生物技术制药全套资料培训课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,2、生物技术制药学：是一门阐明生物药物的研制原理、生产工艺及其分离纯化技术的应用学科。,现代生物技术制药学是医学、药学、生物学、化学、工程学与现代生物技术等相结合而形成的综合学科。,现代生物技术包括：基因工程，细胞工程，酶工程，发酵工程，生化分离工程。,3、生物药物：是指以生物资源为原料或以生物技术为手段开发生产的用作疾病的预防、诊断和治疗的医药品。,4、生物新技术药物：是指采用基因工程技术、细胞工程技术、抗体工程技术以及其他生物新技术开发生产的重组蛋白质类、抗体类和核酸类药物。,二、生物技术制药的研究内容和涉及的技术领域,1、发酵工程制药 是指利用微生物的代谢过程生产药物的技术。,利用发酵工程生产的药物有：抗生素、维生素、氨基酸、核酸、有机酸、蛋白质和肽类、酶类、激素类和免疫调节剂类等。,主要研究微生物优良菌种的选育、发酵工艺优化和产品的分离纯化等问题。,2、基因工程制药 是指利用重组DNA技术改造生物物种的遗传物质结构，借助重组生物细胞以生产药物或预防、治疗疾病的综合技术。,主要研究相应目的基因的分离、鉴定和克隆，基因重组载体的构建与导入，目的产物的表达及其分离纯化等问题。,3、细胞工程制药 在细胞和细胞器水平上对生物的遗传物质改造的基础上，利用动、植物细胞的大规模培养来生产药物的技术。,可生产天然动、植物药物，疫苗，人类生理活性因子等重组DNA产品。,主要研究动、植物细胞高产株系的选育、培养条件的优化、新型生物反应器的设计和应用以及产物的分离纯化等问题。,4、酶工程制药 是指利用游离或固定化的酶为催化剂生产药物的技术。,作用：除能全程合成药物分子外，还能用于药物分子的转化。,特点：生产工艺结构紧凑、专一性强，目的产物产量高、容易回收，酶可重复利用等特点。,任务：主要研究酶的来源，酶的分离制备，酶的固定化，酶反应器及相应操作条件的优化等。,5、生化工程制药 是指利用生化分离技术从生物反应液或天然生物资源中提取分离制备药物的技术。,主要研究药用生物资源的选择，药用成分的种类、含量及其分布，药物的结构、性质及其提取纯化工艺的优化。,作业：,1、名词解释,生物技术制药，生物药物，生物新技术药物,2、生物技术制药涉及的技术领域,第二节 生物药物的性质与分类,一、生物药物的性质,1、药理学特性,（1）治疗的针对性强，疗效可靠。,治疗的生理、生化机制合理，如胰岛素治疗糖尿病。,（2）药理活性高。,是从大量原料中精制出的高活性物质。,（3）毒副作用小，营养价值高。,主要有蛋白质、核酸、糖类和脂类等。,（4）生理副作用常有发生。,生物间存在种属和个体差异，不同生物中活性物质结构有很大差异，常出现免疫反应、过敏反应。,2、在生产、制备中的特性,（1）有效物质含量低，杂质种类多且含量高。,如：胰腺中胰岛素的含量仅为0.002%，生长激素抑制素（Somatostatin）在十万只羊的下丘脑中仅含有1mg。,（2）稳定性差，易变性、易失活。,生物药物以其严格的空间构象来维持其生物活性功能，具有特定的活性部位，一旦遭到破坏，就失去其药理作用。,（3）易腐败。,均为营养价值高的物质，极易染菌、腐败，从而造成有效物质被破坏、失去活性。,（4）对环境条件敏感，生产条件的变化对产品质量的影响较大。,（5）相对分子量较大（几千至几百万），组成分复杂，常以多组分存在，大多是复杂蛋白质的混合物。,（6）用量少，价值高。,（7）注射用药有特殊要求。,生物药物易被肠道中的酶所分解，给药途径主要是注射用药。对药品制剂的均一性、安全性、稳定性、有效性等都有严格要求。,3、检验上的特殊性,由于生物药物具有特殊的生理功能，因此生物药物不仅要有理化检验指标，更要有生物活性检验指标，这是生物药物生产开发的关键。,二、生物药物的质量保证,许多生物药物（细胞因子药物）都参与人体机能的精细调节，任何性质或数量上的偏差，都可能贻误病情甚至造成严重危害，因此必须进行严格的质量控制。,生物药物的质量控制包括以下几项要点：产品的,结构和性质鉴别，纯度、活性、安全性、稳定性和抑制性检验,或试验。,任何单一的分析方法都无法满足对该类产品的检测要求，需综合化学、生物化学、免疫学、微生物学、细胞生物学和分子生物学等多门学科的相关理论和技术。,1、鉴定方法,（1）化学方法：生物药物结构、性质和纯度的鉴别常采用化学方法，包括元素分析、红外、紫外、核磁共振和质谱等方法。,（2）生化和生物学方法,欲确定生物大分子的分子质量、特定的空间立体结构和特定的生理功能还需要结合生化和生物学方法加以确定。包括电泳方法、受体结合试验、免疫学分析方法等。,2、安全性评价,通过动物试验来鉴定其安全性。,（1）一般安全性要求：无菌、无病毒、无热原、无致敏原等。,（2）药代动力学和毒理学研究。,（3）致突变、致癌和致畸等遗传毒理性质的考察。,三、生物药物的分类,可按其原料来源、或按其生理功能和临床用途、或按其生物化学性质来分类。通常按其生物化学性质来分类。,（一）按所采用的技术手段来分,1、生物技术药物,指采用DNA重组技术、蛋白质工程技术、单克隆抗体技术等现代生物技术研制的重组蛋白质类、抗体类和核酸类药物。,（1）重组蛋白质类,细胞因子类：包括干扰素（INF）类、白细胞介素(IL)类、集落刺激因子(CSF)类、生长因子(GF)类、肿瘤坏死因子（TNF）类。,激素类：生长激素、胰岛素等。,治疗心脑血管病的活性蛋白质类：包括溶解血栓类、血凝因子类。,治疗和营养神经的活性蛋白质类：包括神经生长因子、神经营养因子、神经营养素等。,可溶性细胞因子受体类：包括IL1受体、IL4受体、TNF受体等。,导向毒素类：包括IL2导向毒素、IL4导向毒素、单克隆抗体导向毒素等。,（2）抗体药物,由分化的B淋巴细胞产生的能与抗原特异性结合的免疫球蛋白。,（3）核酸药物（基因药物）,分为反义核酸、核酶、脱氧核酶、抗基因寡核苷酸和基因疫苗与基因药物。,多用于有害基因的诊断与治疗，阻断有害基因的表达。,2、天然生化药物,采用生化分离技术直接从动物、植物、微生物和海洋生物中分离提取制备的天然药物。,3、微生物药物,利用微生物发酵工程技术生产的药物。,4、合成与部分合成的生物药物,根据天然药物的结构，采用化学合成技术开发生产的药物。,（二）按功能和用途来分,1、治疗药物,用于疾病的治疗（疑难病、多发病），如糖尿病、免疫缺陷病、心脑血管病、肿瘤等。,2、预防药物,用于传染病的预防，包括各种疫苗、菌苗和类毒素等。,3、诊断药物,用于疾病的临床诊断。包括免疫诊断试剂、酶诊断试剂、抗体诊断试剂、基因诊断药物和放射性诊断药物等。,（三）按药物的化学本质和生物化学性质来分类,1、氨基酸及其衍生物类,谷氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、N-乙酰半胱氨酸、L-二羟基苯丙氨酸等20多种氨基酸及其衍生物，全世界总产量达数百万吨。,2、有机酸类,乙酸、乳酸、苹果酸、衣康酸、柠檬酸、葡萄糖酸、2-酮葡萄糖酸、D-异抗坏血酸、丙酮酸等。,3、酮醇类,乙醇、丙醇、丁醇、甘油等。,4、维生素类,维生素B,2,、维生素B,12,、-胡萝卜素、维生素C和维生素D的前体麦角醇等。,5、酶及辅酶类,（1）酶类药物,消化酶类：胰酶、胃蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等。,消炎酶类：溶菌酶、胰蛋白酶、无花果蛋白酶、菠萝蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶等。,心血管疾病治疗酶：弹性蛋白酶、激肽释放酶（扩张血管、降血压）、尿激酶、纤溶酶、溶栓酶等。,抗肿瘤酶：L-天冬氨酸酶（治疗淋巴瘤和白血病）、谷氨酰胺酶、蛋氨酸酶、组氨酸酶等。,其他酶类,SOD：清除自由基、抗衰老，治疗类风湿关节炎和放射病。,PEG-腺苷脱氨酶：治疗联合免疫缺陷症。,RNA酶：用于抗RNA病毒。,青霉素酶：治疗青霉素过敏。,（2）辅酶类,NAD，NADP（辅酶），FMN（黄素单核苷酸），FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸），辅酶Q,10,，辅酶A等。,6、脂类,（1）磷脂类：卵磷脂、脑磷脂，用于治疗肝病、冠心病和神经衰弱。,（2）多价不饱和脂肪酸（PUFA）和前列腺素（PGI,2,）,PUFA：有亚油酸、亚麻酸、花生四烯酸，用于降血脂、降血压和抗脂肪肝。,PGI,2,：抗血栓、抗动脉粥样硬化。,（3）胆酸类：去氧胆酸（治疗胆囊炎），鹅去氧胆酸（溶胆结石、降低血胆固醇）。,（4）固醇类：胆固醇（用于生产人工牛黄），麦角固醇，-谷固醇（降低血胆固醇）,（5）卟啉类：血红素，胆红素等（用于治疗肝炎和肿瘤的诊断）,7、多肽和蛋白质类,该类药物多是人体内的生理活性因子，包括激素、免疫调节剂和细胞生长因子等。该类药物分子量不同、性质差异较大。目前已用于临床的有19种，即将上市的有20多种。,（1）蛋白质类：有血清白蛋白、丙种球蛋白和胰岛素等。,（2）多肽类：有激素和免疫调节剂等。,（3）细胞生长因子类：动物细胞分泌的具有多种生物活性的因子，对人类和动物细胞的生长与分化有重要调节作用。,有干扰素（IFN）、白细胞介素（IL）、肿瘤坏死因子（TNF）、集落刺激因子（CSF）等四大类系列数十种细胞因子。,如白细胞介素-,2,（IL-,2,）用于治疗肾细胞癌，即将上市的有IL-,3,、IL-,6,等。,-2a干扰素、-2b干扰素用于治疗毛细胞性白血病，即将上市的有-干扰素N,3,、-1b干扰素、-干扰素和-1b干扰素等。,8、核酸类及其降解物和衍生物类,（1）核酸类：从牛、猪的肝脏中提取的RNA用于肝癌、肝硬化的治疗。免疫RNA（iRNA）用于肿瘤的免疫治疗。,（2）多聚核苷酸：聚肌苷酸和巯基聚胞苷酸用于抗病毒、抗肿瘤。,（3）核苷、核苷酸及其衍生物：ATP、CTP、cAMP、CDP-胆碱等，可将它们经化学修饰后用于治疗肿瘤和抗病毒。,9、糖类,活性多糖有抗凝血、降血脂、抗病毒、抗肿瘤、增强免疫功能、升高白细胞和抗炎等作用。,有银耳多糖、灵芝多糖、茯苓多糖、香菇多糖、肝素、透明质酸、壳聚糖、刺参多糖等。,10、生物制品类,指从微生物、原虫、动物或人体材料直接制备或用现代生物技术、化学方法制成的作为预防、治疗和诊断特定传染病或其他疾病的制剂。,生物制品用于各种传染病的诊断、预防和治疗，包括各种疫苗、菌苗和类毒素。,作业：,1、阐述生物药物的特性。,2、阐述生物药物的质量保证措施。,第二章 基因工程制药,第一节 基因工程制药概述,一、基因工程的概念,基因工程（Gene engineering）又称DNA重组技术（DNA recombination technology）：是指按人的意志，将某一生物体（供体）的遗传信息（目的基因）在体外经人工与载体DNA重组，构成重组DNA，然后转入到另一生物体（受体）细胞中，使被引入的外源DNA片段（目的基因）在受体细胞内得以表达和遗传。,基因工程是能人工定向改造生物遗传性状的育种新技术。,二、基因工程技术的优点,1、它能从极其复杂的各种生物细胞内获得所需的,目的基因，,并将此目的基因在体外进行剪切、拼接、重组，并转入到受体细胞中，,从而合成出人们所需的新产物。,2、它能使带有各种各样遗传信息的DNA 片段越过不同生物物种间特异的细胞壁而转入到完全不同的生物体内，定向地控制、修饰和改变受体的遗传和变异，从而,创造出自然界所未有的具有新的遗传性状的生物新种，,并增产出数百数千倍人们所需的生物新药。,三、在生物技术体系中的作用,基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程和生化工程是组成生物技术的主体，它们是相互依赖、相辅相成的。,在这些技术体系中基因工程起着主导作用，,因为只有用基因工程改造过的生物细胞，才能赋予其他技术以新的生命力。,生物药物1997年在国际市场销售额有260亿美元，有50多种投放市场，正在临床试验的有200多种，其中有100多种很快上市。,第二节 基因工程常用的工具酶和克隆载体,一、基因工程制药中常用的工具酶,基因工程的重要特点之一是在体外实行DNA分子的切割和重新连接。,例如：要获得所需药物的目的基因并要将此特定目的基因与载体DNA连接在一起，在很大程度上依赖于某些工具酶。因此，基因工程要得以实施，首先要为体外操作DNA分子提供一系列的工具酶。,其中最重要的是能接一定的核苷酸序列切断DNA分子的限制酶，并能把两种DNA片段连接起来的DNA连接酶。,随着越来越多的酶分子被人们发现，这类工具酶的数量和用途不断增加，许多厂商已能生产并广泛供应各种优质工具酶，这不仅大大简化了分子克隆的操作，而且拓宽了基因工程的研究领域。,（一）限制酶（Restriction enzymes）,限制性核酸内切酶，是一类专一性很强的核酸内切酶，专一地识别和作用于DNA分子上特定的核苷酸序列，切断DNA双链。,对DNA分子上特定核苷酸序列和碱基作用的专一性，以及对磷酸二酯键断裂方式上的特殊性。,1、限制酶的种类,（1）型酶：早期提取的酶类，是一类复杂的多功能酶，在基因工程上应用价值不大。,（2）型酶：相对分子量较小，2万10万，是简单的单功能酶，作用时无需辅助因子或只需Mg,2+,。,特点：能识别双链DNA上特异的核苷酸序列，底物作用的专一性强，而且其识别序列与切断序列相一致。,自20世纪70年代以来，从几乎所有细菌的属、种中都发现至少一种型限制酶，同一品系的菌株中也常有识别不同序列的两种酶。至今已发现和分离成功的型酶大约有500种，其中有些已商品化。,2、限制酶的命名,是以寄主微生物属名的第一个字母（大写）和种名的前两个字母（小写）写成斜体字的3个字母的缩写，菌株名的第一个字母以非斜体加在这三个字母的后面。若同一菌株里有几种不同的限制酶时，则以罗马数字加以区分。,例：,Hin,d限制酶是从流感嗜血杆菌菌株,H,aemophilus,in,fluenzae,d,中分离出来的第三种限制酶。,Eco,R,表示从大肠埃氏菌菌株RYB中分离出来的第一种限制酶。,属名 种名 菌株名,H,aemophilus,in,fluenzae,嗜血流感杆菌株,d,H i n,d III,同一菌株中分离出的第三个限制性核酸内切酶,3、限制酶的特性,（1）不同限制酶能专一地识别不同的特异核苷酸序列（核苷酸序列不同，序列大小不同）,Eco,R：5-GAATTC-3,Hae,:5-(A/T)GGCC(A/T)-3,Asu,:5-GGNCC-3,Eco,R：5-CC(A/T)GG-3,Mbo,：5-GATC-3,（2）各种限制酶的识别序列都具有回文结构,限制酶所识别序列的两条核苷酸链中的碱基排列次序是完全相同的，即正读与反读都相同，这种结构称回文结构（Palidromic structure）。,例：,Bam,H的识别序列：,5-GGATCC-3,3-CCTAGG-5,Eco,R,的识别序列：,(Eco,R,的切割位点),5-G C T,G A A T T C,G A G-3,3-C G A,C T T A A G,C T C-5,(Eco,R,的切割位点),（3）各种限制酶的切割类型是各式各样的，切后形成各种粘性或平整末端。,一种是限制酶错位切断DNA双链而形成彼此互补的单链末端，称粘性末端（Cohesive ends）,如限制酶,Eco,R（大多限制酶都是这种切割方式）：,5-GAATTC-3 5-G AATTC-3,3-CTTAAG-5 3-CTTAA G-5,这种具有粘性末端的DNA片段很容易通过单链区的碱基配对而连接在一起，产生线状或环状DNA分子。,Eco,R,产生的5粘性末端,5-G,-,C,-,T,-,G,-,A,-,A,-,T,-,T,-,C,-,G,-,A,-,G-3,3-C,-,G,-,A,-,C,-,T,-,T,-,A,-,A,-,G,-,C,-,T,-,C-5,Eco,R I 37,5-G,-,C,-,T,-,G,-,OH,P,-,A,-,A,-,T,-,T,-,C,-,G,-,A,-,G,-,3,3-C,-,G,-,A,-,C,-,T,-,T,-,A,-,A,-,P,OH,-,G,-,C,-,T,-,C,-5,Pst,产生的3粘性末端,5-G,-,C,-,T,-,C,-,T,-,G,-,C,-,A,-,G,-,G,-,A,-,G-3,3-C,-,G,-,A,-,G,-,A,-,C,-,G,-,T,-,C,-,C,-,T,-,C-5,Pst,37,5-G,-,C,-,T,-,C,-,T,-,G,-,C,-,A,-,OH,P,-,G,-,G,-,A,-,G-3,3-C,-,G,-,A,-,G,-,P,OH,-,A,-,C,-,G,-,T,-,C,-,C,-,T,-,C,-,5,另一种是限制酶在同一位点平齐切断DNA两条链而形成的双链末端，称为平整末端（Flush ends）。,如限制酶,Alu,：,5-AGCT-3 5-AG CT-3,3-TCGA-5 3-TC GA-5,Pvu,II 产生的平整末端,5-,G,-,C,-,T,-,C,-,A,-,G,-,C,-,T,-,G,-,G,-,A,-,G-3,3-C,-,G,-,A,-,G,-,T,-,C,-,G,-,A,-,C,-,C,-,T,-,C-5,Pvu,II 37,5-G,-,C,-,T,-,C,-,A,-,G,-,OH,P,-,C,-,T,-,G,-,G,-,A,-,G-3,3-C,-,G,-,A,-,G,-,T,-,C,-,P,OH,-,G,-,A,-,C,-,C,-,T,-,C-5,根据限制酶的识别序列和切点位置，还可以发现下面两种情况：,识别序列不同的限制酶，切割后有可能产生相同的粘性末端：,Bam,H:5-GGATCC-3 5-G 5-GATCC-3,3-C CTAGG-5 3-CCTAG-5 G-5,Bgl,：5-AGATC T-3 5-A 5-GATCT-3,3-T CTAGA-5 3-TCTAG-5 A-5,Mbo,：5-GATC-3 5-GATC-3,3-CTAG-5 3-CTAG-5,以上三种限制酶识别不同的核苷酸序列，但切割后产生相同的5-GATC粘性末端。像这样一类限制酶称同切口限制酶或同裂酶。,这类酶的DNA酶解片段都可在体外互相重组，在DNA连接酶作用下，可以得到嵌合的重组DNA，称为异源二聚体。这种二聚体不再能被原来的两种限制酶所识别，有利于得到大量重组DNA分子。,来源不同的限制酶其识别序列相同，但由于其切点位置不同，因而产生的切割末端不同。,例：,Xmz,:5-CCCGGG-3 5-C 5-CCGGG-3,3-GGGCCC-5 3-GGGCC C-5,Sma,:5-CCCGGG-3 5-CCC-3 5-GGG-3,3-GGGCCC-5 3-GGG-5 3-CCC-5,（4）在标准条件下，每种限制酶都有严格的识别序列。,某些限制酶在非标准反应条件下，可能导致酶的识别序列特异性发生改变，会严重干扰限制酶在DNA重组中的正常应用。因此，所有限制酶反应都应在标准条件下进行。特别要控制pH值、离子强度、二价离子浓度等反应条件。,在甘油浓度、离子强度、pH值、有机溶剂、二价阳离子浓度、酶与DNA的比例等参数单独或同时发生改变的非标准条件下，会导致限制酶识别序列的特异性发生改变，在DNA内产生附加切割，称限制酶的第2活性或星活性。,产生第2活性的酶常在酶名称的右上角加星号“*”。,例：,Eco,R:5-GAATTC-3,Eco,R*:5-,AATT,-3,（二）DNA连接酶,能将两段DNA拼接起来的酶叫DNA连接酶。,这类酶的发现和分离纯化，使两个DNA片段在体外连接形成重组DNA分子成为可能。,DNA连接酶的作用,催化DNA 5磷酸和3羟基之间形成磷酸二脂键,5 G,-,C,-,T,-,C,-,T,-,G,-,C,-,A,-,G,-,G,-,A,-,G 3,3,C,-,G,-,A,-,G,-,A,-,C,-,G,-,T,-,C,-,C,-,T,-,C 5,5,G,-,C,-,T,-,C,-,T,-,G,-,C,-,A G,-,G,-,A,-,G 3,3 C,-,G,-,A,-,G,A,-,C,-,G,-,T,-,C,-,C,-,T,-C,5,OH,P,nick,P,OH,nick,DNA连接酶,1、T,4,噬菌体DNA连接酶,来源于T,4,噬菌体感染的大肠杆菌，分子量68000u，催化DNA 5磷酸和3羟基之间形成磷酸二脂键。,（1）连接带有匹配粘性末端的双链DNA分子，也可连接带切口的DNA。在PEG低浓度下可促进DNA分子间的连接。,（2）连接平整末端的双链DNA分子，反应速率要比上述粘性末端连接慢得多。,但在单价阳离子和低浓度PEG存在的条件下可大大提高平整末端连接的速率。,T,4,-DNA连接酶催化,粘性末端的连接,5-G,-,C,-,T,-,G,-,A,-,A,-,T,-,T,-,C,-,G,-,A,-,G-3,3-C,-,G,-,A,-,C,-,T,-,T,-,A,-,A,-,G,-,C,-,T,-,C-5,T,4,-DNA连接酶,5-G,-,C,-,T,-,G,-,OH,P,-,A,-,A,-,T,-,T,-,C,-,G,-,A,-,G,-,3,3-C,-,G,-,A,-,C,-,T,-,T,-,A,-,A,-,P,OH,-,G,-,C,-,T,-,C,-5,T,4,-DNA连接酶催化,平整末端的连接,5-,G,-,C,-,T,-,C,-,A,-,G,-,C,-,T,-,G,-,G,-,A,-,G-3,3-C,-,G,-,A,-,G,-,T,-,C,-,G,-,A,-,C,-,C,-,T,-,C-5,T,4,-DNA连接酶,5-G,-,C,-,T,-,C,-,A,-,G,-,OH,P,-,C,-,T,-,G,-,G,-,A,-,G-3,3-C,-,G,-,A,-,G,-,T,-,C,-,P,OH,-,G,-,A,-,C,-,C,-,T,-,C-5,PEG,2、大肠杆菌DNA连接酶,大肠杆菌DNA连接酶可催化互相匹配的粘性末端的5突出端与3 末端的双链DNA之间形成磷酸二酯键，但需NAD作辅助因子。,该酶一般不能催化平整末端双链DNA间的连接，但在PEG或Ficoll(聚蔗糖)存在下也能催化平整末端连接。,（三）DNA聚合酶（DNA polymerase）,是能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤的一类酶。在基因工程操作中用于DNA的体外合成反应。,这类酶作用时大多需要DNA模板并优先作用于DNA模板，也可作用于RNA模板，但效率较低。,另有一种聚合酶，即反转录酶，是依赖于RNA的DNA聚合酶，可优先拷贝RNA。,1、大肠杆菌DNA聚合酶,分子量109000u，由一条多肽链组成，约有1000个氨基酸，酶分子中含有一个双硫键和一个巯基，还含锌离子，基本是一个椭圆形的结构，是一种多功能酶。,（1）该酶具有三种活力：,53聚合酶活力：底物为单链DNA模板及带3羟基的DNA引物，聚合脱氧核苷酸，使之逐个接到引物上。,53外切酶活力：底物是双链DNA或RNADNA的杂交体，从5端降解DNA或RNA。,35外切核酸酶活力：底物是带有3羟基端的双链DNA或单链DNA，从3羟基端逐个切除核苷酸降解DNA。,5GATTCGTAACGGTA-,OH,-3,3CTAAGCATTGCCAT5,大肠杆菌DNA聚合酶,的作用,53,的,DNA,聚合酶活性,3 G,-,C,-,T,-,C,-,A,-,G,-,C,-,T,-,G,-,G,-,A,-,G,-,A 5,5 C,-,G,-,A,-,G,-,T,-,OH,DNA聚合酶,5 ppp dN Mg,2+,3 G,-,C,-,T,-,C,-,A,-,G,-,C,-,T,-,G,-,G,-,A,-,G,-,A 5,5,C,-,G,-,A,-,G,-,T,-,C,-,G,-,A,-,C,-,C,-,OH,（2）该酶主要用途是采用切口平移法，以放射性脱氧核苷酸置换原来的dNTP标记DNA，从而制作DNA探针。此外，用于修补DNA缺损部位的空隙。,5-GATT-3 5-CGTAACGCCA-3,3-CTAAGCATTGAGCATTGCGGT-5,5-GATT,CGTAACTCG,-35-CA-3,3-CTAAGCATTGAGCATTGCGGT-5,2、大肠杆菌DNA聚合酶,大片段（Klenow）,Klenow酶：,大肠杆菌,DNA,聚合酶,经枯草杆菌蛋白酶处理，,获得,N,端三分之二的大肽段，即为,Klenow酶。,Klenow酶仍拥有,53,的,DNA,聚合酶活性和,35,的核酸外切酶活性，但失去了,53,的核酸外切酶活性。,Klenow酶的基本作用：,补平由核酸内切酶产生的5粘性末端,DNA,片段的同位素末端标记,cDNA第二链的合成,双脱氧末端终止法测定,DNA,序列,Klenow酶的作用一,补平由核酸内切酶产生的5粘性末端,5 G-C-T-G-,OH,P,-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-,P,OH,-G,-,C-T-C 5,Klenow,dATP dTTP,5 G-C-T-G,-A-A-T-T-,OH,P,-A-A-T-T-C-G-A-G,3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-,P,OH-,T-T-A-A,-G-C-T-C,5,Klenow酶的作用二,DNA,片段的同位素末端标记,5 G-C-T-G-,OH,P,-A-A-T-T-C-G-A-G 3,3 C-G-A-C-T-T-A-A-,P,OH,-G-C-T-C,5,Klenow,a,-,32,P-pp,p,dN,5,G-C-T-G,-A-A-T-T-,OH,P,-A-A-T-T-C-G-A-G,3,3,C-G-A-C-T-T-A-A-,P,OH-,T-T-A-A-,G-C-T-C 5,3、Taq DNA聚合酶,是从极度嗜热的水生栖热菌（Thermas aquaticus）中分离纯化而来的，是一种耐热的聚合酶，分子量6500u。目前生产并出售的是Ampli Taq,TM,DNA聚合酶。,该酶具有53聚合酶活力和依赖于聚合作用的53外切酶活力。该酶最佳作用温度7580，为避免引物在模板上解离，往往要在低于最适温度条件下起始聚合反应。,该酶可用于对DNA进行测序，但主要用于PCR（聚合酶链式反应），对DNA分子的特定序列（目的基因）进行体外扩增。,4、T,4,噬菌体DNA聚合酶,来源于T,4,噬菌体感染的大肠杆菌，具有53聚合酶活力和35外切酶活力。,作用：,补平和标记限制酶消化DNA后产生的3凹端。,5-G-3 5-G,GATC,-3,3-CCTAG-5 3-CCTAG-5,对带有3突出端的DNA分子进行末端标记。,标记用作探针的DNA片段。,将双链DNA末端转化成平端。,T4-DNA聚合酶的作用一,切平由核酸内切酶产生的3,粘性末端,5 G-C-T,-C-T-G-C-A-,OH,P,-G-,G-A-G,3,3,C-G-A,-G-,P,HO,-A-C-G-T-C-,C-T-C,5,T4-DNA聚合酶,5,G-C-T,-,C,-,OH,P,-G-,G-A-G 3,3,C-G-A,-G-,P,HO,-C-,C-T-C,5,T4-DNA聚合酶的作用二,DNA,片段的同位素末端标记,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,T4-DNA pol,5 G-C-T-C A-G-C-T-G-,OH,HO,-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,T4-DNA pol,Mg,2+,a,-,32,P-dNTP,5,G-C-T-C-A-G-C-T-G-,G-A-G-T 3,3,C-G-A-G,-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,5,、经修饰的T,7,噬菌体DNA聚合酶（测序酶）,来源于T,7,噬菌体感染的大肠杆菌，具有较强的持续的53聚合酶活力和35外切酶活力。它所催化合成的DNA平均长度要比其他DNA聚合酶大得多，可用于长段模板上引物的延伸反应。,经化学修饰的T,7,噬菌体DNA聚合酶商品名为测序酶，去除了35外切酶活力，保持了53聚合酶活力，它的持续合成能力很强。主要用于Sanger双脱氧末端终止法对长段DNA分子的测序。现又用基因工程手段生产出一种改进的测序酶2.0版，完全丧失了外切酶活力。,6、反转录酶,该酶为依赖于RNA的DNA聚合酶，来源于鼠或禽反转录病毒。,该酶主要以mRNA为模板转录合成互补双链cDNA，也可用于制备杂交用探针和标记带5突出端的DNA片段。,反转录酶的作用一,以mRNA为模板反转录合成cDNA链,3,AAAAAAAAAAAAAA,5,mRNA,5,TTTTTTTTTTTT,oligo(dT),12-18,反转录酶,Mg,2+,dNTP,3,AAAAAAAAAAAAAA,5,mRNA,5,TTTTTTTTTTTT,3,cDNA,反转录酶的作用二,双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链,3 RNA,5 DNA,3,5,反转录酶,3 RNA,5 DNA,3,5,反转录酶,5 DNA,3,（四）核酸酶,1、单链核酸外切酶：核酸外切酶VII（ExoVII）,核酸外切酶VII双向外切DNA单链,5,3,5,3,ExoVII,5,5,3,3,2、双链核酸外切酶：核酸外切酶 III（ExoIII）,核酸外切酶 III 特异性地从3 端外切双链DNA,5,3,3,5,ExoIII,Mg,2+,5,5,3,3,3、双链核酸外切酶：,l,核酸外切酶（,l,Exo）,l,核酸外切酶特异性地从5 端外切双链DNA,5,3,3,5,l,Exo,Mg,2+,3,3,5,5,4、单链核酸内切酶：S1核酸酶,S1核酸酶的基本特性,降解单链,DNA,的速度比降解双链,DNA,快,75000,倍,反应必需有Zn,2+,最适pH范围为4.0-4.3,需要,NaCl 10-300 mMol,降解单链,DNA,的速度比降解单链,RNA,快,7,倍,S1核酸酶的基本反应一,内切单链DNA或RNA，产生带5 磷酸的单核苷酸。,5 G-C-T-C-A-G-C-T-C-T-T-G-A-G-G-A-G-T 3,S1,Zn,2+,5 G-C-T-C-A-G-C-T-C T-T-G-A-G-G-A-G-T 3,5 G-C-T-C A-G-C-T-C T-T-G-A-G G-A-G-T 3,5 dNMPs,或,5 NMPs,S1核酸酶的基本反应二,内切带缺口或缺刻的双链DNA或RNA,5 G-C-T-C-A-G C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5,nick,5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3,3 C-G-A-G-T-C A-C-C-T-C-A 5,gap,S1,Zn,2+,5 G-C-T-C-A-G,3 C-G-A-G-T-C,T-G-G-A-G-T 3,A-C-C-T-C-A 5,5、单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶,主要是3 核酸外切酶活力，同时也具有DNA内切酶活力。可从线状DNA两条链的3 端迅速去除单核苷酸，随后在形成的互补单链上进行缓慢的内切酶降解。,DNA or RNA,Bal31,5 dNMPs,或,5 NMPs,Bal31,Bal31,（五）核酸修饰酶,1、末端脱氧核苷酰转移酶（TdT）,TdT的基本特性：,不需要模板的DNA聚合酶，随机掺入dNTPs。作用底物：带,3OH,的单链DNA或双链DNA。,5 p,OH,3,3,HO,p 5,TdT,Co,2+,dATP,5 p,3,HO,p 5,AAAAAAAAAAAA,OH,3,TdT的基本作用：,5 p,3 HO,OH 3,p 5,TdT,Co,2+,dATP,5 p,p 5,AAAAAAAAAA,OH 3,3 HO,AAAAAAAAAAA,5 p,3 HO,OH 3,p 5,TdT,Co,2+,dATP,5 p,p 5,AAAAAAAAAA,OH 3,3 HO,AAAAAAAAAAA,2、碱性磷酸单酯酶,来自小牛胸腺的碱性磷酸单酯酶（,CIP,）,特异性强；,来自大肠杆菌的碱性磷酸单酯酶（,BAP,），耐热；,作用：催化去除单链或双链DNA或RNA分子中的5 p，,即脱磷酸作用，防止DNA片段自身环化。,DNA or RNA,5 p,OH,3,5,HO,OH,3,5 ppp dN,5 pppN,BAP,/CIP,5,HO,dN,5,HO,N,3、T,4,-多核苷酸磷酸激酶（T,4,-PNP）,T,4,-PNP的基本作用：在DNA、RNA的5-OH上加磷酸,用于DNA探针的末端同位素标记。,5,HO,3,HO,OH,3,OH,5,T4-PNP,Mg,2+,p,ppATP（,g,-,32,P-ATP）,OH,3,3,HO,5,p,p,5,二、基因工程常用的克隆载体,基因工程的一个重要环节是目的基因转运载体（Vector）之设计和运用。,因为目的基因（外源DNA）一般难以进入不同种属的宿主细胞中，即使能单独进入也不能进行复制增殖和表达，它必须与具有自我复制能力的DNA载体共价结合后才能被复制和表达。,这种在细胞内具有能进行自我复制的独立DNA分子作为外源DNA片段的运载体，简称基因载体，又称分子克隆载体或无性繁殖载体。,功能特点：,能自行自我复制。,容易导入宿主细胞。,（一）基因载体的特性,理想的基因载体应具备以下特性：,要有复制子（Replicom）功能，且复制起始区中没有限制酶的酶切位点。,要含有强启动子，要有能促进外源DNA高水平表达的调控区。,要有多种限制酶的单一切点，以适用于多种限制酶产生的DNA片段的插入。,具有两种以上易被检测的选择性遗传标记，作为对重组与非重组转化体的选择标记。,载体DNA的分子量要尽可能小，以利于容纳较长区段的外源DNA片段。,应属于松弛型复制，能在氯霉素存在下扩增其拷贝数。,从安全防治考虑，载体应为非传递性，有较小的宿主范围，不为传递性载体所诱导。,要达到上述要求，必须对天然存在的原始载体进行改造并构建成理想的载体：,引入强启动子。,引入选择性标记基因。,切除大部分多余序列段，以提高容纳外源DNA片段的能力。,引入由多种限制酶单一识别序列组成的多克隆位点。,引入多种用途的辅助序列。,（二）常用的基因载体,1、质粒载体,质粒（Plasnid）是一些存在于微生物细胞内染色体外的闭合环状双链的小型DNA分子，是能进行独立复制并保持恒定遗传的辅助性遗传单位，是基因工程一类主要的分子克隆载体。,（1）pBR322,分子量2.610,6,u，4.36kb。,由pMBI改造而成，引入了Tet,r,(抗四环素)和Amp,r,(抗氨苄青霉素)两个抗药标记基因，去除了大部分非必须的序列，大小仅4.36kb。,该质粒有32个限制酶切位点，Tet,r,内有,Bam,A,等10个酶切位点，Amp,r,基因内有,Pst,等6个限制酶切位点，十分有利于检出重组转化子。,pBR322质粒上从复制起点到Tet,r,基因间还有一个较长的非必须区域，分子量相对较大。,pAT153载体：在16442349位点之间切除了,Hae,片段，去除了705bp，包含接合转移的有关序列。,pBR327载体：切除了14422502非必须区段而成，长仅3.27kb，拷贝数增加24倍,（2）、PUC系列载体,PUC18、PUC19质粒载体，是2.7kb的小型载体。,含有Amp,r,(抗氨苄青霉素)基因，复制原点和,Lac,Z基因。,在,Lac,Z基因内有多种限制酶识别位点组成的多克隆位点。在相应的宿主（,Lac,Z,）中可出现互补（合成-半乳糖苷酶）。,pUC质粒载体,(1)来自,pBR322质粒,的,复制起点(ori),；,(2),氨苄青霉素,抗性基因(Amp,r,),，但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的限制酶的单识别位点。,(3),大肠杆菌-半乳糖苷酶的启动子以及编码该酶氨基端-肽链的DNA序列,此结构特称为,lac,Z基因。,(4)多克隆位点,(MCS)区段,：位于,lac,Z基因,中的靠近5端，内含十几个单一的限制性内切