蛋白质结构测定的方法专题.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,蛋白质空间结构国内外研究动态,在国际上,美国首先提出大规模测定蛋白质结,构的计划,现在已经进入第二期的产出阶段,.,其他发,达国家,(,欧盟和日本,),也相继启动自己的结构基因,组计划,.,我国根据美国第一期的试验计划,发现,X,射线晶体学仍然是测定结构的主要手段,这与预期的结果相符,.,过去和现在情况都是这样,蛋白质结构数据库中的,80%,的结构来自,X,射线衍射,.,其他有重要贡献的手段有核磁共振和低温冷冻电镜,(cryo2EM).,由于这三种方法的重要性,最近几年,它们都有很大的改进,.,理论方法的进展也非常快,与实验的结合也越来,越紧密,.,尤其是蛋白质折叠的机制成为研究的热点和,焦点,.,预测蛋白质构象的理论方法,蛋白质折叠的成核理论,同源模型方法,分子动力学,蒙特卡罗方法,折叠识别法,线索化方法,混合方法,从头预测法,等。,同源模型方法,任何两种蛋白质，如果它们的序列等同部分超过,30,，它们就具有相似的空间结构，即两个蛋白质的基本折叠相同，只是在非螺旋和非折叠区域的一些细节部分有所不同。据此，同源模型法的基本思想是：对一个未知结构的蛋白质，首先通过同源分析找到一个已知结构的同源蛋白质，然后，以该蛋白质的结构为模板，为未知蛋白质建立空间结构模型。,分子动力学,蛋白质动态构象模拟的最常用的计算方法是分子动力学,.,分子动力学是在相空间,(,位置和动量空间,),中计算系统随时间变化的轨迹,.,对系统的系综平均就是对系统在时间轨迹上的平均,.,测定蛋白质构象,的实验方法,方法,提供的结构信息,主要指标,应用,X-,光衍射,除了氢以外肽链所有原子排布,衍射点的强度和位置,最重要,NMR,溶液蛋白构象；,构象动力学,化学位移；谱线强度；自璇耦合常数,越来越多,很重要,CD,二级结构及变化,椭圆度,很多,荧光光谱,芳族氨基酸微区；,构象变化,发射、激发光谱,量子产率,很多,紫外差光谱,芳族氨基酸微区；,构象变化,吸收变化,很多,STM,表面原子结构分布,隧道电流及其变化,较多,氢同位素交换,规则二级结构；,氢键数目,与环境水不可交换的肽键氢的数目,较少,激光拉曼光谱,二级结构,拉曼光谱,尚不成熟,小角中子衍射,肽链所有原子排布,散射强度的角分布,起步不久,一 溶液中蛋白质分子构象的研究方法,:,利用各种光谱学方法测定不同条件下蛋白质溶液光谱性质的差异，来确定其构象，以及与功能的关系,（一）吸收光谱,：用不同波长光照射蛋白，检测透光强度，,以吸光度,A,波长,作图。常温，低温,蛋白质吸收来自两个部分：,可见光区,(400-770nm),：来自配基，如,Cytc,Trp=280nm,紫外区,(200-400nm),：蛋白本身,Tyr=275nm,Phe=257nm,肽基团,=190225nm,可见光吸收谱，紫外吸收光谱,（二）荧光光谱法 （,fluorescence spectrum):,有些物质吸收入射光后经过一段很短时间,（,10,-9,10,-8,s,）又发射出波长比原来长的光,荧光,激发能的耗散：热运动 传递给相邻分子,发荧光形式,蛋白自身的荧光,:,Trp,=348nm,；,Phe,=282nm,；,Tyr,=303nm,配基的荧光,:,如叶绿素，,FAD,、藻胆素等,结合人工荧光探针的荧光,量子产率（量）：,Q=,发射的荧光光子数,吸收的光子数,（三）圆二色谱,(CD),原理,:,偏振面：,电场矢量的平面。,平面偏振光（,plane polarized light),：,仅在固定方向上有振动的光。,圆偏振光：,两个电场矢量互相垂直、位相相差,1/4,的平面偏振光加成的光，电场矢量的尖端沿螺旋线前进，从光的传播方向看好似做圆周运动,circularly polarized light,右圆偏振光：,面对光源,电场矢量顺时针转动,左圆偏振光：,面对光源,电场矢量逆时针转动,E,H,入,传播方向,光源 自然光,单色器,单色光,起偏振器,平面偏光,电光调制器,左、右园偏振光,照射样品记录,CD,谱应用：,游离,aa,无圆二色性，所以,CD,谱只与构象有关。,圆二色性（,CD,，,circular dichroism,）,旋光物质对左、右圆偏振光吸收不同，导致振幅变化，从而产生椭圆偏振光的现象。,意义：,核磁共振波谱技术是能够在原子分辨率下测定溶液中生物大分子三维结构的唯一方法,应用：,(),研究生物大分子及其复合物在溶液中的,三维结构和功能,;,(),研究动态的生物大分子之间以及与配基,的相互作用,;,(),研究生物大分子的动态行为,;,(),用固体核磁共振或液体核磁共振技术研,究膜蛋白的结构与功能,;,(),研究蛋白质折叠,折叠动力学,;,(),用于药物筛选与设计,;,(),研究代谢组学,;,(),研究活细胞中的蛋白质蛋白质相互作用,;,(),核磁成像用于认知科学研究,.,（四）核磁共振,(NMR,，,nuclear magnetic resonance),：,原理,:,自旋量子数,I,0,的原子核可旋转并带电，因此而产生磁矩,(,),，在外加电场作用下沿磁场方向取向，同时发生能级分裂（占有能级数为,2,I,+1,），相邻能级能量差都是,E,。当能量为,E=h,电磁波通过时，低能核可吸收电磁波而产生跃迁,核磁共振,NMR,谱与分子结构的关系：,化学位移,:,电子云 感生磁场 对核形成屏蔽,由于电子云产生的感生磁场的屏蔽作用，引起共振时外加磁场强度的移动。,化学位移大小反映出原子核所处的化学环境、在分子中的排布，从而确定基团的性质,自旋耦合：,自旋核的磁距通过成键电子影响邻近的核，引起,后者共振谱线分裂而增多，这种相互作用,自旋耦合,产生核磁共振的方法：,扫描频率：固定外加磁场，改变射频电磁波频率,磁场扫描：固定射频电磁波频率，改变外加磁场强度,NMR,类型：,1,H-NMR,；,13,C-NMR,等,一维谱,:,吸收峰强度对一个频率变量作图,多维谱（二维、三维）,NMR,技术在测定生物大分子结构方面的优点,:,不破坏生物分子的结构,能在溶液环境下测定大分子空间结构,，,测定结构,更,接近生物分子的天然状态,能研究大分子内部的构象动力学,分辨率较高，是测定溶液中大分子构象的最佳的方,法，与,X-,光晶体衍射法互为补充,STM,的工作原理：,扫描隧道显微镜的工作原理是基于量子力学中的隧道效应。对于经典物理学来说，当一个粒子的动能,E,低于前方势垒的高度,V0,时，它不可能越过此势垒，即透射系数等于零，粒子将完全被弹回。而按照量子力学的计算，在一般情况下，其透射系数不等于零，也就是说，粒子可以穿过比它能量更高的势垒，这个现象称为隧道效应。,（五）扫描隧道显微技术（,STM,，,scanning tunneling microscope,）：,扫描隧道显微镜的基本原理是将原子线度的极细探针和被研究物质的表面作为两个电极，当样品与针尖的距离非常接近,(,通常小于,1nm),时，在外加电场的作用下，电子会穿过两个电极之间的势垒流向另一电极。,（,隧道探针一般采用直径小于,1mm,的细金属丝，如钨丝、铂,-,铱丝等，被观测样品应具有一定的导电性才可以产生隧道电流,）,结构分析用的是单色,X-,射线，其波长在,1A,数量级，相当于分子中原子之间的距离。,用于结构分析用的仪器是,X-,射线仪。由,X-,射线管、滤波器、高压系统（,30-50KV),、真空系统,(10-4-10-5 mmHg,柱）和照相机组成。,工作原理：,由,X-,射线管产生的各种波长的,X-,射线，经过滤波器（如镍片等）得到一定波长的单色,X-,射线。单色,X-,射线通过晶体，产生衍射线，用照相机记录下来，得到衍射图，然后，通过对衍射斑点的位置与强度的测定与计算，并参照化学分析的结果，就可确定晶体结构。即：光学,-,实像，通过,FT,转变。,二 蛋白晶体结构研究,x,光晶体衍射技术,1,基本知识,:,(1)X-,射线：波长,0.0110nm,的电磁波,(,单色,X-ray 0.11nm),高能电子,(50kv),轰击,Cu,靶产生,Cu X-ray,（主要,=1.52A,）。最大分辨率,=,/2,；而原子间距离,为,0.1nm,，所以能分辨原子之间的相互关系。,（,2,）晶胞（,unit cell,）,:,*,晶体：离子晶体、原子晶体或分子晶体,*晶胞：平面六面体所形成的重复单位,*晶胞参数：包括,a,b,c,三个边长,及三者的夹角,a,b,c,（,3,）布拉格（,Bragg,）方程：,d,波程差,=BD+CD=2d,sin=n,X-ray,X-ray,在空间的三个方向上都符合该方程，可以求出晶胞的三个边长,B,C,D,(4),分辨率,:,分辨率：所能分清的两相邻质点,的最小间距,分辨力,:,仪器或肉眼所能分清的,两相邻质点的最小间距的能力,若分辨率小于,0.6nm,：只能反映蛋白的大致轮廓,小于,0.45nm,：可分辨多肽链的走向,小于,0.25nm,：可分辨侧链形态和方向,0.15nm,以下：可分辨原子间的相互关系,2,衍射分析方法：,单晶回转法；粉末法；纤维法等,单晶回转法基本原理：,(1),制备蛋白单晶,:,要求均一,大小,0.1mm,(2),重原子同晶衍生物,:,把蛋白晶体 浸在重原子（,Pt,、,Au,、,Hg,、,Pb,等）缓冲液中，使,重原子进入到蛋白晶体中。,(3),X-,射线衍射及数据的收集,（衍射点的亮度、位置等）,(4),衍射数据的分析（晶胞体积、结构振幅、衍射相角）,从而绘制电子云密度图,(5),蛋白结构解析和校正,:,密度大的地方即原子所在部位,入,射,线,R,r,蛋白质晶体培养,蛋白质结晶过程像其他小分子物质一样，是一个有序化过程，即在溶液中处于随机状态的分子转变成有规则排列状态的固体。一般认为要使这种有序化过程开始必须要形成一定大小的晶核，并使分子不断地结合到形成的晶核上。而一个蛋白质溶液能开始形成晶核，就必须使溶液达到过饱和，并保持一定的条件，使溶液中的分子失去自由运动的能量,(,平移、旋转等,),而结合到晶核上，形成新的稳定的化学键,(,次级键,),，使整个体系能量降低而形成晶体。,悬滴法,坐滴法,平衡透析微量扩散小室法,X-,射线结构分析的主要根据是衍射线的方向和强度，即衍射图上斑点的位置与黑度。,衍射线方向：,确定晶胞的大小和形状；,衍射线强度：,确定晶胞中的原子排列。,鲸肌红蛋白,x-,光衍射分析,卟啉环部分,电子密度图,衍射,基团确定,蛋白,结构图,X,射线衍射研究大分子的局限性,进行,X,射线衍射谱的分析，通常高纯度的材料是必须的，首先实验样品应该仔细结晶，去获得高品质的适合,X,射线衍射研究的晶体。即使可以得到合适的结晶，大分子体系结构的测定仍然比小分子要困难得多。这是因为数目众多的大分子体系结构中的原子结构确定很困难。,同时对仪器要求的复杂性及数据分析都需要消耗大量的计算时间。,X,射线衍射必须在分子固相中进行，由此获得的结构信息可能就会与分子体系在生物活性状态的情况有所不同。,近年来，科学家们努力地发展建立了结晶学软件，大大加快了蛋白质结构测定的步伐。以前需要几周甚至几个月才能完成的工作，现在有可能在几小时到几日内完成。,完,