二苯乙烯类化合物对胰岛素抵抗HepG2细胞糖脂代谢紊乱的改善作用.pdf

网络出版时间：网络出版地址：内分泌药理学二苯乙烯类化合物对胰岛素抵抗 细胞糖脂代谢紊乱的改善作用马宏婷，铁芳芳，王瑞楠，胡娜，王洪伦，何彦峰（青海民族大学药学院，青海 西宁 ；中国科学院西北高原生物研究所，青海 西宁 ）收稿日期：，修回日期：基金项目：青海省基础研究计划项目（）；国家自然科学基金资助项目（）作者简介：马宏婷（），女，硕士生，研究方向：药理学，：；何彦峰（），男，博士，副教授，硕士生导师，研究方向：天然产物研究与开发，通信作者，：文献标志码：文章编号：（）中国图书分类号：；摘要：目的探讨 个二苯乙烯类化合物对胰岛素抵抗（，）状态 细胞糖脂代谢的影响。方法高糖高脂复合物诱导 细胞建立胰岛素抵抗模型后，法检测细胞活力；试剂盒检测细胞内甘油三酯（，）和葡萄糖含量；油红 染色法观察细胞脂质积累，共聚焦显微镜观察细胞对葡萄糖的摄取；采用 检测 信号通路和 胰岛素信号通路相关蛋白的表达，探讨二苯乙烯类化合物对 细胞糖、脂质代谢的影响。结果 葡萄糖和 油酸组成的复合物诱导 细胞 成功建立 模型。与模型组相比，个化合物均能不同程度地降低细胞中 含量和脂质积累，并能提高细胞对葡萄糖的摄取能力。各化合物可显著抑制 细胞过氧化物酶体增殖物激活受体（，）等脂代谢相关蛋白的表达水平，同时上调磷酸化磷脂酰肌醇激酶（，）等糖代谢相关蛋白表达，其中土大黄苷和白藜芦醇效果最为显著。结论个二苯乙烯类化合物尤其是土大黄苷和白藜芦醇改善 细胞的 ，可能与其调节细胞糖脂代谢紊乱有关，作用机制可能与调控 等脂代谢相关蛋白的表达和激活 通路有关。关键词：二苯乙烯类化合物；胰岛素抵抗；糖脂代谢；开放科学（资源服务）标识码（）：胰岛素抵抗（，）是由多种因素导致的胰岛素作用的靶器官对胰岛素的敏感性和（或）反应性降低的一种病理性生理状态。临床上以高胰岛素血症、高血糖和高脂血症为主要表现 。在 初期，胰岛 细胞功能完整，胰岛 细胞可以通过代偿性地分泌更多的胰岛素来弥补其作用的不足，但随着 效应持续存在或加重，胰岛 细胞功能逐渐衰竭，进而引起机体糖脂代谢紊乱和型糖尿病（，）的发生 。因此，对于 患者早期进行胰岛素抵抗的干预，被认为是最为有效的治疗 的策略。信号通路是经典的胰岛素信号通路，其在肝脏、脂肪组织和骨骼肌对葡萄糖的摄取中发挥重要作用 。在肝脏中，胰岛素抑制关键糖异生酶的表达导致肝葡萄糖生成升高引起 ；在脂肪组织中，受胰岛素调节的葡萄糖转运蛋白 （，）水平在 状态下降低 。途径在细胞生长、衰老、凋亡及糖脂质代谢过程中起着重要作用，磷脂酰肌醇激酶（，作为二级信使和脂质激酶，可参与调节脂肪细胞分化的关键转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体（，）、增强子结合蛋 白（，）以及激活下游蛋白激酶 （，）信号通路 。通过激活雷帕霉素靶蛋白（，），使葡萄糖在体内的摄取与代谢保持平衡，该途径的缺陷会导致各种疾病。从中草药和植物中开发安全有效的糖脂调控小分子化合物具有广阔的应用前景。二苯乙烯类成分又称芪多酚，是植物在真菌感染、紫外线照射、机械损伤等不利条件下产生的一种植物抗毒素 。药理学研究发现，该类成分如土大黄苷（，）、脱氧土大黄苷（，）、丹叶大黄素（，）和白藜芦醇（中国药理学通报 ；（）：，）等具有良好的抗肿瘤、抗炎、抗肺纤维化、抗血栓、抗阿尔茨海默病等活性 。研究发现，、和 等可改善脂肪细胞的胰岛素敏感性。等 发现，能有效降低糖尿病小鼠血糖水平，并明显改善了肝脏脂肪变性。临床试验发现，可改善 血糖水平。通过前期文献调研发现，二苯乙烯类化合物能够改善 引起的糖脂代谢紊乱，但具体作用机制仍不清楚。因此，本实验利用葡萄糖和油酸复合物诱导 细胞建立 细胞模型，考察 、和 对 状态 细胞糖脂代谢紊乱的影响并探讨其可能的作用机制。材料与仪器 材料与试剂人肝癌细胞 系购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。（批号 ）、（批号 ）、（批号 ）、（批号 ）、盐酸二甲双胍（批号 ）均购自上海源叶生物科技有限公司；高糖 培养基（批号 ）购自 公司；胎牛血清（批号 ）购自浙江天杭生物技术股份有限公司；磷酸盐缓冲液（，批号 ）、（批号 ）购自北京索莱宝科技有限公司；油 红 染 液（批 号 ）购 自 ；葡萄糖（批号 ）购自天津市恒兴化学试剂制造有限公司；油酸钠（批号 ）购自西安鲲创科技有限公司；胰岛素（批号 ）购自诺和诺德中国制药公司；甘油三脂（）测试盒（批号 ）、葡萄糖测试盒（批号 ）购自南京建成生物工程研究所；细胞膜蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂盒（批号 ）购自上海碧云天生物技术有限公司；（硝基苯并 氧杂 ，二唑 氨基）脱氧葡萄糖（，），）（批号 ）购自 公司；（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）、（）等抗体均购自 公司；抗体（）购自 公司；兔二抗、鼠二抗购自武汉爱博泰克生物科技有限公司。仪器与设备恒温二氧化碳培养箱（，德国 有限公司）；双人单面净化工作台（上海沪净医疗器械有限公司）；酶标仪（，美国伯腾仪器有限公司）；倒置显微镜（，德国 公司）；电泳仪（，美国伯乐公司）；电子天平（，梅特勒 托利多仪器有限公司）；离心机（，德国 公司）；激光共聚焦显微镜（，德国 公司）。方法 细胞培养与传代将 细胞置于含 胎牛血清、青链霉素的高糖 培养基中，、细胞培养箱中培养，每隔 换液，待细胞长至 ，用含 的胰酶进行消化传代，选生长期的细胞进行后续实验。模型建立与细胞分组将 细胞用不同比例葡萄糖（，）和油酸（，）组成的复合物（、）进行诱导。每组按胰岛素刺激与否分为胰岛素刺激组（，）和无胰岛素刺激组，每 收集 次细胞，共收集 次。最终通过检测 细胞外葡萄糖含量和 磷酸化水平，确定复合物的作用浓度和作用时间。建模成功后，进行化合物处理。细胞分组：将 细胞分成正常组（，）、模型组（，），阳性对照组：二甲双胍（，），化合物处理组：组、组、组、组。组细胞为正常培养的空白对照细胞，组细胞按照 细胞 模型构建方法处理，阳性对照组和化合物处理组是对 组细胞分别用 或 个化合物处理。细胞活力测定取 细胞，按 个 孔接种于 孔板中。待细胞密度长至 以上，分别加入不同浓度的 个二苯乙烯类化合物（、）培养 ，法处理于 波长处检测吸光度（），计算细胞存活率。细胞存活率（测定值空白组 空白值中国药理学通报 ；（）。细胞外葡萄糖含量测定 细胞按“，”项方法处理细胞，每 收集细胞培养上清液，参照葡萄糖氧化酶法检测试剂盒说明书方法，检测并计算 细胞培养上清液葡萄糖含量。葡萄糖含量 待测组葡萄糖含量 空白对照组葡萄糖含量。油红 染色将 细胞按“，”项处理。各组细胞培养 后，细胞用预冷 洗涤次，多聚甲醛室温固定细胞 ，清洗 次，加入油红 染液于细胞表面静止，室温避光静置 后，用 乙醇清洗细胞数次，置于显微镜下观察并拍照。细胞 含量检测将 细胞以 个 孔接种于孔板中，按 项下方法处理细胞。各组细胞培养 后，弃去上清液，细胞用预冷 洗涤 次，加入胰酶消化收集各组细胞悬液，以 离心 ，弃上清，加 进行匀浆，冰水浴条件下超声破碎。参照相应检测试剂盒说明书，检测并计算 含量。测定将 细胞以 个孔接种于 孔板中诱导成 状态后，二苯乙烯类化合物处理 ，清洗细胞 次，下用 （）再培养 。孵育结束后，去除剩余培养基，用冷 清洗细胞，并在室温下用 多聚甲醛固定 。激光共聚焦显微镜进行观察，使用 软件获取相应荧光强度。法检测相关蛋白的表达取对数生长期的 细胞，按 ，上述方法分组、造模、给药。每组细胞培养每 ，弃上清，预冷的 清洗，每孔加入 裂解液于冰上充分裂解，收集裂解液，放置充分裂解 以上，离心 ，取上清液于新管并 法测定蛋白浓度。根据蛋白浓度测定结果，加入 缓冲液适量，混匀 煮沸变性，分离，湿转法转膜，脱脂牛奶室温封闭 ；加入 左右，、和 一抗（稀释比例为 ），于孵育过夜；用 溶液清洗 次，每次 次。用含 脱脂牛奶的 稀释的二抗室温孵育 ；用 溶液清洗 次，每次 。经 显色液处理后，使用高灵敏度化学发光成像仪曝光并拍照。统计学方法 数据采用 软件采集处理，用 软件进行单因素方差分析（），实验统计数据以珋 表示。结果 细胞 模型的建立分别采用不同比例的 和 组成的复合物处理 细胞 和 ，考察了建立 细胞 模型的诱导作用浓度和诱导时间。从 可以看出，与 组相比，采用 的高糖高脂复合物处理 细胞 时，胞外葡萄糖含量（）和脂滴积累明显上升（）（），的磷酸化水平明显降低（）（）。综合实验结果，选择 诱导 细胞 ，可成功建立 模型。二苯乙烯类化合物对 细胞活力影响采用 法测定 、和阳性对照 对 细胞活力的影响。从 数据可知，在化合物浓度为 时，和 明显抑制了 细胞的增殖活性。综合各化合物对细胞活力的影响，本实验选用 为处理浓度进行后续实验。二苯乙烯类化合物对 细胞脂质代谢的影响 二苯乙烯类化合物对 细胞 含量的影响采用油红 染色法检测各化合物对 细胞脂滴积累的影响，同时进行定量检测 的含量，如 所示，与 组相比，各化合物处理后，和 明显抑制了 细胞 含量（），而 和 抑制作用较弱（）。二苯乙烯类化合物对 细胞脂代谢相关蛋白表达的影响实验结果如 ，与 组相比，组中脂质代谢关键蛋白 、等表达水平均显著升高（），个二苯乙烯类化合物处理后，可不同程度地抑制上述脂代谢相关蛋白的表达（），其中 和 效果更为显著。二苯乙烯类化合物对 细胞糖代谢的影响 二苯乙烯类化合物对 细胞葡萄糖含量的影响如 ，所示，与 组相比，组中胞内 摄取能力下降。与 组相比，种 化 合 物 处 理 后，细 胞 对 的 摄 取 能 力 提 高，如 （），中国药理学通报 ；（）（珋 ，）：；：（）；：（：；：）；：；，中国药理学通报 ；（）（珋 ，），（珋 ，）：；（珋 ，）：；：；：；：；：；：；：；：；：；：；：，；，而如 所示，与 相比，组中胞外葡萄糖含量明显上升（），种化合物处理后均可降低胞外葡萄糖含量。二苯乙烯类化合物其中 和 对 细胞葡萄糖含量改善效果更为显著。二苯乙烯类化合物对 信号通路相关蛋白的影响 ，可见，刺激后，与 组相比，组 和 蛋白相对表达量明显下降（）。个化合物处理后，细胞在 刺激下，和 蛋白相对表达量均不同程度地升高（或 ）。此外，还发现 通路下游蛋白 和 经高脂高糖复合物处理后，其相对表达含量显著降低，如 ，（）。而 和 能使 和 的相对表达含中国药理学通报 ；（）（珋 ，）：；：；：；：；：；：；：（）；：；：；，；，量比值明显升高（）。说明 和 可通过促进 和 发生磷酸化，进而抑制糖异生的发生。二苯乙烯类化合物对 蛋白表达的影响如 所示，与 组相比，组 蛋白表达量明显降低（），与 组相比，各化合物处理后，、和 促进了其表达（），上调效果最明显（）。讨论 作为一种严重的慢性代谢性疾病，是其的重要发病机制之一，贯穿于 发生、发展的全过程 。改善 对治疗 具有潜在意义。研究表明，高浓度游离脂肪酸，如油酸、棕榈酸和软脂酸等可使外周组织中脂质和糖原的合成能力下降 ；而高糖能抑制胰岛细胞的活性和功能，同时产生糖毒性损伤胰岛细胞。采用高糖高脂复合物诱导 细胞建立 模型，能够避免单一因素造模的不准确性和对细胞造成的急性损伤 。柳嘉等 采用高糖高脂诱导 细胞，成功建立了 模型。在本研究中，选择 复合物诱导 细胞 后，成功建立了 模型。作为配体激活的转录因子，在脂肪细胞和肝细胞脂质调控中发挥着重要的作用，其表达异常会引起甘油三酯和游离脂肪酸聚积 。王巍嵩等 研究发现，二甲双胍可剂量依赖性地显著降低 小鼠血糖、血脂和增强胰岛素敏感性，这与其对脂肪组织 位 磷酸化的抑制作用密切相关。在肝脏中，和 的表达上调会影响脂肪酸的合成进而导致脂质积累 。本实验研究发现，与 组相比，细胞中 和 蛋白表达量明显升 高，进 而 上 调 和中国药理学通报 ；（）（珋 ，）：；：（）；：（）：；：；：；：；，；，中国药理学通报 ；（）（珋 ，）：；：；：；：；：；：；：；，的表达，脂质积累显著增加。个二苯乙烯类化合物不同程度下调 和 蛋白表达，同时降 低 了 脂 肪 酸 合 成 酶（，）、乙酰辅酶 羧化酶（，）、转录因子（，）蛋白表达，其中 和 显著减少了肝脏细胞中的脂质积累，同时促进葡萄糖的摄取。作为胰岛素信号通路的重要组成部分，信号通路对 起关键性作用，作为胰岛素信号通路中的关键蛋白，在药物刺激下其丝氨酸磷酸化后发生活化，进而促进 转移到质膜上，促进葡萄糖的摄取 。其下游的 和叉头框蛋白 （，）为该通路胰岛素信号传导的负调节转录因子，将其磷酸化后可促进肝糖原合成，抑制肝糖原分解，促进葡萄糖的摄取，从而改善 。研究发现，可显著提高 状态下 脂肪细胞葡萄糖的摄取能力，其效果与胰岛素增敏剂吡格列酮类似 。本研究发现，采用 种二苯乙烯类化合物干预后，细胞对 的摄取能力明显增强，、和 表达均显著增加，同时 的表达明显增强，推测二苯乙烯类化合物通过促进 、的磷酸化从而增强了 和 的磷酸化水平，同时促进了 的表达和膜转位，达到降血糖和改善 细胞 的作用。其中 和 改善效果最显著。综上所述，二苯乙烯类化合物具有改善 细胞糖脂代谢紊乱的作用，其作用机制与其抑制 等脂代谢相关蛋白的表达和激活 通路有关。这为研究二苯乙烯类化合物治疗 提供了理论依据。然而，本研究只在各个化合物不同浓度筛选前期进行初步讨论，并未对其间的效应关系进行分析，因此后期筛选 和 对改善 的机制是否与药效关系有关，需要进行深入研究讨论。参考文献：，：，（）：庞雅芬，黄明，李琳，等丹蒌片降低 小鼠肝脏脂肪生成及炎症反应改善胰岛素抵抗的作用研究 中国中药杂志，（）：，（）：，：，：刘福君，常李李，王为兰，等肝脏胰岛素抵抗与 型糖尿病 中国医学科学院学报，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：张金山，金国范，刘艳，等丁香酚对 型糖尿病小鼠的降血糖作用及肝脏糖脂代谢信号转导通路调控 中国药理学通报，（）：，中国药理学通报 ；（），（）：柳嘉，郭孝萱，吴薇，等高糖高脂诱导胰岛素抵抗 细胞模型的建立及活性成分的功能评价 食品科技，（）：，（）：，：王巍嵩，徐智宇，赵国伟，等二甲双胍改善 小鼠胰岛素抵抗新机制 抑制 位磷酸化 解放军药学学报，（）：，（）：姜立娟，李玉国，崔巍，等 信号通路参与中药防治 型糖尿病胰岛素抵抗的研究进展 中华中医药杂志，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（，；，）：，（），（），（），：；中国药理学通报 ；（）