蛋白质与酶工程第四章酶分子修饰.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,与化学催化剂相比，酶缺点,医用酶缺点：稳定性差、分子量大、成本高、来源有限、有异体反应,工业酶缺点：热稳定性差、活力低、耐受,pH,范围窄,酶的分子工程,分子生物学水平，即用基因工程方法对,DNA,进行分子改造，以获得化学结构更为合理的酶蛋白,对天然酶分子进行改造，包括酶一级结构中氨基酸置换、肽链切割、氨基酸侧链修饰等,Contents of chapter 4,1,、什么是酶分子修饰,2,、酶分子修饰的基本要求和条件,3,、酶分子的修饰方法,4,、酶修饰后的性质变化,Go,Go,Go,Go,5,、酶的定向进化,Go,酶的化学修饰定义,从广义讲，凡涉及,共价或部分共价键,的形成或破坏的转变都可看作是酶的修饰,从狭义讲，酶的,化学修饰,则是指在较温和的条件下，以,可以控制,的方式使一种蛋白质同某些化学试剂起特异反应，从而引起单个氨基酸残基或其功能基团发生,共价,的化学改变,酶分子修饰的意义,提高酶的,活力,activity,增强酶的,稳定性,stability,降低或消除酶的,抗原性,immunological property,研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响,structure,回本章目录,4.2,酶分子修饰的基本要求和条件,对酶分子进行修饰必须在修饰原理、修饰剂和反应条件的选择以及酶学性质等方面都要有足够的了解。,（,1,）,酶的稳定性,热稳定性、酸碱稳定性、作用温度、,pH,、抑制剂等。,（,2,）,酶活性中心的状况,活性中心基团、辅因子等。其他如分子大小、性状、亚基数等。,酶分子修饰的条件,修饰反应尽可能在,酶稳定条件,下进行，并尽量,不破坏酶活性功能的必需基团,，使,修饰率高,，同时酶的,活力回收高,。,（,1,）,pH,与离子强度,pH,决定了酶蛋白分子中反应基团的解离状态。由于它们的解离状态不同，反应性能也不同。,（,2,）,修饰反应的温度与时间,严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。,（,3,）,反应体系中酶与修饰剂的比例,回本章目录,修饰反应专一性的控制,试剂的选择,反应条件的选择,反应的专一性,修饰反应专一性的控制,试剂的选择：选择试剂在很大程度上要依据修饰的目的。选择蛋白修饰应注意问题包括：,1,）修饰反应要完成到什么程度；,2,）对个别氨基酸是否专一；,3,）在反应条件下，修饰反应有没有限度；,4,）修饰后蛋白的构象是否基本保持不变；,5,）是否需要分离修饰后的衍生物；,6,）反应是否需可逆；,7,）是否适合于建立快速、方便的分析方法。,反应条件的选择,不造成蛋白质的不可逆变性,有利于专一性修饰蛋白,4.3,酶分子的修饰方法,金属离子置换修饰,大分子结合修饰,(,共价,/,非共价,),侧链基团修饰,肽链有限水解修饰,氨基酸置换修饰,酶分子的物理修饰,(1),酶的金属离子置换修饰,把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。,-,淀粉酶中的钙离子（,Ca,2+,），谷氨酸脱氢酶中的锌离子,(Zn,2+,),，过氧化氢酶分子中的铁离子,(Fe,2+,),，酰基氨基酸酶分子中的锌离子（,Zn,2+,）,超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子,(Cu,2+,Zn,2+,),若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。,金属离子置换修饰的过程,a.,酶的分离纯化,：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。,b.,除去原有的金属离子,：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（,EDTA,）等，使酶分子中的金属离子与,EDTA,等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将,EDTA-,金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。,c.,加入置换离子,：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。,金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。,用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。,金属离子置换修饰的作用,阐明金属离子对酶催化作用的影响,提高酶的催化效率,增强酶的稳定性,改变酶的动力学特性,(2),酶的大分子修饰,使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过,氢键,固定在酶分子表面，也能通过,氢键,有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。,一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。,另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。,非共价修饰,采用水溶性大分子与酶蛋白的侧链基团,(,共价,),结合使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的特性与功能的方法,用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过,共价键,连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。,例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶，不仅可以,降低或消除酶的抗原性,，而且提高了,抗蛋白酶的能力,，延长了酶在体内的,半衰期,从而提高了酶药效。,每分子核糖核酸酶与,6.5,分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的,2.25,倍；,每分子胰凝乳蛋白酶与,11,分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的,5.1,倍,共价修饰,大分子修饰,(,共价,),的过程,修饰剂的选择,：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（,PEG,）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（,Ficoll,）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。,修饰剂的活化,：作为修饰剂中含有的基团往往不能直接与酶分子的基团进行反应而结合在一起。在使用之前一般需要经过活化，然后才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。,修饰,：将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、,pH,值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。,分离,：需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。,大分子修饰,的作用,通过修饰提高酶的,催化效率,增强酶的,稳定性,降低或消除酶蛋白的,抗原性,聚乙二醇是线性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在体内无毒性、无残留、无免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以与酶产生交联，因而，它被广泛用于酶的修饰。,酶,半衰期,相对稳定性,天然,SOD,6 min,1,右旋糖酐,-SOD,7 h,70,Ficoll(,低分子量,),SOD,14 h,140,Ficoll(,高分子量,),SOD,24 h,240,聚乙二醇,-SOD,35 h,350,可用多种不同试剂活化，修饰不同基团,聚乙二醇均三嗪、聚乙二醇琥珀酰亚胺 聚乙二醇马来酸酐、聚乙二醇胺,(3),酶分子的侧链基团修饰,采用一定的方法（一般为化学法）使酶蛋白的侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。,可以用于研究各种基团在酶分子中的作用及其对酶的结构、特性和功能的影响。在研究酶的活性中心中的必需基团时经常采用。,酶蛋白的侧链基团是指组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。主要包括,氨基、羧基、巯基、胍基、酚基,等。这些基团可以形成各种副键，对酶蛋白空间结构的形成和稳定有重要作用。侧链基团一旦改变将引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的特性和功能。,催化活性,/,非催化活性基团的修饰,对非催化基团修饰可改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的束缚能力。,经常被修饰的残基是：,亲核的,Ser,、,Cys,、,Met,、,Thr,、,Lys,、,His,亲电的,Tyr,、,Trp,对催化活性基团可以通过选择性修饰侧链成分来实现氨基酸的取代。,氨基修饰,采用某些化合物使酶蛋白侧链上的氨基发生改变，从而改变酶蛋白的空间构象的方法称为氨基修饰。,凡能够使蛋白质侧链上的氨基发生改变的化合物，称为,氨基修饰剂,，,主要有：亚硝酸、二硝基氟苯、醋酸酐、琥珀酸酐、二硫化碳、乙亚胺甲酯、,O-,甲基异脲、顺丁烯二酸酐等。这些氨基修饰剂作用于蛋白质侧链上的氨基，可以产生,脱氨基作用,或与氨基共价结合,将氨基屏蔽,起来。例如，用亚硝酸修饰天冬酰胺酶，使其氨基末端的亮氨酸和肽链中的赖氨酸残基上的氨基产生脱氨基作用，变成羟基。经过修饰后，酶的稳定性大大提高，使其在体内的半衰期,延长,2,倍,；用,O-,甲基异脲修饰溶菌酶，使酶分子中的赖氨酸残基上的氨基与它结合，将氨基屏蔽起来，修饰后，,酶活力基本不变,，但稳定性显著提高，而且很,容易形成结晶,。,常见基团的化学修饰反应：氨基,羧基修饰,采用各种羧基修饰剂与酶蛋白侧链的羧基进行酯化、酰基化等反应，使蛋白质的空间构象发生改变的方法称为羧基修饰。,可与蛋白质侧链上的羧基反应的化合物称为,羧基修饰剂,，如乙醇,-,盐酸试剂、碳化二亚胺、异恶唑盐等。,常见基团的化学修饰反应：羧基,胍基修饰,蛋白质分子中,精氨酸,残基的侧链含有胍基。,采用二羰基化合物与胍基反应生成稳定的,杂环,，从而改变酶分子的空间构象的方法称为胍基修饰。,用作胍基修饰剂的二羰基化合物主要有环己二酮、丙二醛、苯乙二醛等。,常见基团的化学修饰反应：胍基,巯基修饰,蛋白质分子中,半胱氨酸,残基的侧链含有巯基。巯基在许多酶中是活性中心的,催化基团,，巯基还可以与另一巯基形成,二硫键,，所以巯基对稳定酶的结构和发挥催化功能有重要作用。,使酶蛋白侧链上的巯基发生改变，从而改变酶的空间构象、特性和功能的修饰方法称为,巯基修饰,。,常用的巯基修饰剂有：二硫苏糖醇、巯基乙醇、硫代硫酸盐、硼氢化钠等还原剂以及各种酰化剂、烷基化剂等。,常见基团的化学修饰反应：巯基,酚基修饰,蛋白质分子的,酪氨酸,残基上含有酚基。使酚基发生改变，从而改变酶蛋白的空间构象的修饰方法称为,酚基修饰,。,酚基修饰的方法主要有碘化法、硝化法、琥珀酰化法等。例如，枯草杆菌蛋白酶的第,104,位酪氨酸残基上的酚基经四硝基甲烷（,TNM,）硝化修饰后，生成硝基酚残基，由于负电荷的引入，使酶对带正电荷的底物的结合力显著增加；葡萄糖异构酶经过琥珀酰化修饰后，其最适,pH,值下降,0.5,单位，并增加酶的稳定性。,常见基团的化学修饰反应：酚基,咪唑基修饰,组氨酸含,有咪唑基，咪唑基多为酶活性中心的必须基团,修饰剂：,碘乙酸、焦炭酸二乙酯,常见基团的化学修饰反应：咪唑基,吲哚基修饰,色氨酸,含有吲哚基，色氨酸残基疏水性强，通常位于分子内部，难于修饰,修饰剂：,N,溴代琥珀酰亚胺,2,羟基,5,硝基苄溴,4,硝基苯硫氯,常见基团的化学修饰反应：色氨酸吲哚基,分子内交联修饰,含有,双功能基团,的化合物（双功能试剂）如戊二醛、己二胺、葡聚糖、二乙醛等，可以在酶蛋白分子中相距较近的两个基团之间形成共价交联，从而提高,酶的稳定性,的修饰方法,(4),酶蛋白主链修饰,(,肽链有限水解修饰,),利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。,主链切断的三种情况：,活性中心破坏,失活,活性中心完整,保持活性，改变抗原性,有利于活性中心的形成,显示活性或活力提高,主链连接,将,两种或两种以上的酶通过主链连接在一起，形成一个酶分子具有两种或多种催化活性。,酶蛋白主链修饰主要是靠酶切,/,酶原激活法。,a,、胃蛋白酶原的激活,b,、胰蛋白酶原（,trypsinogen,）的激活,c,、胰凝乳蛋白酶原（,chymotrypsinogen,）的激活,核苷酸链剪切修饰,某些酶经核苷酸剪切修饰后，由无活性变成有活性的酶。,(5),氨基酸置换修饰,一、定义,：将肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸，引起酶蛋白空间构象的改变，从而改变酶的某些特性和功能的方法。,aa,是酶的化学结构和空间结构的基础。,二、,aa,置换修饰酶的作用,2,、增强酶的稳定性,1,、提高酶活力,3,、使酶的专一性发生改变：,酪氨酰,-tRNA,合成酶：催化,Tyr,和所对应的,tRNA,合成酪氨酰,-tRNA,。该酶的,Thr51,若被,pro,置换，酶对,ATP,的亲和性提高近,100,倍，酶活力提高,25,倍。,T4-,溶菌酶：,Ile3,被,Cys,置换后，,Cys-3,可与,Cys-97,形成二硫键，置换后的,T4-,溶菌酶，其活力保持不变，但该酶的稳定性却大大提高。,枯草杆菌蛋白酶,:,活性中心上的,Ser,置换成,Ile,后，酶对蛋白质和多肽的水解活性消失，而出现催化硝基苯酯进行水解反应的活性。,氨基酸置换修饰方法,氨基酸或核苷酸的置换修饰可以采用化学修饰方法，例如，,Bender,等成功地利用化学修饰法将枯草杆菌蛋白酶活性中心的丝氨酸转换为半胱氨酸，修饰后，该酶失去对蛋白质和多肽的水解能力，却出现了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化学修饰法难度大，成本高，专一性差，而且要对酶分子逐个进行修饰，操作复杂，难以工业化生产。,现在常用的氨基酸置换修饰的方法是,定点突变技术,。定点突变（,site directed mutagenesis,）是,20,世纪,80,年代发展起来的一种基因操作技术。是指在,DNA,序列中的某一特定位点上进行碱基的改变从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程（,Protein Engineering,）和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。定点突变技术，为氨基酸或核苷酸的置换修饰提供了先进、可靠、行之有效的手段。,酶分子的定点突变,1,、酶分子结构设计（根据已知的酶结构和其存在的问题）,2,、突变基因序列的确定（考虑物种差异）,3,、突变基因的获得（,DNA,合成仪,PCR,）,4,、新酶的获得（重组、转入宿主、表达）,核苷酸置换修饰,将酶分子核苷酸上的一个核苷酸换成另一个核苷酸的修饰方法，称为核苷酸置换修饰。,核苷酸置换修饰通常采用,定点突变,技术,(6),酶分子的物理修饰,通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端,pH,值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。,特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。,回本章目录,4.4,酶修饰后的性质变化,热稳定性,：一般来说，热稳定性有较大的提高。,抗原性,：比较公认的是,PEG,和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比较明显。,各类失活因子的抵抗力,：修饰酶对蛋白酶、抑制剂均有一定的抵抗能力，从而提高其稳定性。,半衰期,：一般在体内的半衰期得到有效延长。由于酶分子经修饰后，增强对热、蛋白酶、抑制剂等的稳定性，从而延长了在体内的半衰期。,最适,pH,：大部分酶经化学修饰后，酶的最适,pH,发生了变化，这种变化在应用研究上有时具有重要意义。修饰酶最适,pH,更接近于生理环境，在临床应用上有较大意义。,Km,的变化,：大多数酶经修饰后，,Vm,没有明显变化，但有些酶经修饰后，,Km,值变大。,回本章目录,4.5,酶的定向进化,一、概念,分子定向进化,：,是在试管中模拟达尔文进化的过程，对蛋白质（酶）的编码基因利用,随机突变和随机杂交,的方法加以,改造,，通过大规模,筛选,技术，从而得到性能上改良的优异变种。使蛋白质（酶）在自然界需要几百万年才能完成的进化过程缩短至几个月，为蛋白质（酶）的工程应用提供了一个强有力的技术手段。,属于蛋白质的,非合理设计,，它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变，基因重组和自然选择），在体外改造没，并定向选择（筛选）出所需要性质的突变酶。,可以促使群体生物大分子向,任意功能,目标计划，从而获得或改良功能大分子。,二、基本原理,合理设计与非合理设计,：,在比较充分了解酶的结构和功能的基础上对酶分子进行改造，称为,合理设计,；,不需要准确的酶分子结构信息，通过随机突变，基因重组，定向筛选等方法对其进行改造，称为酶分子的,非合理设计,。,基本技术手段：易错,PCR,，,DNA,重组，高突变菌株等技术。,酶的,合理设计,实验室定向进化示意图,随机突变,+,定向选择目标突变体,细菌,诱发,突变,的因素,50,0,C,培养,突变体库,选择压力,（温度）,温度耐受型突变体,最适生长温度为,37,0,C,最适生长温度提高了！,体外定向进化的意义,理论上，蛋白质分子蕴藏着很大的进化潜力，很多功能有待于开发，这是酶的体外定向进化的基本先决条件。,天然酶在生物体内存在的环境与商业用酶的实际应用环境不同。,人们需要某些酶的进化性质与生物体内的生化反应无关，而只是与人们的商业需求有关，这种性质只能通过体外进化来实现。,实际应用中，总是期待酶,活性,和,稳定性,越高越好，但在生物体内更重要的是各种生物分子之间的协同作用，作为一个,整体,来适应环境,。对于,酶分子来说，其活性和稳定性已经超过了满足整个体系在环境中生存的需要时，它们的提高就显得没有必要了，也就是失去了进化的筛选压力，因此进化的机会很有限，这就为,体外定向进化,留下了很大的进化空间。,酶定向进化的基本过程,基因的随机突变,+,定向选择,酶基因,随机突变,构建突变基因文库,筛选,负突变基因,正突变基因,进化酶,反复进行,易错,PCR,DNA,重排,基因家族重排,平板筛选法,荧光筛选法,噬菌体表面展示法,细胞表面展示法,核糖体表面展示法,高通量筛选技术,三、酶分子定向进化的方法,1,、易错,PCR,：,易错,PCR,是在采用,Taq,酶进行,PCR,扩增目的基因时，通过调整反应条件，使得扩增产物具有适当的错配，也就是产生,适当的突变频率,。将扩增产物制做成表达型突变基因文库，再从中筛选出所需的突变基因。,适当的突变频率,突变频率不能太高，也不能太低，理论上每个靶基因导入的取代残基在,1.5,5,个为宜。通常经一次突变的基因很难获得满意的结果，常需要进行连续易错,PCR,。,连续易错,PCR,：,即将一次,PCR,扩增得到的有用突变基因作为下一次,PCR,扩增的模版，连续反复地进行随机诱变，使每一次获得的小突变积累而产生重要的有益突变。,易错,PCR,法,连续易错,RCR,易错,PCR,效果举例,Chen,和,Arnold,用此策略定向进化,枯草杆菌蛋白酶,E,的活性获得成功，所得突变体,PC3,催化效率,k,cat,/K,m,分别是野生型酶的,157,倍,；将,PC3,再进行两个循环的定向进化，产生的突变体,13M,的,k,cat,/K,m,又比,PC3,提高了,3,倍，达到天然酶催化效率的,471,倍,。,2,、,DNA,改组技术,DNA,改组（,DNA shuffling,）,技术又称,DNA,重排技术，是从两种以上的,同源正突变基因,出发，用,酶切成随机片段,，经过不加引物的,多次,PCR,循环,，使,DNA,的碱基序列,重新排布,而引起,基因突变,的技术过程。,此方法又称为,有性,PCR(Sexual PCR),通过将,亲本基因群,中的突变尽可能组合在一起,以导致更大的变异,最终获得具有最佳突变组合,DNA,改组,DNA,改组效果举例,1994,年由,Stemmer,等人首次提出，使用该技术使,-,内酰胺酶定向进化，催化效率提高,32000,倍。,人们运用类似的方法对水母的绿色荧光蛋白进行定向进化，,3,轮,DNA,改组循环后，得到的突变绿色荧光蛋白的荧光信号比起始蛋白高,45,倍,。,OsamuShimomura,MartinChalfie,RogerY.Tsien,（钱永健）,2008,年,10,月,8,日，美,WoodsHole,海洋生物学实验室的下村修、哥伦比亚大学的马丁,-,沙尔菲和加州大学圣地亚哥分校的钱永健三位美国科学家，因为在水母中发现和研究绿色荧光蛋白而获得,2008,年诺贝尔化学奖。,维多利亚多管水母（,Aequoreavictoria,）,改进,GFP,的应用前景,蓝色荧光蛋白、青色荧光蛋白，绿色荧光,蛋白,，黄色荧光蛋白，褐色。,1.,提高了,GFP,的光谱性质，,2.,提高荧光强度,3.,提高光稳定性,4.,颜色突变,5.pH,敏感的突变体,应用,GFP,研究成果,美新奥尔良科学家培育出世界首只能在“黑暗处发光”的猫,杰夫,利希曼利用荧光蛋白展现了大脑内的连接，图片中美丽的“彩虹”就是神经系统网络,1997,年在大阪大学降生的第一种发光哺乳动物小老鼠,两只荧光猪诞生于中国黑龙江省哈尔滨东北农业大学的实验室,约克镇科技公司生产的荧光鱼引入市场，荧光蛋白便迅速在商业上得到应用,用不同的“荧光蛋白”让未知世界显影,3,、交错延伸法,交错延伸,PCR,(Stagger extension process PCR,，,StEP),是在,PCR,反应中,将,含不同点突变的模板（两个或多个,DNA,片段）,混合,将常规的退火和延伸合并为一步,并大大缩短其反应时间（,55,，,5s,）,从而只能合成出非常,短的新生链,经变性的,新生链再作为引物,随机地杂交到含不同突变的模板上,继续延伸,此过程反复进行直至获得,全长基因,。结果会产生,间隔的含不同模板序列,的新生,DNA,分子。,StEP,过程,1,个引物,2,个模板,退火结合,延伸产生短片段,短片段为引物与模板退火结合,继续延伸片段至全长的基因长度,分离全长基因，加入外源引物扩增全长基因。,4,、体外随机重组法,随机引物体外重组技术（,random-priming in vitro recombination,，,RPR,）采用,单链,DNA,为模板,，配合,若干条随机序列引物,进行,PCR,反应，产生大量互补于模板不同位点的,DNA,小片段,，然后除去模板，这些,DNA,小片段互为模板和引物,进行扩增，通过碱基序列的重新排布而获得全长突变基因。,5,、基因家族重排技术,基因家族重排技术,（,gene family shuffling,）又称基因家族改组技术，是从基因家族的,若干同源基因,出发，用酶（,DNase I,）切割成随机片段，经过,不加引物的多次,PCR,扩增,，使,DNA,碱基序列,重新排布,而引起,基因突变,的技术过程。,81,/138,82,/138,DNA shuffling,与,Family shuffling,：,基本过程大致相同,出发基因不同,基因家族同源重组效果举例,Stemmer,等从,4,种微生物中选择编码头孢菌素酶的,4,个同源基因，对它们进行,单独进化,或,同源重组,进化，来对两种进化模式进行比较。在对单基因进化得到的进化酶中，对头孢羟羧氧胺的抗性最高的增加了,8,倍,，而用家族同源重组进化的方法得到的进化酶比两种天然酶提高了,270,倍,，比另两种天然酶提高了,540,倍,。,四、酶突变基因的定向选择,突变基因的定向选择基本过程,突变基因,基因载体,突变基因文库,基因重组,筛选,目的基因,（一）,酶突变基因文库的构建,1,、,构建基因文库的质量要求,文库的,包容性,:,指构建的文库必须尽可能地包含基因的任何一种可能的突变信息。,文库的,完整性,：指文库中包含的,DNA,片断必须尽可能完整地反应基因的结构和功能信息，以便通过筛选得到的突变基因能够通过表达获得完整的具有催化功能的进化酶。,2,构建突变基因文库的主要过程,载体的选择,1,）质粒载体：微生物细胞染色体外，闭合环状双链,DNA,分子。,2,）噬菌体,DNA,载体：由噬菌体,DNA,改造而成的具有自我复制能力的载体。,3,）黏粒载体：是一类人工构建的含有,DNA,黏性末端和质粒复制子的质粒载体，又称为柯斯质粒。,4,）噬菌粒载体：是一类人工构建的由,M13,噬菌体单链,DNA,的基因间隔区与质粒载体结合而成的基因载体。,基因重组,在体外通过,DNA,连接酶的作用，将基因与载体连接在一起形成重组,DNA,的技术过程。,黏性末端连接,平头末端连接,修饰末端连接,形成基因文库,突变文库的组装是将,重组,DNA,转入受体细胞,或,包装成有感染活性的重组噬菌体,的过程。,大肠杆菌转化技术,（二）突变基因的筛选,1,定向选择环境条件的设定,根据定向进化的,设定选择环境,在每一次“突变,筛选”的循环中加以,调整选择环境,（,1,）,提高酶的热稳定性,：,较高温度下培养重组细胞，每次循环提高温度。,（,2,）,提高,-,内酰胺酶的催化效率：,一定浓度的,-,内酰胺类抗生素中培养，每次提高,浓度,2,高通量筛选技术,平板筛选法,荧光筛选法,噬菌体表面展示法,细胞表面展示法,核糖体表面展示法,平板筛选法,平板筛选方法,是将含有随机突变基因的,重组细胞,，涂布在,平板培养基,上，在一定条件下培养，依据重组菌细胞的表型鉴定出有效突变基因的筛选方法。,特点：,简便、,快速,、,直观,、容易控制和调整环境条件,依据：,重组细胞的表型,细胞生长情况,颜色变化情况,透明圈情况,（,1,）依据细胞生长情况筛选突变基因,热稳定性：温度梯度和高温环境,抗生素耐受性：抗生素浓度梯度,pH,稳定性：,pH,梯度,极端环境：高盐、低温、高浓毒物质,（,2,）依据颜色变化筛选突变基因,反应产物显色,蓝白斑筛选（,Blue white screening）,：,诱导物：,IPTG,底物：,X-gal,95,/138,磷酸酯酶水解硝基酚磷酸生成,黄色硝基酚,；,96,/138,Homogenized activated sludge sample cultured on 1/10-strength LB plates amended with,CPQP,and viewed with(A)white light and(B)fluorescent light revealing colony with halo(arrow 1)and no halo(arrow 2).,（,3,）依据透明圈情况筛选突变基因,依据透明圈情况筛选突变基因是在平板培养基中加入目的酶的作用底物，然后接种重组细胞，在一定条件下进行培养，培养一段时间后，在一些重组细胞的菌落周围会出现较大的透明圈。,豆豉纤溶酶（,douchi fiberolytic enzyme,，,DFE,）,血纤维蛋白平板（,blood agar,）,荧光筛选法,噬菌体表面展示法,细胞表面展示法,核糖体表面展示法,某些酶定向进化结果,99,/138,目标酶,所需功能,方法,结果,实施菌种,卡那霉素核苷基转移酶,热稳定性,定位诱变,+,选择,在,60-50,酶半衰期增加,200,倍,耐热脂肪芽孢杆菌,枯草杆菌蛋白酶,作用于有机溶剂,易错,PCR+,选择,在,60,二甲基亚砜中活力增强,170,倍,枯草杆菌,-,内酰胺酶,作用于新底物,DNA,改组,+,选择,对,cefotaxime,的抗性增加,32000,倍,大肠杆菌,对硝基苯酯酶,有机溶剂中的底物特异性和活性,易错,PCR+,重组,活力增加,60-150,倍,大肠杆菌,胸苷激酶,第五特异性 基因理疗,交错延伸,+,选择,活力增加,43,倍,大肠杆菌,-,半乳糖苷酶,底物特异性,DNA,改组,+,选择,活力增加,66,倍底物特异性增加,1000,倍,大肠杆菌,砷酸脱毒途径,砷酸抗性,DNA,改组,+,选择,抗性增加,12,倍,大肠杆菌,1,、,提高酶的催化活性,是定向进化的主要目标之一,例如：,1993,年陈等人提高,枯草杆菌蛋白酶,E,在有机溶剂中的催化效率（,157,倍）,1994,年,Stermer,使,-,内酰胺酶,催化活性提高,32000,倍,1992,年,Beaudry,等使,四膜虫,RNA,剪切酶,提高,100,倍,100,/138,五 酶定向进化的应用,2,、增强酶的稳定性,提高酶稳定性的方法：,分子修饰,固定化,非水相介质催化,定向进化,101,/138,3,、改变酶的底物特异性,影响酶对底物的,Km,值，进而改变底物特异性,例如：,2000,年，,Aharoni,等采用基因家族重排技术将,大肠杆菌碱性磷酸酶,对有机磷酸酯的特异性提高,2000,倍,2005,年，,冯志勇,等采用易错,PCR,技术使,-,糖苷酶,失去原有的催化糖苷水解的活性，而呈现糖基转移酶的活性,2002,年，,Bartel,使,RNA,剪切酶,失去催化,RNA,分子剪切反应的特性，而呈现出将,RNA,和多肽链拼接在一起的催化特性。,102,/138,103,/138,