生物技术药物反义核酸和核酶培训课件.ppt

,文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。,主要内容,绪论,动植物细胞培养生产医药用产品或原料,转基因动植物作为药物生物反应器,抗体工程药物,干细胞与治疗性克隆,基因工程疫苗与,DNA,疫苗,基因药物,反义核酸与反义技术,生物技术药物新药与专利申报,生物技术制药产业化个案,反义药物,主要内容,一、反义核酸与反义技术,反义核酸和反义技术概念,反义核酸的基本原理,反义核酸的种类,反义核酸与反义技术的应用,二、核酶技术及其应用,核酶概述,核酶与,RNA,修复,核酶技术在临床上的应用,核酶技术面临的问题,反义核酸和反义技术,反义核酸,(antisense nucleic acid),是一段与靶基因的某段序列互补的天然存在或人工合成的核苷酸序列,它可通过碱基配对与细胞内核酸特异结合形成杂交分子，从而在转录和翻译水平调节靶基因的表达，具有合成方便、序列设计简单、容易修饰、选择性高、亲和力高等特点,反义核酸技术（,antisense nucleic acids technology),是根据核酸杂交原理设计的，以选择性地抑制特定基因表达为目的的一类核酸研究新技术,包括,反义,RNA(asRNA,),、反义,DNA(asDNA,),、核酶,(,Rz,),反义核酸的基本原理,绝大多数,DNA,由两条碱基互补的单链组成，生物信息以核苷酸不同排列顺序编码在,DNA,链上，基因组形成单顺反子结构,在,DNA,双链上被转录为,RNA,的链为正义链，与其相对应的链为反义链,精心设计一段寡核苷酸与正义链互补，一般由,7到30个核苷酸组成,，,将会阻断基因转录；或将含有反义序列的载体导入细胞内，干扰特定基因表达,利用这一原理可以在基因位点、前体,mRNA,、,mRNA,及蛋白水平，通过干扰特定基因功能限制细胞增殖、分化和凋亡,反义基因治疗,DNA DNA,RNA RNA,反义,RNA,阻断表达,利用人工合成的反义,RNA,或,DNA,导入靶细胞，控制细胞的中间阶段使编码蛋白的基因不能转录为,mRNA,或阻断翻译相应蛋白,反义技术的两种技术路线,将表达与体内基因或,mRNA,互补序列的基因转入体内，使细胞表达与目标基因互补的,mRNA,，从而阻断目标基因的表达,体外合成,mRNA,互补的核苷酸类似物，通过静脉注射等途径进入细胞，特异性地与目标,mRNA,作用,以第二种为主来介绍,反义核酸的种类,反义,RNA,：一类能与特异,mRNA,互补的小分子质量的、可扩散的,DNA,转录物，能够从翻译、转录和核酸复制水平上高度特异地抑制靶基因表达,反义,DNA,：人工合成一小段反义寡核苷酸，与,DNA,或,mRNA,序列互补结合，封闭靶基因表达（,ASODN,）,理论上认为寡核苷酸与其意义链互补，会象“封条”一样，阻断,mRNA,拼接、转录、翻译，下调特定基因表达,反义,RNA,的最初发现,反义,RNA,最先发现于原核细胞，是由,Tomizarna,在,1981,年对质粒,ColE1,复制的研究过程中发现的,c-myc,基因,真核细胞中天然反义,RNA,调节,c-myc,基因是禽类髓细胞病毒,(AMN)MC-29,的,V-,myc,的细胞同源序列，与多种肿瘤发生发展有关,Saito,等研究发现，,c-myc,基因有,3,个外显子，第一个外显子不编码蛋白质，它的序列与第二个外显子互补，通过反义,RNA,与第二个外显子,mRNA,的碱基配对而抑制基因表达,在人,Burkitt,淋巴瘤中发现,c-myc,基因失去了第一个外显子，从而使,c-myc,基因表达失控,由此可见，反义,RNA,的负调节被解除是细胞恶性转变的原因之一,c-myc,基因,真核细胞中天然反义,RNA,调节,c-myc,互补,RNA,C-MYC,反义,RNA,的作用机制,作用于外显子和内含子的连接区，阻止,mRNA,前体的剪接,反义,RNA,与,DNA,结合时能阻止转录因子与,DNA,的结合，从而阻止特定基因的转录,互补于特定,mRNA,的非编码区，如,SD,序列或核糖体结合位点及其上游区，影响核糖体结合，从而抑制翻译,互补于特定,mRNA,的编码区，抑制翻译或激活,RNase,H,使,mRNA,易被核酸酶降解,作用于靶,mRNA,的,5,端，阻止帽子结构形成，影响,mRNA,的成熟,作用于,PoIy,A,形成位点，阻止靶,mRNA,成熟及向胞浆内的转运,反义,RNA,的作用机制,DNA,preRNA,RNA,Protein,m7G5ppp,AAAA,rRNA,反义,RNA,的获得途径,化学会成法,：,利用核酸合成仪直接合成反义,RNA,体外转录法,：,利用带有噬菌体,SP6,或,T7,等启动子序列的质粒，将特异基因的,DNA,片段反向插入其多克隆位点中，在,RNA,聚合酶的作用下体外合成特异性反义,RNA,细胞内转录法,：,利用基因重组技术，在适宜启动子和转录终止子之间反向插人一段靶基因，人工构建反义,RNA,表达载体,(,病毒表达载体或质粒表达载体,),，然后转染细胞并使之在细胞中稳定表达反义,RNA,反义,RNA,的临床作用,抗病毒：,将特定的病毒基因反向插入到表达性载体中，以构建反义,RNA,表达载体,再将重组体导入真核细胞,(,病毒宿主细胞,),中表达特异性反义,RNA,从而抑制特异有害基因的表达或抑制病毒复制（疱疹病毒、流感病毒、人类免疫缺陷病毒）,抗肿瘤：,设计出针对肿瘤细胞的癌基因、突变基因、非正常表达基因及某些肿瘤相关病毒的癌基因反义,RNA,以阻断这些有害基因的表达，达到治疗肿瘤的目的,反义,DNA,与靶基因结合形式,寡核苷酸与双股,DNA,结合，形成三股螺旋结构，竞争抑制激活转录蛋白与基因启动子结合，发挥其生物活性,寡核苷酸与,mRNA,杂交形成了核糖核苷酸酶,H(RNase,H),底物，激活,RNase,H,识别杂交体特异性地剪切杂交分子中的,mRNA,RNase H,ASODN,mRNA,TFO,反义寡聚核苷酸与,mRNA,特异性结合，阻断翻译过程,ANTISENSE,TECHNOLOGIES,GENOMICS BASED DRUG DISCOVERY,PHARMACEUTICALS,MOLECULAR,DIAGNOSTICS,GENE THERAPY,DRUG DELIVERY SYSTEMS,Relation of antisense technologies to other segments of biopharmaceutical industry,反义技术与反义核酸的应用,利用反义,RNA,的原癌基因失活疗法：,阻止或抑制原癌基因的过度表达及抑制癌基因突变体,mRNA,成熟,原癌基因,调控细胞生长，增殖与分化,正常情况下，表达受严格控制,一旦调节失控，基因产物（生长因子，生长因子受体，胞内外传递信,号等癌蛋白）分泌过剩，细胞恶性增生，致癌,治疗方法,根据已知癌基因的核苷酸序列合成反义,RNA,相应的反义寡聚核苷酸与肿瘤癌基因活化表达的,mRNA,的起始翻译位,点结合成,RNA/RNA,双链体,双链体阻止启动子与核糖体结合，或核糖体沿,mRNA,上移，抑制翻译,反义RNA的应用（一）,反义RNA的应用（二）,反义RNA的应用（二）,反义RNA的应用（二）,抗,HIV-l,的作用：从翻译水平封闭基因表达，并干扰,mRNA,的剪切、加工而实现抗病毒作用,tat,为,HIV-l,重要的调节基因，编码反式激活因子,Tat,蛋白,在逆转录病毒启动子,LTR,之后连接反义,tat,与多聚,TAR,的构建物(,LTR-25TAR-AS-TAT)，,具有反义,tat,及,TAR,诱饵的双重作用,由于,LTR,启动子受,Tat,蛋白反式激活，使,tat,在,HIV-l,感染的细胞中得以高表达,将这种外源基因导入,Molt-3 T,细胞系、,CEM-SS T,细胞系及健康人外周血单个核细胞(,PBMCs,)，,对实验及临床分离病毒株均有抑制作用,gag,是,HIV-1,的结构基因，编码,p24,等病毒结构蛋白,Veres,等构建了逆转录病毒载体，在细胞内表达互补于,gag,区不同长度的反义,RNA(225-1225nt),在,CEM-SS T,细胞及外周血,CD4,细胞均有抑制,HIV-l,复制的作用,长片段反义,RNA,的抗,HIV-l,作用更好，可能由于它能与不同种的,HIV-l RNA,结合而限制了病毒的逃逸,部分反义药物,Oligo,Company,Status/Remarks,ISIS 3521,ISIS 2503,ISIS 5132,AP12009,Oncomyg NG,AVI 4557,Genasense,GEM 231,GTI 2040,GTI 2501,LEafAON,PAN 346,HERZYME,ANGIOZYME,ISIS Pharma,ISIS Pharma,ISIS Pharma,Antisense Pharma,AVI BIoPharma,AVI BIoPharma,Genta,Hybridon,Lorus Therapeutics,Lorus Therapeutics,NeoPharm,Panacea Pharma,Ribozyme Pharma,Ribozyme Pharma,PIII(Affinitak),PIII,PIII,针对肿瘤的反义药物,针对其他疾病的反义药物,Oligo,Company,Indications,Resten NG,E2F Decoy,AVI BioPharma,Corgentech,Cardiovascular disorder,ISIS 2302,ISIS 104838,AVI 4014,ISIS Pharma,ISIS Pharma,AVI BIoPharma,Autoimmune&Inflammatory,Durason,EpiGenesis,Respiratory disorder,AVI 4126,AVI BioPharma,Urological Disease,ISIS 14803,HEPTAZYME,HepBzyme,PNAbiotics,NeuBiotics,ISIS Pharma,Ribozyme Pharma,Ribozyme Pharma,Pantheco,AVI Biopharma,Infectious Disease,GEM 92,HGTV43,Hybridon,Enzo,AIDS&Related disease,第一个反义药物,福米韦生,Fomivirsen,（,ISIS2922,）是,FDA,批准上市的第,1,个反义药物,商品名,Vitravene,美国,ISIS,Pharma,公司研制,瑞士,Ciba Vision,Ophthalmics,公司申请,1998,年,8,月在美国首次上市,核苷酸序列为,5-GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG-3,硫代磷酸化修饰,主要用于治疗艾滋病,(AIDS),病人并发的巨细胞病毒,(CMV),性视网膜炎,第一个反义药物,福米韦生,1,药效学,1.1,抗病毒作用机制,主要依赖于反义作用，福米韦生与,CMV mRNA,特异序列互补结合，被,RNA,酶,H,识别，并使,mRNA,水解失活,抑制,CMV,进入宿主细胞是序列非依赖性的非反义作用,1.2,抗病毒活性,对人类,CMV,病毒株,AD169,的,EC50,为,0.37moL,此,EC50,为更昔洛韦（,ganciclovir,）的,l30,190,1.3,耐药性,耐受高浓度福米韦生的病毒突变株与福米韦生互补的基因区并无改变，这表明耐药性不是互补基因区发生改变而引起的,第一个反义药物,福米韦生,2,药动学,2.1,兔体内药动学,以,14,C,标记的福米韦生单次,66,g,剂量，玻璃体液中消除,t1/2,为,62h,给药,10,天后，仍对,CMV,复制有抑制作用，有,22%,的福米韦生存在，其余,78%,则降解为短链代谢物,视网膜中消除,t1/2,约为,79h,2.2,猴体内药动学,玻璃体液药物浓度与剂量曲线几乎为直线关系,峰值浓度出现在给药,2,3,天后，,14,天后基本检测不到,在每周或每,2,周玻璃体内注入,11,、,57,和,115g,后，玻璃体液中未发现药物累积现象,但多次注射后，视网膜上出现药物累积现象,福米韦生,115g,单次给药，在视网膜中消除,t1/2,为,78h,第一个反义药物,福米韦生,3 临床疗效,前3周每周福米韦生165g玻璃体内注射，以后每2周给药1次，,用药组和对照组,病情进展时间中位数分别为71和14天,福米韦生可以降低病人体内的CMV活性，呈剂量-效应关系,病情发展到威胁视力的病人，使用福米韦生后症状有所好转，病情进展明显延缓,4 不良反应,最常见不良反应是暂时,性,眼内压升高和轻、中度眼前、后房炎症反应,所有研究对象均未发生视网膜剥脱和全身毒性反应,高剂量可引起少数病人外周视网膜色素沉着及周边视力下降,与眼外科手术相比，玻璃体内注射发生出血、眼内炎和视网膜剥脱的风险要小得多,第一个反义药物,福米韦生,5,适应证和禁忌证,福米韦生为二线治疗药物，适用于对其他治疗措施不能耐受或没有效果或有禁忌的病人；禁用于,2,4,周内使用西多福韦（,cidofovir,）治疗的病人，以免增加发生眼内炎的危险性,6,与治疗,CMV,视网膜炎的其他药物比较,更昔洛韦、西多福韦和膦甲酸钠是,CMV,抑制剂，而非杀死剂；具有交叉耐药性；可产生肾毒性；插管给药、植入制剂费用昂贵、重复手术以及视网膜剥脱发生率高（,28%,）使应用受限,福米韦生具有阻止病毒复制，疗效持久、用药次数少，不良反应少而轻，局部玻璃体内注射给药优于其他上述提及的给药方法,7,展望,受体介导的转移技术,受体介导,DNA,转运技术的启发实现,DNA,和,RNA,的转运,例：脱唾液酸血清类粘蛋白,(ASGP),受体,唾液酸血清类粘蛋白,唾液酸,ASGP,ASGP,+PL,（多聚赖氨酸）,ASGP-PL,复合物,反义,RNA,+ASGP-PL,复合物,ASGP-PL-,反义,RNA,复合物,ASGP-PL-,反义,RNA,复合物,肝细胞表面,ASGP,受体识别,吞噬,释放,发挥作用,优点：,专一性强，抗降解能力强,以聚合物微球为载体的输送系统,目前研究最多的聚合物微球是聚丙交酯及乳酸一羟乙酸（,LA-GA,）,以丙交酯和乙交酯为单体形成的共聚物，降解属于水解反应,产物均为人体正常代谢物，降解时间取决于两种单体的配比和聚合物的分子量,构成的结合复合体具有潜在的转运反义核苷酸和核酶的作用,核酶技术及其应用,核酶,(,Ribozyme,),一种具有核酸内切酶活性的,RNA,分子,，可特异性地切割靶,RNA,序列，具有解离后重复切割相同靶分子的能力,核酶发展简史,1968,年，,Francis Crick,在他的论文“基因密码的起源”一文中提到：“可能第一个酶是具有复制能力的,RNA”,，没有人予以注意,1987,年，第,52,届冷泉港定量生物学国际讨论会上，,Alan Weiner,做会议总结时重复了,20,年前,Francis Crick,的话，会议注意力已集中到最近发现的具有酶活性,RNA,分子上,1989,年，诺贝尔化学奖授予了分别独立地发现具有酶活性的,RNA,分子的,Thomas.R.,Cech,（,Colorado University,）,Sidney Altman,（,Yale University,）,Thomas R.Cech,切赫，美国人,因发现,RNA,生物催化作用与,S.Altman,同获,1989,年诺贝尔化学奖,独立发现,RNA,不仅被动地传递遗传信息，还能催化细胞内生命所必需的化学反应，,1982,年公布其研究结果，,1983,年证实,RNA,的酶活动,此前，人们认为仅蛋白质才能起酶的作用,核酶的发现,研究目的：,r,RNA中一些无意义的序列，或,内含子,(,intron,),，如何从RNA,分子中剪切下来？,研究对象：,原生动物四膜虫,(,Tetrahymena Thermophila,),，只含一种,RNA，除,r,RNA外还有一个由413,个核苷酸组成的插入序列,(,interveningsequenc，IVS,),研究发现：,转录产物,rRNA,前体很不稳定，在鸟苷和,Mg2+,存在下切除自身的,IVS,，,使两个外显子拼接起来，变成成熟的,rRNA,分子。催化反应是在无任何蛋白质酶存在下发生的，称为,自我剪接,研究结论：,I,VS具有类似蛋白酶的功能，能够打断及重建磷酸二脂键,r,RNA前体能靠自己完成剪接过程,，,在一定条件下,按一定方式盘绕，进而切割自己，以后再把保留部分连接起来。可以催化自由底物的具有酶活性的RNA,RNA分子具有自身断裂的催化作用，以及酶活性的另一个重要方面即催化其他分子的反应,Sidney Altman,奥尔特曼（,1939,）美国人,因发现,RNA,的生物催化作用而获,1989,年诺贝尔化学奖,1978,年奥尔特曼发现了核糖核酸,(RNA),自身具有的生物催化作用,不仅为探索,RNA,的复制能力提供了线索，而且说明了最早的生命物质是同时具有生物催化功能和遗传功能的,RNA,，打破了蛋白质是生物起源的定论,S.Altman,的研究工作,研究目的：,t-RNA,分子的剪接过程,研究发现：,在较高浓度的镁离子和适量精氨酸参与下，核酸酶,P,（,ribonuclease,P,，,RNase,P,）中,RNA,能够切割,tRNA,前体,5,端,研究结论：,过去都认为,RNase,P,的催化作用由,RNA,和蛋白质共同完成的，而该实验证明，,RNase,P,的催化作用是由,RNA,完成的，而其中的蛋白质在细胞内仅仅起稳定构象的作用,由于,这类酶,具有类似核糖核酸功能，而化学本质为核酸，因此被切赫称之为,核酶,核酶的作用机制,核酶的分类,剪切型核酶：这类核酶催化自身或者异体,RNA,的切割，相当于核酸内切酶,剪接型核酶：这类核酶具有核酸内切酶和连接酶两种活性,剪切型核酶,剪接型核酶,根据催化反应,锤头核酶,I,型内含子,II,型内含子,发夹核酶,丁型肝炎病毒,(HDV),核酶,RNase P,链孢霉线粒体,(VS),核酶,自体催化,异体催化,自体剪切型核酶,-,锤头型核酶,锤头核酶是从类病毒中分离出来的,本来是一个顺式切割的酶，将其分为酶链和底物链两部分后就转变为靶标特异性的反式切割的酶,在防止有害基因的表达上具有很大的应用价值,形状：长约30个核苷酸，呈球状构象，可粗略看成,性折叠,二级结构,：3个超螺旋结构域和1,3,个保守核苷酸残基,构成：催化区和底物结合区,性质：需要二价金属离子,(,Mg2+),作为它的辅因子，核酶的活性形式是一种,RNA,键合金属氢氧化物,3,个双螺旋区,13,个核苷酸残基保守序列,剪切反应在右上方,GUX,序列的,3,端自动发生,发夹结构核酶,1989,年汉普（,Hample,）研究烟草环斑病毒（,sTRSV,）的负链,RNA,的自我剪切反应，提出发夹结构（,hairpin structure,）模型,发夹核酶催化机制：金属离子在催化反应中起结构作用，其剪切活性比锤头结构核酶高,5,3,剪切位点,自体剪切型核酶,-,发夹结构,3,个环和,4,个螺旋形成两个结构域,剪切反应发生在底物识别序列,GUC,的,5,端,两个内部环中的碱基及在螺旋区,II,的,G11,和底物中的,G+1,都是酶发挥作用所必需的,肝炎病毒（,HDV,）核酶,目前唯一一种哺乳动物细胞内具有天然核酶活性的动物病毒,来源于肝炎病毒的反义,RNA,和基因组,RNA,，为单股环状负链,RNA,病毒,结构特点：有,3,个由碱基配对形成的茎，剪切时需要二价阳离子参与，结果产生,5-OH,和,2,3-,环磷酸,剪切部位,剪切部位,自体剪切型核酶,-,斧头结构,三个碱基对的茎,需要二价阳离子,产生,5-OH,和,2,3-,环磷酸,链孢霉线粒体（,VS,）核酶,VS,核酶球状，由,5,个螺旋结构组成，这些螺旋结构通过两个连接域连接起来，连接域对于催化反应很重要,异体剪切型核酶,RNase P,RNase,P,是内切核酸酶，是核糖核蛋白体复合物，能剪切所有,tRNA,前体的,5,端，除去多余的序列，形成,3-OH,和,5-,磷酸末端,RNase,P,由,M1 RNA,和,蛋白质亚基,组成,体外：,M1 RNA,具催化作用，蛋白质作为辅助因子,体内：,M1 RNA,和蛋白质对酶活性都是必需的,RNase,P,可剪切前体,5,端,41nt,5,端成熟,不同,tRNA,的,5,端没有顺序共同性，剪切的准确性与剪切部位周围的核苷酸顺序无关，表明在,RNase,P,的组分内没有引导序列，,RNase,P,所识别的是底物的高级结构,剪切位点,型内含子核酶,一类具有酶催化功能的内含子，转录成,RNA,后，可以自剪接,其转录后可形成9个碱基配对形成的特定二级结构，分别命名为,P1,至,P9,在剪接反应中，需要游离的鸟苷作辅助因子,可以用来修复体内的有害突变基因,G,结合位点,保守序列,剪接部位,引导序列,G,结合位点,I,类内含子二级结构通式,I,型内含子催化其他,RNA,分子反应的几种类型,转核苷酸作用,2CpCpCpC,pC,CpCpCpCpC,pC,+,CpCpCpC,水解作用,CpCpCpC,pC,CpCpCpC,+,pC,转磷酸作用,CpCpCpCpCpC,p,+,UpCpU,CpCpCpCpCpC,+,UpCpU,p,去磷酸作用,CpCpCpCpC,p,CpCpCpCpC,+,Pi,限制性内切酶作用,CpUpCpU,pN,+G,CpUpCpU,+,GpN,II,型内含子核酶,由,6,个螺旋组成，分成,3,个部分：,边界序列,5 GUGCG,Yn,A,G,，（,Y,代表嘧啶，,n,代表任意核苷酸）,3,茎环结构,分支点顺序,A,处于未配对状态，有一游离的,2-OH,剪接机制：不需要鸟苷或鸟苷酸参加，但仍需要镁离子,(Mg 2+),II,型内含子核酶,II,型内含子有一个保守的二级结构,结构域,V,：高度保守，催化活性必需,结构域,VI,：未配对的,A,提供,2-OH,II,型内含子核酶,II,型内含子核酶剪接机制,脱氧核酶,指具有催化功能的,DNA,分子称为脱氧核酶,(,DNAzyme,),，又称酶性,DNA,在一定条件下可切割,RNA,分子特定位点内部的磷酸二酯键,脱氧核酶的发现进一步延伸了酶的概念,具有水解酶活性的脱氧核酶,以,RNA,为底物的脱氧核酶：包括“,10-23”,DRz,和“,8-17”,DRz,以,DNA,为底物的脱氧核酶：手枪型脱氧核酶,具有,N-,糖基化酶活性的脱氧核酶,具有连接酶活性的脱氧核酶,具有激酶活性的脱氧核酶,10-23,型脱氧核酶作用机理,手枪型脱氧核酶自我剪切作用机理,核酶与,RNA,修复,核酶是天然的具有催化能力的,RNA,分子，能特异性地催化,RNA,剪接,经过基因工程改造的核酶，可以位点特异性地切割任意给定的,RNA,分子,剪接有两种形式：一是分子内不同部分间的剪接，称为顺式剪接；一是不同分子间的剪接，称为反式剪接,反式剪接是修复,RNA,外显子突变的重要方法,可以把正常基因或具有类似功能的基因相应片段，剪接到异常,RNA,上去，换下突变的部分,修复,RNA,结构缺陷,利用核酶的剪接能力，可引入新的基因功能或修复已有的基因缺陷,N.,Lan,等对镰形细胞贫血突变的,珠蛋白,mRNA,进行了修复,镰刀形细胞贫血是由于,珠蛋白基因第,6,密码子中的一个,A,T,突变引起的,将来源于四膜虫组I内含子的核酶改造，使之能专一性识别,珠蛋白,mRNA,突变位点上游的特定序列,将,珠蛋白,cDNA,下游包括外显子在内的对应片段连接到这一核酶的,3,端,转染培养到病人外周血和脐带血干细胞后，均检测到,珠蛋白,mRNA,被剪接成,珠蛋白,融合,RNA,分子，说明引入的功能基因得到表达,胎儿型血红蛋白(,HbF,，,2,2),与成人型血红蛋白(,HbA,，,22,)功能相近，所以,珠蛋白的引入，可以代偿,S,珠蛋白所丧失的功能，起到治疗镰形细胞贫血的作用,T,恢复正常剪接途径,基因突变有时会在内含子中生成新的剪接点，当然也是异常的剪接点。它们与左邻右舍原来不起作用的隐匿的剪接点搭配起来，就会形成错误剪接,由于原有的正常剪接点并未丧失功能，只是作用被异常剪接抑制，所以用反义核酸通过碱基互补，封闭异常剪接点或其他剪接元件，就可堵住异常剪接途径，迫使剪接系统选择正确的途径，形成正常,RNA,。这就间接地对,RNA,缺陷作了“修复”,剪接缺陷型突变往往使,mRNA,失活，影响严重,地中海贫血是由于患者,珠蛋白基因突变，导致正常,链减少，红细胞内,和,链不平衡，缔合形成的成人型血红蛋白（,22,）少了或者完全没有引起的,已发现的,190,多种,地中海贫血突变型中，有一部分属于剪接缺陷型,C,C,C,C,C,C,C,C,C,C,反义,RNA,地中海贫血,我国常见的内含子,2,第,654,位,CT,突变（,654,），就是在,653,位形成了一个新的剪接点，同时又激活了其上游,579,位一个潜在的剪接点，导致一段长度为,73,个碱基的内含子,2,序列插入到外显子,2,和,3,之间，形成异常,mRNA,，引起地中海贫血表型,由于突变基因原有的正常剪接点并未遭到破坏，仍然可以发挥作用，所以用反义核酸封闭异常的,653,或,579,位点，就能迫使人体剪接系统回到正常剪接途径，减少异常,mRNA,的形成,反义封闭虽没有对,珠蛋白基因的突变作任何修正，但是对突变,RNA,的错误剪接方式作了纠正，所产生的成熟,mRNA,可以指导合成正常珠蛋白链。,调整蛋白质肽链比例,突变基因的异常表达，往往扰乱体内蛋白质肽链之间的平衡，引起疾病,反义封闭技术也可用来纠正基因表达的紊乱。常见的血红蛋白,H,病（慢性溶血性贫血）的研究，就是一个比较理想的范例,正常人每个细胞有,4,个,珠蛋白基因，,2,个,珠蛋白基因，合成的,和,链正好缔合成四聚体,22,血红蛋白,H,病,如果在,4,个,珠蛋白基因中只有,1,个正常，其余,3,个丢失或有缺陷，则红细胞中,链合成不足，,链相对过剩。多余的,链自行聚合为四聚体,4,，即血红蛋白,H,血红蛋白,H,不稳定，容易解体生成游离的,链，游离链在红细胞内沉淀形成,H,包涵体，附着在红细胞膜上，使膜受损失去柔韧性。这种红细胞易被脾脏破坏，导致血红蛋白,H,病,血红蛋白,H,病的基本病因是,链偏少，,链偏多，可以采用反义封闭表达偏多的正常,mRNA,，使,链合成减少，与本身不足的,链在低水平上达成平衡，从而改善临床症状,这一策略反其道而行之，不是修正，而是抑制基因功能，属于一种广义的,RNA,功能修复,Ribozyme,的应用前景,抗,AIDS,抗白血病,抗病毒病,抗肿瘤,抗抗药性,抗,AIDS,Hang,等证实锤头状,ribozyme,在体外系统中可在不同位点有效地剪切,HIV-1,病毒,RNA,的,gag,基因,Saver,等则证实,ribozyme,可在细胞剪切,HIV-1,病毒,RNA,他们构建了一个质粒，该质粒含抗,HIV-1,病毒,gag,基因的,ribozyme,基因，该基因由人,-actin,启动子操纵,它被脂质体包裹后转染,Hela,CD4+,细胞，当用,HIV-1,感染稳定表达,ribozyme,的,CD4+,Hela,细胞后，病毒,RNA,水平和标记抗原,P24,的水平比对照细胞有明显降低,1998,年，美国加利福尼亚大学,Wong-,Staal,等利用发夹核酶抑制,HIV-,基因表达，并在,期临床实验中受到良好效果,抗白血病,慢性粒细胞性白血病,(CML),病人体内，有基因重排现象,一个融合基因，,BCR,ABL,是发病原因,该基因编码,2,种,mRNA,、,B3A2,和,B2A2,，二者都可翻译出,210ku,的酪氨酸激酶,针对此,RNA,的一些短的合成的,ribozyme,用,DOTAP,阳离子脂质体导入,CML K562,细胞株,72h,后，蛋白质的表达降到,23%,在另一实验中，一合成的,DNA-RNA,杂合,ribozyme,，可完全抑制酪氨酸激酶的表达,抗病毒病,Zheng,等在培养的组织细胞中，设计针对淋巴细胞绒毛膜脑膜炎病毒的,ribozyme,，能降低病毒的,RNA,量，使病毒感染减轻,Tang,等设计了阻断流感病毒,A,的锤头状和发夹型,ribozyme,目前人们已进行了核酶抗甲型肝炎病毒（HAV)、乙型肝炎病毒（HBV）、丙型肝炎病毒（HCV）以及HDV作用的研究,人工设计核酶多为锤头状结构，少部分是采用发夹状核酶,抗肿瘤,Kashani,证明,ribozyme,可改变组织培养基上的人膀胱肿瘤细胞的形态和生长行为,当裸鼠移植植了表达该种,ribozyme,的肿瘤细胞后，其存活率比对照提高了,2,倍,核酶能在特定位点准确有效地识别和切割肿瘤细胞的,mRNA,，抑制肿瘤基因的表达，达到治疗肿瘤的目的,抗抗药性,多药耐药性是影响肿瘤化疗疗效的一大难点，它使病人对结构和功能不同的化疗药物不再敏感，这与抗药基因,(MDR),以及,fos,基因产物等有关,Scanlon,等研究,fos,基因产物在抗原性方面的作用，他们发现，活性,ribozyme,抑制,c,-,fos,的表达比失活的,ribozyme,要强,7,倍,核酶技术面临的问题,核酶催化切割反应的可 逆性问题,催化效率低，提高催化效率,寻找合适载体将核酶高效、特异地导入靶细胞,使核酶在细胞内有调控地高效表达,增强核酶在细胞内的稳定性,对宿主的损伤问题有待进一步考察,新技术 新思路,设计出具核酶活性的反义,RNA,，既能与,mRNA,互补结合阻止,mRNA,的翻译，又带有锤头状结构基因，能对靶序列（,mRNA,）特异性切割，可反复使用,祝大家,学习愉快，不断进步！,路漫漫其修远兮，吾将上下而求索,