微生物遗传育种绪论上.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,微生物遗传育种,Genetic Improvment,of Microorganisms,第一章,绪论,主要内容：,工业微生物菌种,遗传的物质基础、遗传信息的复制,遗传信息的传递,遗传信息的表达与调控,微生物遗传育种技术,微生物菌种选育发展简史,第一节工业微生物菌种,工业微生物菌种,：在大规模培养条件下，,批量商业性获得微生物细胞或其代谢产物,过程中所使用的微生物菌株；或利用微生,物特定代谢过程，规模化加工或转化特定,底物或环境物料的微生物菌株。,工业微生物菌种的分类,天然菌种,（,Nati,ve strain,）：通过自,然筛选和分离,获得的工业菌种；,诱变菌种,（,Muta,genized strain,）：通过物,理、化,学等诱变剂在实验室人工诱变自然筛选与分离的菌,株所获得产量或,/,和性状改善的工业菌种；,重组菌种,（,Reco,mbinant strain,）是通过遗,传重组,技术对菌种进行定向遗传改良获得的工业菌种；,遗传修饰生物体,（,Genetic modification organisms,GMOs,）：经外源基因导入并因此发生遗传整合和,性状改变的生物体,育种的遗传学基础,遗传学,(Genetics),是研究,生物遗传与变异规律,的一门科学。目的是掌握和利用这些规律，主,动地控制、改造生物，使其为人类服务。,遗传,(Inheritance),指亲,代的性状在子代表现的,现象。（生物繁殖过程中，子代与亲代在各方,面的相似现象）,变异,(Variation),指同,种生物世代之间或同代不,同个体之间的性状的差异。（子代个体发生了,改变，在某些方面不同于原来亲代的现象）,遗传与变异,是生物界的共同特征，它们之间,是辩证统一的。,第二节 微生物育种的遗传学原理,一、遗传物质化学本质的确证,1,、,肺 炎 链 球 菌 转 化 实 验,2,、,噬 菌 体 感 染 实 验,3,、,病 毒 重 建 实 验,二、遗传物质的结构与存在状态,三、,遗传物质的复制,结论？,肺炎链球菌转化实验,转化：一个品系的生物吸收了来自另一品系生物,的遗传物质，从而获得后一品系的某些遗传性状,的现象。,Griffith,实验,1928,S,活菌，致死小白鼠,S,死菌，不致死小白鼠,R,活菌，不致死小白鼠,R,活菌,+,S,死菌，,致死小白鼠，,分离出,S,活菌,体内转化实验,DNA,是遗传物质的证,明,1928,年，英国微生物学家,Grif,fith.F,做了肺炎双球菌的转化实验,Avery,实验,1944,S,型活菌 提取蛋白质,+,R,活菌 无,S,活菌,类脂,+R,活菌 无,S,活菌,多糖,+R,活菌 无,S,活菌,RNA,+R,活菌 无,S,活菌,DNA+R,活菌 有,S,活菌,S,D,NA,蛋白酶处理 具转化能力,S,DNA,DNase,处理无转化能力,结论：转化因子的化学本质为,DNA,。,1944,年,Aver,y.O,、,Macleod.C,、,McCarty.M.J,揭开了转化因子,的化学本质。,体外转化实验,DNA,是遗传物质的证,明,2,、,噬 菌 体 感 染 实 验,Hershey&Chase,1952,年,T,2 35,S+E.coli,培养液 吸附,10,分钟后，振荡,细胞，离心分离，放射性在上清中，子代,噬菌体无,35,S,标记,T,2 32,P+E.coli,培养液 吸附,10,分钟后，振荡,细胞，离心分离，放射性在沉淀中，子代,噬菌体有,32,P,标记,解释：,35,S,放射性标记留在宿主细胞外，,32,P,放射性标记进入宿主细胞内,结论：,DNA,是遗传物质,。,3,、,病毒重建实验,Heinz Fraenkel-Conrat,and,B.Singre,，,1957,TMV,烟草花叶病毒,HR,霍氏车前病毒,TMV,外壳,+H,R,病毒,RNA 重组病毒感染植,株,病灶表现,HR,病毒特征从病灶中分离的,病毒具,有,HR,病毒,RNA,和,HR病毒蛋白质,TMV RNA+HR,病毒外壳 重组病毒感染植,株病灶表现,TMV病毒特征从病灶中分离的,病毒具有,TMV,病毒,RNA,和,TMV 病毒蛋白质,结论：,HR,病毒的遗传物质是,RNA,病毒重建实验,1957,年，,Hein,zFraenkelConrat,和,B.Singre,的杂合病毒实验：,HR(Holmes RibGrassStrain)M(Masked Strain)TMV,结论：,生物的遗传物质的化学本质是,核酸，在绝大多数生物中是,DNA,，,在少数病毒中是,RNA,。,二、遗传物质的结构与存在状态,碱,基,核,糖,脱,氧,核,糖,核,苷、,核,苷,酸,磷酸二酯键,核,酸,序,列,碱,基,配,对,双,链,D,N,A,双,螺,旋,结,构,2.DNA,的存在,状态,细菌核,DNA,（拟核,）,细菌质粒,真核细胞染色体（,Chromosome),存在于真核生物细胞核内，由,DNA,、蛋,白质及少量,RNA,组成的嗜碱性丝状或杆,状小体。在细胞分裂间期时又称染色质,（,chromatin,）。,1,）染色体的形态与构造,细胞分裂中期的染色体具有典型的形态结,构，一般包括着丝粒、臂和端粒等结构。,染色单体,染色体,随体,2,）染色体的特点：,各条染色体的长度、着丝粒位置，,随体及次级溢痕数目、大小、位置,各不相同；,不同生物染色体数目不同；,物种,人,金丝猴,黄牛,马,驴,小家鼠,大家鼠,果蝇,洋葱,玉米,水稻,豌豆,向日葵,衣藻,染色体数目,2n=46,2n=44,2n=60,2n=64,2n=62,2n=40,2n=42,2n=8,2n=16,2n=20,2n=24,2n=14,2n=34,2n=16,3,）染色体的化学组成与结构,化学组成：,1/3 DNA,，,1/3 Histones,（组蛋白）,1/3Nonhistons,（非组蛋白）及少量,RNA,和磷脂。,DNA,：,携带传递遗传信息，染色体的功能体现者。,组蛋白：,染色体中与DNA联结的碱性蛋白质，是,染色体主要的结构蛋白。近乎所有的染色体中都含,有5种组蛋白，除H1外，无种或组织特异性。,非组蛋白：,染色体中除组蛋白外的其他蛋白，其,种类比组蛋白复杂得多，具种和组织特异性。,小牛胸腺染色体组蛋白的特点,染色体的结构,分子生物学和生物化学研究表明，染色体基本结构单位为核,小体，核小体连接成染色质丝，经卷曲形成螺线管solenoid，,（中期）后者进一步卷曲成超粗纤维，再进一步浓缩即为染,色体。高度浓缩的染色体长度只有DNA双螺旋的1/万左右。,H3,2,-H4,2,八聚体,2H2A-H2B,核心颗粒,染色质小体,(166bp),146bp,166bp,核小体,(200bp),DNA,H1,20bp,DNA 连接区,(常为 3234bp),核小体的组成,三、遗传物质的复制,1,、,D,NA,的半,保留复制模型,2,、,D,NA,的二向复制模型,(,模型,),3,、,D,NA,的滚,环复制模型,DNA,复制的,半保留模型,DNA,复制叉,DNA,的二向复制模型,(,模型,),DNA,滚环复制模型,第三节,RNA,和蛋白质,的合成,一、转录：,DNA,RNA,转录是在一个,DNA,模板上合成一,个与之,互补的,RNA,链。转录产物有三种形式：信,使,RNA,（,mRNA,）、核糖体,RNA,（,rRNA,）,和转运,RNA,（,tRNA,）,一、翻译：,RNA,蛋白质,翻译是在一个,mRNA,指导下合成蛋,白质的,过程，即将核酸语言翻译成蛋白质语言。,mRNA,语言是以密码子的形式存在的，密,码子由三个核苷酸组成。一个,mRNA,分子,上的密码子序列决定着被合成蛋白质里的,氨基酸序列。每,一个密码子编码一个特殊,的氨基酸，这就是遗传密码。共有,64,种可,能的密码子。,在,64,个密码子里，,61,个是有义密码子，,3,个,是无义密码子。有义密码子编码氨基酸,，无,义密码子（也叫终止密码子，,Stop codon,）,则不编码氨基酸。密码子具有兼并性。,引导蛋白质分子合成的起始密码子,（,Start,codon,）是,AUG,，该密码子也是合成蛋氨酸,的密码子。起始的蛋氨酸有时在后加工过程,中被去掉，所以不是所有成熟的蛋白质的氨,基酸链都是以蛋氨酸开始。,翻译位点是核糖体，由,tRNA,识别特殊的密,码子并,运输必需的氨基酸。,第四节 基因表达规则,一、基因表达的方式,按对刺激的反应性，基因表达的方式分为：,（,一,）,组成性表达,无论表达水平高低，管家基因,较少受环境因素影响,，而是在个体各个生长阶段的大多数或几乎全部组织中持续表达，或变化很小。区别于其他基因，这类基因表达被视为,组成性表达,。,某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达,通常被称为,管家基因,。,(,housekeeping gene,),（二）诱导和阻遏表达,在特定环境信号刺激下，相应的基因被激活，基因表达产物增加，这种基因称为,可诱导基因,。,可诱导基因在特定环境中表达增强的过程，称为,诱导（,induction,）,。,如果基因对环境信号应答是被抑制，这种基因是,可阻遏基因,。可阻遏基因表达产物降低的过程称为,阻遏（,repression,）,。,在一定机制控制下，功能上相关的一组基因，无论其为何种表达方式，均需协调一致、相互配合、共同表达，即为,协调表达（coordinate expression）,这种调节称为协调调节,（coordinate regulation）,（三）协调表达,二、基因表达的多级调控,基因激活,转录起始,转录后加工,mRNA降解,蛋白质降解等,蛋白质翻译,翻译后加工修饰,（一）DNA水平的调控,包括基因扩增（拷贝数增多）、基因重排、基因结构的活化等。,DNA必须部分暴露才能使RNApol有效的结合，转录起始前基因必须进入活性状态才能起始转录。,（二）转录水平的调控,转录水平的调控是基因表达调控中,最重要的环节,，转录的起始是,基本的控制点,。,这是因为：在所有生物合成途径中，第一步反应通常是最有效的调节环节，控制反应途径的第一步反应通常可减少不必要的生物合成，节约原料，合理用能；在功能方面相互依赖的数个蛋白质编码基因串联为复合基因（如Lac操纵子），此时通过转录起始阶段调节这些基因产物的表达是最有效的。,（三）转录后水平的调控,指转录起始后对转录产物进行的一系列修饰、加工过程。包括转录提前终止、mRNA前体的加工、剪接、RNA编辑等。对某些基因来说，,转录后水平的调控在决定细胞的表型多样化和蛋白质结构与功能上,也是,十分关键的,。,（四）翻译水平的调控,通过特异的蛋白质阻断某些mRNA翻译起始，是一种特异性调节。,翻译的起始调控是翻译水平调控的主要阶段。,（五）翻译后水平的调控,蛋白质合成后，使蛋白质活化并发挥生物学功能的调节过程称为,翻译后水平的调控。,三、原核基因表达调控,1 影响原核基因转录的因素,（顺式元件和调控蛋白）,1、启动子,启动子是DNA链上能与RNApol结合并能有效起始RNA转录的DNA序列。它是,基因表达不可缺少的调控序列,，没有启动子，基因就不能转录。,（一）转录水平的调控,启动子决定转录的方向及模板链,5 TTGACA TATATT AGGTCCACG 3,-35,-10,+1,3 AACTGT ATATAA TCCAGGTGC 5,AGGUCCACG,启动子决定转录的效率,2、,因子,因子控制RNApol与DNA结合,因子的作用是确保RNApol与特异的启动子而不是与其他位点结合,核心酶,core enzyme,全酶,holoenzyme,因子控制特定基因表达,因子使得RNApol,选择特定的启动区起始转录,。一旦一种因子被另一种因子代替，即引起原来一套基因的关闭和新的一套基因转录的开始。如环境温度升高或其它应激变化引起32与核心酶结合，RNApol全酶结合Hsp基因的启动区，起始Hsp基因转录，而原先许多基因的转录关闭。,3.操纵序列和阻遏蛋白,操纵元件又称操纵基因,是阻遏蛋白识别与结合的一小段DNA序列。,阻遏蛋白指一类在转录水平对基因表达产生负调控作用的蛋白。它主要通过,抑制开放性启动子复合物的形成,而控制基因转录。,阻遏（repression）,:有活性的阻遏蛋白与操纵基因结合时，阻止RNApol与启动子结合或阻止开放性启动子复合物形成而抑制转录的作用,去阻遏（derepression）,:一类特定的小分子物质与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白失活，从DNA脱落下来的作用。,辅阻遏,:一类特定的小分子物质与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白活化，抑制转录。,可诱导的操纵子,如E.coli lac，当阻遏蛋白与操纵基因结合时，则抑制转录。有乳糖或乳糖类似物(IPTG)存在时，阻遏蛋白与乳糖结合而变构，变构的阻遏蛋白不能与操纵基因结合，引起结构基因转录。,可阻遏的操纵子,如E.coli Trp，无色氨酸时，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，RNApol与启动子结合启动基因转录。有色氨酸时，阻遏蛋白与色氨酸形成复合物后与操纵基因结合，阻止RNApol与启动子结合而抑制转录。,4.正调控蛋白及其结合位点,正调控蛋白：,一类与DNA结合后，促进基因转录的调控蛋白。它主要通过,改变启动子的起始效率,而控制基因的转录。,乳糖操纵子的结构,调控区,CAP结合位点,启动序列,操纵序列,结构基因,Z：,-,半乳糖苷酶,Y：透酶,A：乙酰基转移酶,Z,Y,A,O,P,DNA,分解代谢基因激活蛋白（catabolite gene activator protein,CAP）,CAP与CAP位点结合后，才能,促使RNApol与启动子结合,，启动基因转录，这样一个操纵子中的一组基因就有两道开关，只有两道开关同时打开时基因才能转录。,大肠杆菌氮代谢基因激活蛋白（nitrogen metabolism gene activator protein,ntrC,）,ntrC,ntrCp,ntrB激酶,ntrB磷酸酶,5.增强子与激活蛋白,6、倒位蛋白(inversion protein),是一种位点特异性的,重组酶,。可使DNA的某一段序列发生倒位。倒位蛋白可使启动子的方向发生倒位，而控制基因转录。,7、转录终止子与,因子,转录终止子(teminater),定义：,指基因的3末端或者操纵子的3的一段具有终止转录功能的核苷酸序列。,分类：,依赖,因子的转录终止子,不依赖因子的转录终止子,序列特征,相同点：,终止点之前有一段回文结构，两重复序列之间有间隔序列，终止子被转录出来的RNA可形成发夹结构。,不同点：,不依赖,因子的转录终止子回文序列中有较多G-C碱基对，回文序列下游有6-8A-T碱基对；依赖因子的转录终止子回文序列中G-C含量较少，回文序列下游没有固定特征。,不依赖,因子（E.coli,Trp）终止子,依赖,因子（TR1）的终止子,发夹结构的作用：,阻碍RNA链从三元复合物进一步向外释放，造成转录作用高度搁置。,回文序列下游A/U序列的作用：,dA和rU之间氢键力和碱基堆积力很弱，造成RNA和DNA杂交部分很容易拆开，三元复合物解体，RNApol与RNA解离，转录终止。,因子,因子具有两种活性：,促进转录终止,；具有,NTP酶活性,，后一种活性是实现前一种活性必不可少的。,ATP,8、衰减子(attenuator),是一个受翻译控制的转录终止子结构。是一段能减弱转录作用的序列。由于翻译作用的影响，衰减子下游的基因,或者继续被转录,，,或者,在衰减子处,实现转录的终止。,2、原核基因转录的调节机制,通过负调控因子和正调控因子所进行的复合调控。,阻遏蛋白与操纵基因结合，防碍RNApol与P结合形成开放性启动子复合物，阻止基因转录；当阻遏蛋白与操纵基因解离时，RNA聚合酶与启动子结合，起始基因转录。,1、乳糖操纵子调控的机制,乳糖操纵子的结构：,Z、Y、A三个结构基因，逆流而上依次为：操纵基因(O)、启动子(P)、CAP结合位点和调节基因，,O与P有一定程度重叠。,乳糖操纵子的结构,调控区,CAP结合位点,启动序列,操纵序列,结构基因,Z：,-,半乳糖苷酶,Y：透酶,A：乙酰基转移酶,Z,Y,A,O,P,DNA,操纵序列,阻遏蛋白,的结合位点,当操纵序列结合有,阻遏蛋白,时，会阻碍RNA聚合酶与启动序列的结合，或是RNA 聚合酶不能沿DNA向前移动，阻碍转录。,启动序列,编码序列,操纵序列,pol,阻遏蛋白,乳糖操纵子的转录调控机制,通过负调控因子和正调控因子所进行的,复合调控,。阻遏蛋白与操纵基因结合，防碍RNApol与P结合形成开放性启动子复合物，阻止基因转录；CAP与CAP结合位点结合促进RNApol与P结合，引起有效转录。,乳糖操纵子结构基因转录需具备两个条件：,阻遏蛋白与操纵基因解离,CAP与CAP结合位点结合,mRNA,阻遏蛋白,I,DNA,Z,Y,A,O,P,pol,没有乳糖存在时,阻遏蛋白的负性调节,阻遏基因,mRNA,阻遏蛋白,有乳糖存在时,I,DNA,Z,Y,A,O,P,pol,启动转录,mRNA,乳糖,半乳糖,-半乳糖苷酶,+,转录,无葡萄糖，,cAMP浓度高时,有葡萄糖，,cAMP浓度低时,CAP的正性调节,Z,Y,A,O,P,DNA,CAP,CAP,CAP,CAP,CAP,CAP,当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用；,如无CAP存在，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子仍无转录活性。,单纯乳糖存在时，细菌利用乳糖作碳源；若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时,细菌首先利用葡萄糖。,葡萄糖对 lac 操纵子的阻遏作用称,分解代谢阻遏（catabolic repression）,。,2、色氨酸操纵子的调控机制,色氨酸操纵子的结构,阻遏蛋白的调控作用,trp,trp,高时,trp,低时,mRNA,O,P,I,调节区,结构基因,前导肽,衰减子,色氨酸,操纵子,色氨酸操纵子的调控机制,衰减子的调控作用,L基因,的3端有一个衰减子序列。前导序列,转录的mRNA具有如下特性及功能：,1）内含4段特殊的短序列,2）序列是一个开放阅读框：,转录后立即翻译成14氨基酸的短肽称作前导肽，,前导肽第10，11位是两个连续的色氨酸。,衰减子结构,(,attenuator,),核糖体,新生肽链,mRNA,DNA,1,2,3,4,UUUU 3,1、当色氨酸浓度高时,trp,密码子,转录衰减机制:,5,1,2,3,4,5,核糖体,2、当色氨酸浓度低时,（二）翻译水平的调控,1、SD序列对翻译的影响,1、SD序列的定义：,SD序列是位于mRNA起始密码子AUG上游由3-9碱基组成的一段核苷酸序列，它是核糖体结合的位点。,2、SD序列的顺序及位置对翻译的影响,SD序列的存在与否是mRNA在细胞中翻译的决定因素,SD序列的位置是影响翻译效率的重要因素,2、隐蔽SD序列对翻译的影响,如SD序列处于mRNA的二级结构中，核糖体不能与之结合，只有打破这种结构，核糖体才能结合。,2、mRNA寿命对翻译的的调控作用,不同的mRNA有不同的降解速度,1、,降解mRNA的外切酶主要是3外切核酸酶,mRNA 分子末端的二级结构能阻止3外切酶进攻，凡降解终止子发夹结构的突变都造成mRNA稳定性降低，终止子除转录终止功能外，还决定mRNA的稳定性。,2、,降解mRNA的内切酶主要是RNase,发挥作用需要一定的二级结构特征，如RNase对,整合酶基因（,int）的mRNA降解时就需要转录终止子序列所形成的发夹结构上又增添一个发夹结构，这个附加的发夹结构恰好构成了RNase的识别位点和切割位点。,3、翻译产物对翻译的调控作用,控制自身mRNA的,可翻译性,，大多是控制翻译的起始。,1、,RF2合成的自体调控,利用释放肽链的职能提前终止其mRNA的翻译。,mRNA GGG UAU CUU UGAC UAC GAC,23 24 25 26 27 28,RF2,当核糖体蛋白较少时，调控蛋白优先与rRNA结合。,当核糖体蛋白较多时，多余的调控蛋白就与mRNA结合,，核糖体就不能与mRNA结合，从而降低了有关基因产物的合成。,2、核糖体蛋白质合成的自体调控,4、反义RNA对翻译的调控作用,OmpR基因的产物，OmpR蛋白在不同的渗透压具有不同的构象。渗透压低时，与OmpF基因的调控区结合，对OmpF基因的表达起正调控作用，OmpF;渗透压高时，变构，与OmpC基因调控区结合,对OmpC基因的表达起正调控作用，OmpC。,两种蛋白随渗透压的变化而变化，但两种蛋白总量不变,。,