分子生物学-8-疾病与人类健康.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,第八章 疾病与人类健康,肿瘤与癌症,HIV与爱滋病,HBV与乙肝,基因治疗,肿瘤与癌症,良性肿瘤,-,不具有侵染性,恶性肿瘤,-,具有侵染性,可转移,(1),蛋白酶的表达,(2),肿瘤一般会分泌促血管生成素,形成大量血管,获取营养,(3),癌症致死原因,-,营养耗尽,器官功能受损,癌基因与抑癌基因,癌基因的激活或过量表达,-,致癌,(,显性,),抑癌基因的失活,-,致癌,(,隐性,),癌基因,细胞转化癌基因,(oncogene,c-onc),控制细胞生长的基因，具有潜在的诱导细胞恶性转化的特性,病毒癌基因,(virus oncogene,v-onc),病毒所携带的致转化因子,(RNA,病毒,-,逆转录病毒,;DNA,病毒,),抑癌基因,(tumor suppressor gene),正常细胞内，抑制细胞生长，潜在抑癌作用的基因,此类基因突变、缺失或失活，引起细胞恶性转化，导致肿瘤,调控细胞增殖和分化、负调节,表达产物：跨膜受体、胞质调节因子、转录因子、细胞周期因子等,癌基因和抑癌基因在细胞周期调控中的作用,细胞周期及其调控,细胞间期,(G,1,期、,S,期、,G,2,期,),和有丝分裂期,两个调控点：,G,1,/S,转折点、,G,2,/M,转折点,从增殖角度，细胞可分为三类,连续分裂的细胞：周期性细胞，如小肠绒毛上皮隐窝细胞,休眠细胞（,G0,期细胞）：暂时脱离细胞周期，如肝、肾细胞,终端分化细胞：如神经、肌肉细胞,原癌基因在细胞周期调控中的作用,有些原癌基因是细胞周期蛋白的成员,抑癌基因在细胞周期调控中的作用,抑制细胞周期于静止期，并使复制不完全或受损伤的,DNA,不能进入分裂期。,Rb,基因,(,第一个调控点,G,1,/S),P53,基因,(,第一个调控点,G,1,/S),癌基因恶性激活的机制,原癌基因点突变,原癌基因基因获得外源启动子而激活,原癌基因甲基化程度降低而激活,原癌基因的拷贝数增加而激活,基因易位或重排使原癌基因激活,癌基因激活与肿瘤的发生,肿瘤发生学说,启动阶段、促癌阶段、演进阶段,癌基因激活与肿瘤发生,Ras,基因变异与肿瘤发生,Myc,基因变异与肿瘤发生,抑癌基因失活与肿瘤发生,Rb基因,P53基因,P16基因,肿瘤发生的多基因协同学说,HIV and AIDS,HIV and AIDS,获得性免疫缺陷综合征,（,Acquired Immunodeficiency Syndrome）,一种逆转录病毒引起的疾病,HIV and AIDS,细胞基础,当疾病发展到后期出现另一种类型细胞数量的降低,CD8+,细胞毒性杀伤细胞,发病过程中一种类型的细胞数量减少,CD4,+,T,4,辅助细胞,疾病发生以前总是出现,CD4,+,细胞的数量降低,认为,AIDS,是一种病毒引起的传染病,AIDS,是,HIV,持续性感染的结果,根据目前,HIV,在发展中国家的流行状况,可以认为,HIV,和它的并发症将会伴随我们一代人,AIDS,的定义,HIV,感染者其每立方毫升血中,CD4+,细胞数量,200,个.,全世界每天大约有,16,000,名新的,HIV,感染者,其中90%以上出现在,发展中国家,约2000名 是,15,岁以下的儿童,在成人感染者中,40%,是,女性,，15%,是年龄在,15-25,岁.,到1999年12月底,美国共报告,AIDS,患者733,374例,.,其中至少有,430,441,例已死亡,.,AIDS,统计,HIV and AIDS,病 毒,该病毒仅在,T4,细胞中增殖,很难培养,Robert Gallo:,从病人血激活的,T4,细胞中发现有逆转录酶存在,引起,AIDS:,人,T,细胞白血病病毒,HTLV-3,Luc,Montagnier,:,淋巴结病,-,相关病毒（,LAV）,人类免疫缺陷病毒,Human,Immunodeficiency,Virus (HIV),电镜下可见,HIV,颗粒,.,中央有核外有胞膜,(,CDC),HIV and AIDS,AIDS,病程,1.,急性感染,高病毒效价,轻微临床症状,CD4+,细胞数下降，但可恢复,CD8+,细胞数上升，也可恢复,高病毒效价,(,每毫升血中有,1千万个病毒体,),巨噬细胞被感染,HIV and AIDS,2.过高的免疫应答,病毒几乎从血循环中消失,有效的细胞毒性,T,细胞应答,针对病毒表面或内部蛋白的可溶性抗体出现,大部分病毒来自于才被活化和感染的,CD4+,细胞,(,半寿期大约1天,),CD4+,细胞生成来补偿病毒引起的感染细胞被溶解和细胞毒,T,细胞所致的感染细胞的被破坏,HIV and AIDS,3.潜伏期,病毒及临床症状的潜伏期,病毒持续在血管外组织存在,淋巴结树突状细胞,静止的,CD4+,记忆细胞,静止的带有原病毒的,CD4+,细胞,HIV and AIDS,每天1千亿个,HIV,颗粒,病毒的半衰期为,5.7,小时,每毫升血中有1千万到1亿个病毒体,少量的,T4,细胞被感染,发现在淋巴结中存在病毒,HIV and AIDS,4.疾病的起始,CD4+,细胞的大量减少,CD4+,细胞为病毒的靶细胞,对病毒应答的细胞被破坏,:,克隆清除,树突状细胞提呈抗原和病毒给,CD4,细胞,抗原表位的变异使越来越多的,HIV,病毒逃脱机体的免疫应答,CD4+,凋亡,HIV,病毒携带者如果,T4,细胞数一直维持较高水平，将不会发展为,AIDS,HIV and AIDS,5.严重阶段,-,AIDS,CD8+,细胞的被破坏比,CD4+,更严重,CD4,细胞的减少意味着病毒的感染不再能够控制,当,CD4+,细胞下降到每立方毫升,200,个以下时，病毒的滴度迅速升高，机体的免疫应答出现崩溃,CD8+,细胞数量显著下降,机会性感染,不加干预，,2,年内死亡,CD4+,细胞数量的下降与临床症状的出现有明显的相关关系,HIV-,病毒,胞膜,:,来源于宿主,两种糖蛋白,:,gp160 gp120 and gp41,gp41,是一个穿膜蛋白，而,gp120,则在膜外侧，以非共价键与膜相连，是一个膜外侧的周围蛋白,HIV-,病毒,GAG,基因,群特异性抗原,p17:,内表面,-,豆蔻酸基团,p24:,核壳体,p9:,与,RNA,相连的核蛋白,HIV-,病毒,多聚酶,(,逆转录酶,),整合酶,蛋白酶,酶,POL,基因,HIV-,病毒,HIV-,生活史,逆转录病毒,潜伏期,特异性的破坏,CD4+,细胞,病毒是如何进入细胞的,?,CD4,抗原,辅助受体,CD4+,细胞,HIV gp120,结合,CD4/,辅助受体,CD4+,细胞,CD4,抗原,辅助受体,HIV-,生活史,CD4,CD4,CD4,HIV,CCR5,CCR5,趋化因子,突变,CCR5,macrophage,HIV,病毒进入,CD4+,细胞,Movie 1,HIV,通过,gp120,结合,CD4,细胞,Movie 2,HIV,进入,CD4,细胞,HIV-,生活史,GAG POL ENV,HIV,增殖需要,:,逆转录酶,整合酶,蛋白酶,tRNA,引物,HIV,基因,HIV,没有癌基因但一直具有致癌性,HIV-,生活史,HIV,感染者可数年没有临床症状,在临床潜伏期期间，病毒被持续的复制和清除,潜伏期,只有,激活的,T4,细胞能够复制病毒,大部分被迅速溶解的感染,T4,细胞能被补充,一些,T4,转变为静止状态的记忆细胞可长期存活,记忆性,T4,细胞不能够复制病毒,巨噬细胞没有潜伏期,临床潜伏期,HIV,感染的,CD4 T,细胞的动力学,细胞死亡,凋亡等,没有感染的,激活的,T,细胞,慢性感染的带有原病毒的记忆性,T,细胞,返回静止状态,反应,没有感染,没有激活的记忆性,T,细胞池,感染,Adapted from Saag and Kilby Nat Med 5:609,1999,长期存活,!,长期存活,!,细胞死亡,免疫破坏,感染扩散,HIV,感染的,CD4 T,细胞的动力学,HIV,基因组,三个结构基因,开放阅读框架编码的小分子蛋白可刺激,AIDS,病人产生抗体,HIV,的基因组,早期,TAT:,转录的反式作用子,REV:,病毒蛋白表达的调控子,NEF:,负性调控因子,晚期,VIF:,病毒侵袭性因子,VPU:,病毒蛋白,U,VPR:,病毒蛋白,R,基因组,RNA,剪接成多个,mRNA,(c.f.mRNA for structural proteins),TAT,和,REV,是,HIV,复制的基础,小的非结构性蛋白,TAT,RNA Pol II,U3 R U5,When TAT All proteins(ENV,POL,GAG,TAT,REV etc),TAR,U3 R U5,TAT,REV,REV,调节剪接,U3 R U5,DNA,单个,剪接,ENV,糖蛋白,基因组,RNA,多个,剪接,小分子蛋白,(,TAT,REV),REV,水平,高,高,低,REV,调节结构蛋白与其他蛋白的比例,U3 R U5,潜伏期,缺乏任何激活的刺激,:,内环境稳定,潜伏期,内环境的稳定可导致,T4,细胞进入潜伏期，但细胞面临两个问题,被其他的,HIV,通过,CD4,抗原重叠感染,HIV,HIV,CD4,Anti-Gp120,T4,细胞,游离的,Gp120,答案:,感染细胞去掉其表面的,CD4,抗原,在细胞表面,Gp120,结合,CD4,抗原招致免疫攻击,潜伏期,NEF,NEF,是早期功能蛋白,NEF,辅助受体,CD4,抗原,NEF,结合,CD4,抗原,NEF,引起,CD4,内化和在溶酶体中消化,CD4,抗原在溶酶体中消化,NEF,NEF,溶酶体,潜伏期中断,静止,T4,细胞,免疫应答,抗原结合,激活的,T4,细胞,HIV,产生,HIV LTR,已经占据激活控制序列,HIV,的其他问题,内质网,Gp120/CD4,复合物将是破坏的目标,在,HIV,感染的,CD4,细胞内质网中，,VPU,可特异性的水解,CD4,抗原,核糖体,CD4,Gp160,在活化的细胞中,gp120,将被合成,CD4+T4,细胞数量不可逆转的下降,非常重要的治疗阶段,为什么所有的,T4,在消失,?,在早期阶段，1万个细胞中只有1个细胞被感染，而在晚期，40个细胞中就有1个被感染,感染的早期：,1:10,000,晚期,1:40,HIV,能够杀伤,T,细胞亚群的前体细胞,HIV,还没有溶解细胞的病毒携带者也能发展为,AIDS,为什么所有的,T4,细胞在消失,?,1.穿膜,病毒出芽导致细胞被破坏,但合胞体不常见,多数,T4,细胞不是,HIV+,可以感染,HIV,阴性细胞,未感染的,CD4,细胞,Gp120,阴性,细胞融合,CD4,细胞被破坏,2.,合胞体形成,被感染的,CD4,细胞,Gp120,阳性,为什么所有的,T4,细胞在消失？,合胞体不具有免疫应答功能,细胞毒性,T,细胞,杀伤,CD4,细胞,3.,细胞毒性,T,细胞介导的细胞毒作用,为什么所有的,T4,细胞在消失,?,杀伤,CD4+,细胞,4.,游离的,Gp120,结合,CD4,抗原，使没有感染的,T4,细胞看着象感染细胞,补体介导溶解,可以解释未感染,HIV,的,T4,细胞的丢失,为什么,T4,细胞在消失,?,5.,AIDS,相关的抗体与激活的,T4,细胞表面的抗原结合,6.,累及,T4,前体细胞,7.,自身免疫,.,Gp120,结合,CD4,抗原,.,CD4,抗原结合,MHC-II,分子:,MHC,与,Gp120,有类似的序列,.,抗,gp120,抗体可以结合,MHC-,对于,AIDS,疫苗来讲也是一个问题,8.,T4,细胞的凋亡,.,在克服自身免疫的克隆清除的过程中,T4,细胞凋亡是正常的,为什么,CD8+,杀伤细胞在消失,?,在,HIV,感染的后期,细胞毒性,T,细胞消失的非常迅速,这些细胞没有,CD4,抗原,他们没有被,HIV,感染,CD8+,细胞的存在与病毒的控制有一定的关系,在感染晚期出现的,HIV,亚型，导致大量的,CD8+,细胞凋亡,细胞毒性,T,细胞有辅助受体,CXCR4.HIV,结合但不会进入细胞,从结合部位传递的信号，导致大量的,CD8+/CXCR4+,细胞凋亡,结合,CXCR4,导致,TNF-,在细胞表面表达,?,G,蛋白信号,?,结合,CXCR4,导致,TNF-,受体,II,表达,CD8,细胞,(,no CD4 antigen),巨噬细胞,CXCR4,HIV,gp120,趋化因子,T,细胞凋亡,CD8,细胞,巨噬细胞,CXCR4,死亡,CD8 T,细胞凋亡小体,巨噬细胞摄取,CD8+,细胞的凋亡小体,凋亡小体在溶酶体中被消化,HIV,和自身免疫,CD4,抗原,gp120,MHC II,分子,Gp120,和,MHC II,都结合,CD4,抗原,.,都有,CD4,的结合位点,抗,-,HIV(gp120),也能结合,MHC II,巨噬细胞可通过两种途径被感染,CD4,Fc,受体,HIV gp120,结合巨噬细胞表面的,CD4,抗原,巨噬细胞通过,Fc,受体与抗,gp120,抗体病毒复合物中的抗体的,Fc,段结合，发挥调理吞噬作用将病毒摄取,HIV,gp120,HIV,抗,-,gp120,巨噬细胞,-,The Trojan Horse,病毒可能通过精液中的巨噬细胞感染患者,HIV,的感染导致细胞因子的产生,将病毒运输到不同器官,(,大脑,),非增殖的成熟巨噬细胞可长时间持续产生,HIV,而不被病毒杀伤,-,没有潜伏期,血管外的巨噬细胞是,HIV,的储存池,病毒的多态性,RNA,聚合酶,II,有较高的错误率：,1:2,000-10,000,HIV,基因组,9749,核苷酸,因此每个新病毒至少有一个碱基突变,!,每天有1%的病毒发生两个碱基的突变,HIV,从感染患者到出现临床症状，病毒已发生很大变化,HIV,是一种逆转录病毒,逆转录病毒用宿主细胞的,RNA,聚合酶,II,去复制它们的基因组,疫苗问题,病毒的多态性,感染早期,:,亲巨噬细胞,非合胞体诱导,缓慢复制,感染晚期,亲,T4,细胞,诱导合胞体,高病毒滴度,疫苗问题,病毒多态性,变化最大的蛋白是,gp120,一个病人体内病毒氨基酸序列的变化为,1-6%,共感染可导致基因重组,疫苗问题,疫苗问题,病毒的多态性,多态性是由于逆转录酶缺乏校对而致高突变的结果,药物问题,逆转录酶的变异导致对脱氧核苷类似物的抵抗,蛋白酶的变异导致对蛋白酶抑制剂的抵抗,药物问题,HIV,感染的其他,CD4-,细胞,肠道和阴道的上皮细胞,大脑的内皮细胞,脑细胞,:,星形胶质细胞,少突胶质细胞,半乳糖脑苷脂受体,抗,-,HIV,的策略,教育,性传播,非高度的传染性,化学药物治疗,突变选择,抵抗,但,抑制复制,减少突变的可能性,抗,-,HIV,的策略,H,ighly,A,ctive,A,nti-,R,etroviral,T,herapy,HAART:,两种脱氧核苷类似物逆转录酶抑制剂和一种蛋白酶抑制剂,Now also:,两种脱氧核苷类似物逆转录酶抑制剂和一种非核苷,抗,-,HIV,的疫苗,潜伏期,基因漂移,逆转录酶,RNA,多聚酶,II,多态性,回复突变,致癌性,?-,LTR,问题1,HIV,是一种逆转录病毒,抗体调理,(,opsonizes,HIV,Fc,receptor),问题2,合胞体,细胞间传播,(,体液中的抗体无效,需要,CTL),隐藏的表位,疫苗可能是免疫抑制剂,(,其抗体可与,MHC II,结合),抗,-,HIV,的疫苗,Will counseling alter the results?,问题,3,What is the,end point,for success in trials,-What are the correlates of protection?,Vaccinee,appears to be HIV positive,抗,-,HIV,的疫苗,HBV与乙肝,甲肝病毒,-,小,RNA,病毒,其它肝炎病毒,-RNA,病毒,乙肝病毒,-,DNA,病毒,有部分单链区的环状双链,DNA,分子,.,HBV的复制-非半保留复制,DNA-,修复,-,转录,RNA-,逆转录,cDNA-,双链,DNA,一、基因治疗的概念,基因治疗（,gene therapy,）,就是向有功能缺陷的细胞补充相应功能基因，以纠正或补偿其基因缺陷，从而达到治疗的目的。,对象：,体细胞 生殖细胞,二、基因治疗的必要条件,发病机制在,DNA,水平上已经清楚,要转移的基因已经克隆分离，其表达产物有详尽的了解,该基因正常表达的组织可在体外进行遗传操作,理想的基因治疗还必须：,外源基因可有效导入靶细胞,外源基因能在靶细胞中长期稳定存留,导入基因能适量表达,导入基因的方法及载体对宿主细胞安全无害,三、基因治疗的主要内容或策略,基因标记,(,gene labeling,),Neo,基因，逆转录病毒载体,基因置换（基因矫正）,定位重组或同源重组纠正缺陷基因或异常序列,基因添加（基因增补）,导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因,导入正常的基因补偿缺陷基因的功能,导入新的基因，利用表达产物治疗,基因干预,(,gene interference,),指采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不表达，以达到治疗疾病的目的。,(mRNA,DNA),导入寡核苷酸抑制内源基因的表达,反义核酸 封闭基因表达,核酶 裂解特异的靶,mRNA,第二节 基因转移技术和靶细胞,基因治疗的基本方式：,体内直接转基因,体内法,in vivo,体细胞介导的基因治疗,回体法,ex vivo,基因转移的方法：,生物学方法,逆转录病毒载体，腺病毒载体，腺病毒相关病毒载体，单纯疱疹病毒载体,非生物学方法,脂质体，直接注射，受体介导基因转移技术，其它方法,一、基因转移的生物学方法,逆转录病毒载体：,逆转录病毒载体的结构,将病毒前,DNA,经,适当改造并插入质粒后构建而成,5LTR/3LTR,包装信号（,序列）,Neo,基因,/,Amp,r,酶切位点（多克隆位点）,包装细胞,(,packaging cell),将缺失了包装信号及相关序列的缺陷型逆转录病毒导入哺乳动物细胞，大量产生病毒包装蛋白。,NIH/3T3,三代包装细胞：,2,PA317,CRIP,逆转录病毒载体导入包装细胞后，载体转录出病毒基因组的部分序列、标记基因、外源基因，被包装成病毒颗粒。,缺陷型的逆转录病毒颗粒,一过性感染,病毒滴度,10,6,CFU/ml,以上,逆转录病毒载体的特点：,缺陷型的逆转录病毒感染细胞,RNA,进入靶细胞后，变成前病毒并整合到宿主细胞的染色体上，可稳定表达,只能感染处于增殖期的细胞,安全性问题,逆转录病毒感染的可能性,污染的可能性,逆转录病毒在靶细胞基因组上的整合,破坏细胞正常生长的必须基因,/,抑癌基因,LTR,激活原癌基因,染色体重排激活原癌基因,二、基因转移的非生物学方法,脂质体,直接注射,受体介导基因转移技术,其它方法,脂质体,(,liposome,),脂质体是由脂类形成的一种可以高效包装,DNA,的人造单层膜，是一种脂质双层包围水溶液的脂质微球。,其结构和性质与细胞膜极为相似，二者易于融合，,DNA,由于细胞的内吞作用进入细胞。,人工脂质体膜具有如下特点：,与体细胞相容，无毒性和免疫原性,可生物降解，不会在体内堆积,可制成球状,(0.0350,m,),，,包容大小不同的生物活性分子,可带有不同的电荷,具有不同的膜脂流动性、稳定性、及温度敏感性，能适应不同的生理要求,直接注射,方法：注射，包埋,溶液类型对基因表达有影响：,重组,DNA,可贮存于,5%30%,的蔗糖溶液中,也可用生理盐水或,PBS,受体介导基因转移技术,受体介导的细胞内吞作用,特点：,具有细胞、组织或器官专一性，配体只能被一些特异的细胞吞噬,配体进入细胞的转移效率很高,核酸运载工具：,配体,+,多聚赖氨酸（,PL,）,配体,PL,核酸,脱唾液酸血清类粘蛋白（,ASGP,）,配体,肝细胞,受体,其它方法,磷酸钙共沉淀法,电穿孔法,显微注射法,基因枪法,三、基因转移的靶细胞,靶细胞的选择须考虑：,最好为组织特异性细胞,细胞较易获得，且生命周期较长,离体细胞较易受外源基因转化,离体细胞经转染和一定时间培养后再植回体内，仍较易成活,目前常用的靶细胞有：,造血细胞,皮肤成纤维细胞,肝细胞,血管内皮细胞,淋巴细胞,肌肉细胞,肿瘤细胞,第三节 反义,RNA,、核酶和三链,DNA,在基因治疗中的作用,一、反义,RNA,反义,RNA,在基因治疗中的意义及需解决的问题,反义,RNA,与特异的,mRNA,结合而调控其翻译,体外合成反义,RNA,构建转录反义,RNA,的,重组质粒,受体介导反义,RNA,转移技术,ASGPPL,反义,RNA,应用前景,安全性高,反义,RNA,设计和制备方便,具有剂量调节效应,能直接作用于一些,RNA,病毒,二、核 酶,核酶的设计,靶序列,无二级结构,切割位点,GUN,容易与其它,RNA,互补结合,核酶的应用,核酶结构稳定,可重复使用,三、三链,DNA,三链,DNA,在基因治疗中的意义,寡聚脱氧核苷酸（,ODN,）以,DNA,双螺旋分子的专一性序列为靶子，通过与该序列形成三螺旋,DNA,来阻止转录,作用机制,作用机制,合成脱氧寡核苷酸（,ODN,）（同聚嘌呤或同聚嘧啶）,DNA,分子中同聚嘌呤,同聚嘧啶,ODN,也被称为,TFO,(,triplex-forming oligo,),技术关键,TFO,的设计与合成,专一性,稳定性,摄取与分布,第四节 基因治疗的应用研究,一、遗传病的基因治疗研究,1990.9.14,首例基因治疗,4,岁 女孩 严重免疫缺陷症,(SCID),缺乏腺苷酸脱氨酶,(ADA)2-,脱氧腺苷含量升高 毒性 严重破坏免疫功能,ADA,基因,LN,逆转录病毒载体,靶细胞为病人淋巴细胞 回输,二、肿瘤的基因治疗研究,修正肿瘤相关基因的功能,恢复抑癌基因的功能,纠正癌基因的表达,导入特定的基因产生肿瘤特异的药物敏感性,自杀基因疗法,HSV-,tk,肿瘤的免疫基因治疗,外源基因导入肿瘤细胞,细胞因子，,MHC ,外源基因导入免疫细胞,TNF,肿瘤的免疫基因治疗面临的问题,细胞因子作用的双重性,细胞因子基因转染肿瘤细胞疫苗的有效性,