蛋白质组学与分析技术第二讲.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,蛋白质组学的概念,蛋白质组学是研究与基因对应的蛋白质组的学科，,蛋白质组学（,proteomics）:Marc Wilkins 20,世纪90年代早期提出的，有“基因组学”,（,genomics）,和蛋白质（,protein）,组合而成。,蛋白质组学的研究是生命科学进入后基因时代的特征,蛋白质组学与分析技术特点,内容多,：蛋白质组作图、蛋白质组成分鉴定、蛋白质组数据库构建、新型蛋白质发掘、蛋白质差异显示、同工体比较、基因产物识别、基因功能鉴定、基因调控机制分析、细胞周期、细胞分化与发育、肿瘤发生与发展、环境反应与调控、物种进化、新型药物靶分子、人体病理介导分子、病原菌毒性成分、植物信号识别、植物诱导抗性、免疫增产激发子、抗虫蛋白晶体、植物病害毒素、植物致病相关蛋白等等。,蛋白质组学与分析技术特点,分析技术面广,：氨基酸组分、序列测定；,SDS-,聚丙烯酰胺凝胶电泳；毛细管电泳；高效液相色谱；质谱；液质联仪；毛细管电泳-质谱联用；双向凝胶电泳；蛋白质芯片；蛋白质生物信息学；蛋白质结构与功能；园二色谱；,X,光衍射；高能辐射；蛋白质杂交技术；蛋白质酶学技术,蛋白质组学分析中蛋白质的分离和消化,蛋白质组分析的基本流程图,蛋白质组研究的技术路线流程图,蛋白质的分离与纯化,样品制备原则,1，尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢失,2，细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解，低温和蛋白酶抑制剂可以防止蛋白的降解,样品裂解液应该新鲜制备、并且分装冻存于-80,C,不要反复冻融已制备好的样品,通过超速离心清除所有的杂质,加入尿素之后加温不要超过37,C,防止氨甲酰化而修饰蛋白,从生物样品抽提蛋白质,去污裂解：溶解细胞膜裂解细胞如,SDS,还原剂：用于还原二硫键或防止蛋白质氧化如巯基乙醇、硫脲,变性剂：用于改变溶液离子强度和,PH，,破坏蛋白质的二级和三级结构,酶裂解：用酶来消化细胞器如溶菌酶、纤维素酶、果胶酶等,渗透裂解：用低渗溶液悬浮细胞,冻融裂解：用液氮迅速冷冻细胞，随后在37,C,融化，反复几次,剧烈的蛋白裂解,超声裂解法：通过超声波切应力来裂解细胞，在剧烈的搅拌状态下会产生剪切效果,弗氏压碎器：在高压下迫使细胞穿过小孔径产生剪切力裂解细胞,研磨法：组织和细胞常冻存于液氮中，研磨成粉状,机械匀浆法：将组织切成小片、匀浆、过滤或离心获得裂解液,玻璃珠匀浆法：剧烈震荡的玻璃珠可以打破细胞壁，释放细胞内容物,蛋白酶抑制剂防止蛋白裂解,苯甲基磺酰氟,PMSF:,不可逆抑制剂,AEBSF：,灭活丝氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶,金属蛋白酶抑制剂乙二 胺四乙酸（,EDTA）、,乙二醇双四乙酸(,EGTA),肽蛋白酶抑制剂：亮以酶肽，抑制丝氨酸、半胱氨酸蛋白酶活性，为蛋白酶抑制剂,A,抑制酸性蛋白酶活性，抑蛋白酶肽抑制丝氨酸蛋白酶，本丁抑制素抑制氨基蛋白酶。,甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮（,TLCK）、,甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（,TPCK）:,不可逆抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶。,Benzamidine:,抑制丝氨酸蛋白酶,蛋白沉淀步骤,硫酸铵沉淀（盐析）：高盐溶液中蛋白质聚合而沉淀,TCA,沉淀（三氯醋酸沉淀）：,TCA 10%-20%，,蛋白质可冰上沉淀，用丙酮和乙酸清洗沉淀。去除,TCA,丙酮沉淀：3倍体积的冰丙酮，蛋白在-20度沉淀，离心沉淀蛋白，丙酮通过空气或冻干去除,在丙酮中用,TCA,三氯醋酸沉淀：两者联合使用更有效，10%的,TCA,在丙酮中重悬裂解样品溶液,用苯酚提取，随后在甲醇中醋酸铵沉淀：蛋白质被提取到饱和酚中，在甲醇中用醋酸铵从酚相中沉淀蛋白，丙酮清洗,清除影响二维电泳图谱的杂质,盐离子、痕量缓冲液和其他带电荷的小分子：盐离子会干扰电泳，可以透析去除,内源性小分子（如核酸、代谢物和磷酸）：这些物质带负电荷，发生偏阳极侧聚焦不全，用,TCA/,丙酮沉淀去除,离子去污剂：,SDS,与多肽形成复合物，不能正确聚焦，通过丙酮沉淀可去除,SDS,核酸（,DNA、RNA）：,核酸增加样品的黏度导致背景弥散，核酸通过电稳态相互作用也蛋白结合阻碍聚焦，核酸在银染检测中导致高背景,多糖：阻碍凝胶孔径导致沉淀，多糖含有负电荷与蛋白质形成复合物，用硫酸铵或苯酚/醋酸铵沉淀去除多糖,脂类：蛋白质与脂类形成复合物影响等电点和分子量，用强变性剂和去污剂减少蛋白与脂类的相互作用,酚类组分：苯酚通过酶催化的氧化反应来修饰蛋白，用巯基乙醇或硫脲来灭活多酚氧化酶,裂解液的组分,为了完成聚焦良好的第一项等电聚焦，蛋白质必须完全溶解和解聚,经过变性剂处理而暴露蛋白质的疏水基团后，还常需至少一种表面活性剂来溶解疏水基团。,常用的表面活性剂有离子去污剂,SDS,、非离子去污剂,Triton X-100,和,NP-40,、两性离子去污剂,CHAPS,、,OBG,等。,SDS,作用后不利于稳定,IEF,中的等电点，不宜存在于,IEF,的样品溶解液中；只有后两类表面活性剂是可用的，其中,CHAPS,和,SB3-10,最好。,常用浓度为在,8M,尿素溶液中含,2-5%,的,CHAPS,，但在含高浓度硫脲的溶液中其作用有限；,SB3-10,是一种含有长线性基团尾端的两性去污剂，其作用要强于,CHAPS,，但在尿素浓度大于,5M,时不溶解。,完整蛋白质的分离,1D-SDS-PAGE,2D-SDS-PAGE,IEF(制备等电聚焦),HPLC,离子交换或亲和层析,聚丙烯酰胺凝胶电泳,通过丙烯酰胺单体和,N，N,，,-,甲叉双丙烯酰胺按一定比率混合，在有引发剂和增速剂存在下聚合形成交叉网状结构，丙烯酰胺单体聚合生成长链聚合物，甲叉双丙烯酰胺的双功能和链末端的自由功能基团反应，发生交联，形成网状结构,等电聚焦凝胶，按等电点不同分离蛋白质，,SDS-PAGE,按相对分子质量大小分离蛋白质,实验样品的制备原则,应使所有待分析的蛋白样品全部处于溶解状态（包括多数疏水性蛋白），且制备方法应具有可重现性。,防止样品在聚焦时发生蛋白的聚集和沉淀。,防止在样品制备过程中发生样品的抽提后化学修饰（如酶性或化学性降解等）。,完全去除样品中的核酸和某些干扰蛋白。,尽量去除起干扰作用的高丰度或无关蛋白，从而保证待研究蛋白的可检测性。,1D-SDS-PAGE,一维等电聚焦电泳,蛋白质在不同,PH,值的溶液中带电荷情况是不同的，在低的,PH,条件下，蛋白质静电荷为正，在高,PH,条件下静电荷为负，在某一,PH,的溶液中，蛋白质的静电荷为零，则此,PH,值为该蛋白的等电点,蛋白质等电点取决与氨基酸的组成，是一个物理化学常数,如果外加一个电场，蛋白质会在电场作用下分别向正极和负极漂移，当达到等电点位置时，蛋白不带电，就不在漂移，这就是等电聚焦电泳的基本原理,2D-SDS-PAGE,第一向,IEF,电泳,染色,第二向,SDS-PAGE,电泳,图像采集和分析,蛋白斑点的切取,样品制备,二维电泳原理,Smithies和Poulik(1956)最早引入二维电泳技术，OFarrell（1975）根据蛋白质的等电点和相对分子质量的特异性将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离，在第二个方向上按照相对分子质量大小进行分离,二维电泳分离后的蛋白质点经显色，通过图象扫描存档，最后是呈现出来的是二维方向排列的，呈漫天星状的小原点，每个点代表一个蛋白质,胶上蛋白的检测,蛋白质检测常用考马斯亮蓝染色,银染,负染,荧,光标记、同位素标记，提高灵敏度和自动化水平,考马斯亮蓝染色,检测30-100ng的蛋白质，考染程序,染色：45%甲醇/10%冰醋酸/0.1%考马斯 亮蓝,染色30分1小时,脱色：10%冰醋酸水溶液,保存：用保鲜膜包裹 或置成干胶,银染,银染是非放射性染色方法中灵敏度最好的，其灵敏度可达200,pg,凝胶在固定液中固定后，在含戊二醛的溶液中增敏，然后在,AgNO,3,溶液中浸泡，蛋白与银结合，银颗粒沉淀在蛋白点上，沉淀的银颗粒产生催化反应，提高银染反应灵敏度，使蛋白点显示棕黄色或棕黑色,负染,负染是一种可逆染色方法，其灵敏度高于考染低于银染，准备从胶上回收蛋白可选用此方法，负染有铜染、锌-咪唑等，灵敏度可达50 ng。负染在凝胶表面可产生半透明背景，蛋白质以透明的形式被检测出来，凝胶显示黑色背景或相应的底色，染色过程很快，5-15min即可完成,荧光染色,利用丙基Cy3和甲基Cy5两种染料分别对不同蛋白质样品进行荧光标记，并在一块2-D胶上同步运行，由于两种修饰后的染料的激发波长不同，在同一块胶上可用两个波长范围进行扫描，并可得到两个样品的差异，灵敏度比银染要高3-30倍,另一荧光染料是SYPRO Ruby，它是基于钌的金属螯和染料，灵敏度为0.25-1ng,存在的问题,低丰度蛋白质的检测,高丰度蛋白的去除,极酸和极碱性区蛋白的分离：,pH,11,高分子质量区蛋白的分离：100 000,Da,以上的蛋白质很难进入胶条,膜蛋白的提取和有效分离,需要一种真正高通量的胶上蛋白质鉴定技术,低丰度蛋白的分离：,尽管增加上样量和提高总蛋白的溶解度能增加分离时的低丰度蛋白的量，但同时增加了高丰度蛋白的负荷，且造成蛋白的叠加效应而影响分离。现常用预分级窄,pH,胶的微制备技术进行分离：即将总蛋白组分成蛋白质组亚群，再用,pH,梯度小于,2,个,pH,单位的,IPG,胶进行窄,pH,范围的分离。,高不溶性蛋白的分离：,主要还是要增加蛋白质的溶解度，采用顺序抽提法进行。,碱性蛋白：,先将蛋白预处理以富集，再用特殊,pH,梯度的,IPG,胶条（如,pH3,12,、,4-12,或,10-12,）进行等电聚焦。其中窄范围碱性,IPG,胶（如,pH10-12,）的挑战是克服反向、阴极向阳极、电渗流和水平条纹模式，而宽范围的碱性,IPG,胶（如,pH3-12,、,4-12,）等消除了窄范围胶所需要的专门水化液。,极端分子量的蛋白质：,小于,8kD,和大于,200kD,的蛋白在常规,IPG-2D,上不易看到，这可能是在常规,Tris,/,甘氨酸缓冲液中，样品和缓冲液中游离的,SDS,离子将持续积累浓缩，与小分子量的蛋白质发生对流混合，产生茸毛状的或模糊的带，从而降低小蛋白的分辨率；在胶底端，高浓度的十二磺酸使蛋白固定致染色困难。至于高分子量蛋白少的原因可能是在变性条件下，蛋白质复合物变成了多肽，或者可能是大分子。,2D-SDS-PAGE 存在的问题,一维电泳相同蛋白质迁移的任何不同可能会被误认为是样品中含有不同蛋白质,蛋白质的脱酰胺化、糖基化、磷酸化、氧化、外源化学修饰等是相同多肽的不同修饰可能显现为“点横向排列”,某些蛋白质不太适于进行第一维,IEF,电泳，,低溶解度导致蛋白质沉淀和聚集，造成在,IPG,胶条中蛋白质的“成片条带”,在,IEF(,水平)方向显示蛋白质“成片条带”的部分2,D,凝胶,由于相同蛋白质的不同修饰/电荷显示“点横向排列”的部分2,D,凝胶,蛋白质电泳图像分析,电泳凝胶后图象进行备份保存，从而以数字化图象形式存储下来，尽量完整的保留定性和定量信息以进一步分析，如总蛋白的点数，蛋白点的表达丰度的电量变化，蛋白点的缺失，利用双向电泳凝胶分析软件进行分析,二维凝胶电泳图像采集,图象分析基本上依赖与各个蛋白质点的光密度值相对大小,图象采集质量的因素包括系统的分辨率、灵敏度、图象对比度和明亮度,常见的可见光扫描仪、荧光、化学发光和磷屏扫描仪,二维凝胶电泳图像分析,蛋白质点数的统计、蛋白质点的定位、编号和相对丰度分析,软件可自动检测出完整的蛋白质点，图象分析软件有：melanie II&3、PDQuset 6.0、ImageMaster 2D Elite 3.10、Phoretix 2D 等,蛋白质点检测、背景消减、归一化处理、蛋白质点匹配,蛋白质点检测,定位、点的形状确定及点的体积和面积的计算,两种点检测方法：自动执行（通过软件识别凝胶中的蛋白质点）和手动执行（选定一个代表区域，点检测的执行情况，选择最满意的格子，消除背景最后得到点检测结果）,背景消减,背景值叠加到点体积中，使蛋白质点体积值与实际值相比略微偏高，分析软件可对背景进行消减处理,归一化处理,对点体积进行归一化处理，以对不同胶上同一蛋白质点进行准确客观的相对定量，归一化处理有两种模式。一种基于全部点体积之和，以每个点的体积除以总和，另一模式是基于某一点，该点可能是一已知的标准蛋白或认为添加的数值,归一化处理后的数据是否合理决定着图象分析数据统计学分析的可靠性,蛋白质点匹配,匹配是要创建参考凝胶，分析比较一种凝胶中的一张，也可以是几张凝胶合并而成的平均胶，通过改变向量框和搜索框的大小来操纵匹配，得到较好的匹配效果，自动匹配功能无法找到匹配的点可进行人工匹配,结果输出,双向电泳图象分析会产生大量的数据，以表格的形式输出或粘贴到Microsoft Excel软件中去，检测结果还可生成凝胶报告和蛋白质点报告，包括图象和列表，对每一个蛋白质点在胶上的纵横坐标的变化进行统计分析，得到凝胶之间位置的差异，对双向电泳的重复性进行评价,二维电泳蛋白谱数据库,通过远程关键词搜索可以调处目的蛋白质；,数据库可以通过超文本交叉参考而与其他数据库链接；,除了单个可查询数据库外，每个蛋白链连接点需要链接一个不同的交叉参考数据库目录；,通过点击胶上蛋白点可以调出单个蛋白相关信息；,双向电泳分析软件可以设定直接进入联合电泳数据库,高效液相层析,高效液相层析可进行各种分离，包括阴离子和阳离子交换，大小排阻和亲和层析，从复杂混合物中分离某中蛋白质组分,肽分离,把全部细胞或组织初提物消化成肽，然后进行肽混合物的MS分析，将非常不均一的蛋白质混合物转换成更容易分析的较均一的肽混合物,蛋白质消化技术,第一，蛋白质的质量越大，觉得误差值越大，蛋白质翻译后修饰使质量测定更为复杂,第二，,MS,对大分子蛋白质和疏水蛋白质很难进行质量测定,第三，完整蛋白质质量测定的灵敏度远低于肽质量测定和肽串联,MS,分析的灵敏度,目的：产生最适于,MS,分析片段（6-20个氨基酸的肽）,蛋白酶,蛋白酶及其切割专一性,蛋白酶,胰蛋白酶：在赖氨酸和精氨酸残基位点上切割蛋白质,Glu-C(V8,蛋白酶)：是内切蛋白酶，切割谷氨酸残基的羧基侧或天冬氨酸残基,其他蛋白酶和切割试剂：,LysC、,胰凝乳蛋白酶等在一个氨基酸（酪氨酸、笨丙氨酸和色氨酸）位点切割的酶产生几个大片段,非专一性蛋白酶：胃蛋白酶、蛋白酶,K,和链霉蛋白酶可或多或少随机切割蛋白质产生多个重叠肽,在凝胶中消化蛋白质,