红甘蓝花色苷的提取纯化、稳定性.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,主要内容,研究背景及意义,研究内容与方法,结果与讨论,结论,提取,花色苷,抗氧化,.,清除自由基、降低氧化酶活性,降低高血脂大鼠甘油脂水平,改善高甘油脂脂蛋白的分解代谢；抑制胆固醇吸收,降低低密度脂蛋白胆固醇含量,抗变异、抗肿瘤、抗过敏、保护胃粘膜,消除活性氧自由基,抑制巴拉刈伤害作用,降低血清蛋白和脂质体的过氧化作用、保护肝脏等等,1.,研究背景及意义,生物活性,耐运输,耐贮藏,色泽艳丽,结球结实,病害少,适应性强,栽培广泛,产量高,红甘蓝,红甘蓝花色苷具有降低血清蛋白和脂质体过氧化作用和保护肝脏等作用,可作为天然食用色素,红甘蓝作为花色苷来源的优点,研究意义,红甘蓝花色苷具有制备着色剂、保健品或药物的开发前景。,红甘蓝精深加工的研究，对于促进红甘蓝的种植，帮助菜农增加收入也具有重要意义。,2.,研究内容和方法,2.1,花色苷定量分析,2.2,红甘蓝花色苷的提取,2.3,红甘蓝花色苷的纯化,大孔树脂,2.4,红甘蓝花色苷的稳定性因素研究,PH,值；光照；温度；金属离子；糖；防腐剂；氧化剂和还原剂,分光光度法,高效液相色谱法,溶剂浸提法,超声波辅助法,2.5,红甘蓝花色苷的抗氧化活性测定方法,1.,还原能力的测定,采用普鲁士蓝法测定,2.,清除羟基自由基（,OH,）的测定,采用,Fenton,反应原理及陈乃东（,2007,）等,3.,清除,DPPH,自由基的测定,采用,DPPH,法测定,4.,清除超氧阴离子自由基（,O,2,-,）的测定,采用连苯三酚自氧化法测定,5.,抑制亚油酸过氧化能力的测定,采用铁硫氰化钾法测定,2.6,降脂护肝米醋的实验室制备方法和抗氧化活性研究,1.,降脂护肝米醋的制备,2.,降脂护肝米醋的抗氧化活性研究,清除,DPPH,自由基活性、清除羟基自由基活性和抑制亚油酸过氧化的能力,3.,结果与讨论,3.1,花色苷含量测定,分光光度法,不同,pH,值下花色苷提取物的吸收曲线,盐酸矢车菊色素标准溶液吸收曲线,盐酸矢车菊色素标准曲线,花色苷含量测定,PH,选择,高效液相色谱法,盐酸矢车菊色素标准品色谱图,提取物样品的色谱图,盐酸矢车菊色素的标准曲线,根据标准图谱和样品图谱的保留时间，可知红甘蓝提取物中含有,矢车菊色素,。将样品中矢车菊色素的峰面积（,72060.9,）代入矢车菊色素的标准曲线，算得红甘蓝中矢车菊色素的含量为,0.11,，相当于矢车菊色素,-3-,葡萄糖苷的含量为,0.18,（矢车菊色素的相对分子质量为,284,，矢车菊色素,-3-,葡萄糖苷的相对分子质量为,446,）。,3.2,红甘蓝花色苷的提取,溶剂浸提法,实验号,A,料液比,B,提取温度,C,提取剂浓度,%,D,提取时间,h,提取率,(mg/g),1,1,1,1,1,0.89,2,1,2,2,2,0.84,3,1,3,3,3,0.84,4,2,1,2,3,2.04,5,2,2,3,1,2.06,6,2,3,1,2,1.87,7,3,1,3,2,3.13,8,3,2,1,3,2.90,9,3,3,2,1,2.85,k,1,0.857,2.020,1.887,1.933,k,2,1.990,1.993,1.910,1.947,k,3,2.960,1.853,2.010,1.927,R,2.103,0.167,0.023,0.020,正交试验结果,超声波辅助法,实验号,A,提取温度,B,提取时间,min,C,提取剂浓度,%,D,料液比,提取率,(mg/g),1,1,1,1,1,1.48,2,1,2,2,2,1.62,3,1,3,3,3,1.20,4,2,1,2,3,0.88,5,2,2,3,1,1.39,6,2,3,1,2,1.61,7,3,1,3,2,1.10,8,3,2,1,3,0.91,9,3,3,2,1,1.04,k,1,1.433,1.153,1.333,1.303,k,2,1.293,1.307,1.180,1.443,k,3,1.017,1.283,1.230,0.997,R,0.416,0.154,0.153,0.446,正交试验结果,溶剂浸提法,料液比,1,：,4,，提取温度,30,，乙酸浓度,40%,，提取时间,2 h,超声波辅助法,料液比,1,：,4,，提取温度,40,，乙酸浓度,30%,，提取时间,50min,两种提取方法的综合比较,溶剂法的花色苷提取率,3.02mg/g,比超声辅助法,1.87mg/g,高，在试验中，由于超声波的作用，使得提取液黏度增大，这可能是溶解下来的糖较多，或是红甘蓝纤维素水解所致，原因有待于深入研究。虽然溶剂浸提法比超声波辅助法的提取率高，但超声辅助法与溶剂浸提法相比，可大大缩短提取时间，节约能源消耗和人力消耗，因此，本文后面的试验均采用超声波辅助法提取红甘蓝花色苷。,静态吸附平衡时间 静态解析平衡时间,吸附温度对吸附效果的影响 吸附液浓度的选择,3.3,红甘蓝花色苷的纯化,吸附流速的选择 洗脱溶剂的选择,洗脱流速的选择,研究结果表明，选用,HPD-300,大孔树脂为吸附剂，上样浓度,0.2mg/mL,，流速,1mL/min,，吸附温度,25,；较适宜的解析条件为：洗脱剂为,40%,乙醇溶液，流速为,1mL/min,。纯化后提取物的纯度（按矢车菊色素计算）为,12.2%,。,3.4,影响红甘蓝花色苷的稳定性因素,1.pH,值对最大吸收波长及颜色的影响,pH,值 入,max(nm),颜色,1.0 518,鲜红,2.0 523,红,3.0 526,红,4.0 536,浅红,5.0 542,浅红,6.0 546,紫红,7.0 596,蓝紫,8.0 613,蓝,2.,光照对稳定性的影响,pH,天数,2,3,4,5,6,1,1.173,1.000,0.538,0.406,0.398,2,1.201,0.935,0.528,0.324,0.370,3,1.229,1.041,0.535,0.310,0.352,4,1.230,1.046,0.520,白色絮状,白色絮状,5,1.228,1.033,0.481,白色絮状,白色絮状,6,1.222,1.030,0.470,白色絮状且变臭,白色絮状且变臭,7,1.229,1.042,0.365,白色絮状且变臭,白色絮状且变臭,8,1.210,1.020,0.249,白色絮状且变臭,白色絮状且变臭,9,1.220,1.029,0.210,白色絮状且变臭,白色絮状且变臭,10,1.228,1.029,0.202,白色絮状且变臭,白色絮状且变臭,pH,天数,2,3,4,5,6,1,1.165,1.007,0.537,0.406,0.398,2,1.191,1.006,0.520,0.385,0.369,3,1.176,1.005,0.505,0.329,白色絮状,4,1.121,0.980,0.465,白色絮状,白色絮状,5,1.052,0.923,0.423,白色絮状,白色絮状,6,0.992,0.892,0.374,白色絮状且变臭,白色絮状且变臭,7,0.930,0.855,0.365,白色絮状且变臭,白色絮状且变臭,8,0.860,0.812,0.249,白色絮状且变臭,白色絮状且变臭,9,0.843,0.810,白色絮状,白色絮状且变臭,白色絮状且变臭,10,0.812,0.756,白色絮状,白色絮状且变臭,白色絮状且变臭,自然光,避光,3.,温度对稳定性的影响,室温,40,60,80,温度在,80,以内，酸性及弱酸性条件下的花色苷随着温度升高和加热时间的延长，吸光度变化较小。温度为,100,时，,pH,值为,4,6,的花色苷随加热时间延长，吸光度下降较快，且褪色明显，这是花色苷类色素的母体结构受热生成无色的查尔酮式结构的缘故；,pH,值为,2,3,的花色苷随加热时间延长吸光度变化很小。说明在酸性条件下，红甘蓝花色苷的热稳定性很好。因此，制备红甘蓝花色苷时，应在酸性条件下进行，并且避免长时间高温加热。,100,4.,金属离子对稳定性的影响,Cu,2+,Mg,2+,Fe,2+,K,+,Zn,2+,Ba,2+,Fe,3+,低浓度加入即导致色素液变黄并产生沉淀，并且最大吸收峰消失，无法测其吸光度,5.,糖对稳定性的影响,6.,防腐剂对稳定性的影响,7.,氧化剂和还原剂对稳定性的影响,3.5,红甘蓝花色苷的抗氧化活性测定方法,1.,红甘蓝花色苷还原能力的测定,2.,清除羟基自由基（,OH,）的测定,浓度为,1mg/mL,时，清除率可达到,82.5%,3.,红甘蓝花色苷清除,DPPH,自由基的测定,浓度为,1mg/mL,时，清除率达到,72.2%,4.,红甘蓝花色苷清除超氧阴离子自由基,（,O2-,）,的测定,红甘蓝花色苷对连苯三酚自氧化的抑制效果要明显好于,Vc,。由于连苯三酚自氧化反应速率被抑制的大小显示超氧阴离子自由基被清除作用的强弱，因此，红甘蓝花色苷清除超氧阴离子自由基的能力要明显强于,Vc,。,5.,红甘蓝花色苷抑制亚油酸过氧化能力的测定,浓度为,0.5mg/mL,时抑制作用最强，抑制率为,47.6%,3.6,降脂护肝米醋的实验室制备方法和抗氧化活性的研究,1.,降脂护肝米醋的实验室制备方法,实验号,A,提取温度,B,提取时间,min,C,料液比,D,提取率,(mg/g,),1,1,1,1,1,1.42,2,1,2,2,2,1.95,3,1,3,3,3,2.45,4,2,1,2,3,2.02,5,2,2,3,1,2.46,6,2,3,1,2,1.65,7,3,1,3,2,2.33,8,3,2,1,3,1.60,9,3,3,2,1,2.14,k,1,1.940,1.923,1.557,2.007,k,2,2.043,2.003,2.037,1.977,k,3,2.023,2.080,2.413,2.023,R,0.103,0.157,0.856,0.046,实验确定最佳工艺：提取温度,40,，提取时间,30min,料液比,1,：,3,产品中矢车菊色素含量为：,0.3mg/mL,正交试验,2.,降脂护肝米醋的抗氧化活性研究,DPPH(%),OH(%),亚油酸（,%,）,降脂护肝米醋,Vc,55.5,57.1,58.4,59.0,47.8,35.1,4.,结论,创新点,创新点,1.,首次以东农,-8D50,红甘蓝为原料，对红甘蓝花色苷提取纯化工艺及抗氧化活性进行研究；,2.,研制了功能因子明确的、富含矢车菊色素,-3-,葡萄糖苷的降脂护肝米醋，为企业开发生产新产品奠定了理论基础。,1.,分析方法的确立,确立了花色苷定量分析方法：一是应用分光光度法测定花色苷总含量。以盐酸矢车菊色素为标准品，选用最大吸收波长,523nm,为定量测定波长。花色苷在较小,pH,时，花色苷的摩尔吸光系数较高，因此，待测试样均用,1%HCl,甲醇溶液稀释测定。盐酸矢车菊色素标准溶液工作曲线为,y=0.0315x+0.0012,。相关系数,R2=0.9991,。二是高效液相色谱法，定量分析强酸水解样中盐酸矢车菊色素的量。色谱条件是：用甲醇：甲酸水溶液（,1,：,10,）,=40,：,60,（,v/v,）梯度洗脱作流动相，流速为,1.0mLmin-1,为,530nm,，柱温：室温，进样量：,100L.,盐酸矢车菊色素保留时间为：,3.743min,。标准曲线为,Y=116471X-5454.4,相关系数,0.9906,，盐酸矢车菊色素的平均回收率为,104.5%,，相对标准偏差（,RSD,）为,0.7%,（,n=3,）。,应用了四种抗氧化活性测定方法：清除羟基自由基活性测定方法、清除超氧自由基活性测定方法、清除,DPPH,自由基测定方法和抑制亚油酸过氧化测定方法测定红甘蓝花色苷的抗氧化活性。,2.,红甘蓝中花色苷的提取,在溶剂法中，确定了试验最优提取条件为：料液比为,1,：,4,，提取温度为,30,，提取时间为,2h,，提取溶剂为浓度为,40,的乙酸溶液。此条件下的提取率为,3.02mg/g,。在超声波辅助法中，确定了试验最优提取条件为：提取温度,40,，提取时间,50min,，乙酸浓度,30%,，料液比,1,：,4,。此条件下的提取率为,1.87mg/g,。溶剂法提取率比超声辅助法要好，但提取时间比超声辅助法要长。,3.,红甘蓝花色苷的纯化,在提取物纯化工艺中，引入了大孔树脂纯化技术。大孔树脂纯化红甘蓝提取物的工艺为：选用,HPD-300,大孔树脂为吸附剂，流速为,1mL/min,，上样浓度,0.2mg/mL,，吸附温度,25,；较适宜的解析条件为：洗脱剂为,40%,乙醇溶液，流速为,1mL/min,。按优化条件测其吸附率为,45%,，解析率为,80%,。所得产品纯度按矢车菊色素计算为,12.2%,。,4.,红甘蓝中花色苷的稳定性研究,稳定性研究结果表明，随着,pH,值升高，最大吸收波长红移，红甘蓝色素的颜色由红色逐渐变成蓝色，说明花色苷只有在酸性介质中才能保持其本色,红色，在碱性介质中不能够稳定存在。,光对花色苷的影响比较显著。在酸性条件下，红甘蓝花色苷光稳定性尚好，随,pH,值升高，色素降解严重，褪色加快。而且红甘蓝花色苷在自然光直射下褪色快，在避光条件下褪色慢。因此，以红甘蓝色素着色的产品在储藏和运输过程中要避光保藏。,在,pH2.0,6.0,下，温度为,80,以内，花色苷随着温度和加热时间的延长，吸光度变化较小，表明红甘蓝花色苷热稳定性较好，在温度为,100,时，,pH,值为,4.0,6.0,的花色苷随加热时间延长，吸光度下降较快，且褪色明显。因此，制备红甘蓝色素时，应在酸性条件下进行，并且避免长时间高温加热。,Fe2+,对花色苷稳定性和颜色均无明显影响；,Cu2+,，,K+,，,Zn2+,，,Ba2+,，,Fe3+,，,Mg2+,对红甘蓝花色苷均有不良影响，因此在该色素的加工，保存和运输过程中应避免与其接触。,蔗糖，,D-,果糖和葡萄糖的加入对花色苷稳定性表现出增强作用，且,D-,果糖的效果要明显好于蔗糖和葡萄糖，并且蔗糖，,D-,果糖和葡萄糖的加入对色素的色泽无明显影响。,酒石酸和柠檬酸的加入对花色苷稳定性有增强作用。,Vc,加入对红甘蓝花色苷的稳定性无明显影响，并对色素有增色作用，可以加入色素中使用。,H2O2,的加入导致花色苷稳定性迅速下降，说明氧化剂对红甘蓝花色苷有破坏作用。,5.,红甘蓝花色苷的抗氧化活性研究,红甘蓝花色苷的抗氧化活性研究中，将红甘蓝花色苷水溶液与,Vc,水溶液进行了比较。研究结果表明红甘蓝花色苷具有抗氧化活性，可以有效清除,DPPH,自由基，其清除率可达,72.2%,；羟基自由基清除率可达,82.5%,；超氧自由基清除能力比,Vc,的要强；抑制亚油酸过氧化作用的抑制率可达,47.6%,。,6.,富含矢车菊色素,-3-,葡萄糖苷的降脂护肝米醋的实验室制备和抗氧化活性研究,通过单因素试验和正交试验确立了用,9,哈尔滨正阳河虹桥米醋制备保肝米醋的最优工艺条件为：超声温度,40,，超声时间,30min,，料液比,1,：,3,。产品中矢车菊色素含量为,0.3mg/mL,。产品避光处保存一年矢车菊色素含量无明显变化。,对富含花色苷的降脂护肝米醋的抗氧化活性的研究结果表明，实验室按最佳工艺制备的降脂护肝米醋的抗氧化活性与同浓度的,Vc,抗氧化能力相近。,致 谢,敬请批评指正,