。翻转平板，置于,36 1,培养,18 h,24 h,。,4),平板菌落数的选择,选取菌落数在,15 CFU,150 CFU,之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落。,典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落直径为,0.5 mm,或更大。,5,）证实试验,从,VRBA,平板上挑取,10,个不同类型的典型和可疑菌落，分别移种于,BGLB,肉汤管内，,36 1,培养,24 h,48 h,，观察产气情况。凡,BGLB,肉汤管产气，即可报告为大肠菌群阳性。,6,）大肠菌群平板计数的报告,经最后证实为大肠菌群阳性的试管比例乘以,4,）中计数的平板菌落数，再乘以稀释倍数，即为每,g,（,mL,）样品中大肠菌群数。,例：,10,-4,样品稀释液,1 mL,，在,VRBA,平板上有,100,个典型和可疑菌落，挑取其中,10,个接种,BGLB,肉汤管，证实有,6,个阳性管，则该样品的大肠菌群数为：,1006/1010,4,/g,（,mL,）,=6.010,5,CFU/g,（,mL,）。,