肿瘤个体化治疗基因检测教程.ppt

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病理常规操作,1.病理样本的接收,2.组织固定,3.取材,4.包埋,5.组织石蜡切片,6.HE染色,1.病理样本的接收,1首先核对病理申请单与标本上的红色号码是否一致。,2核查病理申请单上写明的送检标本及数目是否与实际送检标本一致。,3观察送检标本的大小及固定液比例是否合适。(1)穿刺活检及纤支镜所取的小标本，4中性甲醛(10中性福尔马林)固定组织的量应在610倍。(2)对于较大的手术切除标本，应及时切开固定；核对后将病理申请单和标本编上病理标本号。,4将病人姓名、性别、年龄、病历号、科别、临床诊断、部位、标本来源、标本例数等逐项录入电脑存储。,5作为病理资料不仅要做好计算机录入工作，还须进行文字登记，以便病理档案长期保存。,2.组织固定,临床医师切取标本后，应尽快将标本置于盛有足够量固定液的容器内，尽量避免可能出现固定不及时或不充分导致标本干涸或腐败，无法进行切片制作。添加的量应610倍于标本体积.,3.取材及其后期处理,病理科病理医生取材,核对标本及其标志与申请单是否一致。,按照病理取材规范选取病变及正常组织。,对送检标本进行大体描述。,取材后的标本保存至少两周。,放入自动脱水机进行水洗脱水透明浸蜡前处理。,6.HE染色,苏木素伊红染色。,苏木素染细胞核（核酸），伊红染细胞质（蛋白），使组织细胞对比清晰，便于显微镜下观察。,主要流程：二甲苯脱蜡梯度酒精脱二甲苯苏木素染色分化、返蓝伊红梯度酒精、二甲苯封片。,临床技术操作规范病理学分册 2004年第1版,第二章 标本前处理,一、申请单填写,1、登记患者基本情况，包括姓名、性别、年龄、送检单位、床位、门诊号/住院号、送检日期、取材部位、病理诊断、标本病理号等,2、患者签署知情同意书，留下联系方式,3、患者病史及临床情况,患者病史及临床情况登记事项,有无手术（穿刺标本）,手术时间 术前术后有无化疗，化疗方案及化疗效果及毒副作用（相关血项指标、胃肠反应、皮肤反应、神经反应等），治疗的单位。,癌症有无转移，复发或者不能切除,相关病史及家族史,送检标本种类：,外周全血；胸腹水；痰；尿,新鲜(冰冻)标本；,内镜活检标本；,手术标本蜡块或切片,新鲜标本用10%中性福尔马林固定或用,RNAlater,浸泡,20,分钟以上（常温可保存,10,天）,外借病理蜡块，常规病理大小即可,常规石蜡切片（10张白片），5-10um，常温送检,送检标本要求：,样本评估,血：保存温度、时间，是否凝固,胸腹水、尿及痰：涂片HE染色观察结果是否有癌细胞,蜡块或白片：组织保存时间、福尔马林固定时间、组织大小、有无癌细胞,将申请单登记入册,登记基因检测申请号、姓名、送检单位、病理号、检测项目,肿瘤个体化治疗基因检测项目,检测项目,涉及肿瘤,预测内容,样本类型,EGFR,突变,外显子,18,19,21,(CA)n,非小细胞肺癌、食道癌、头颈肿瘤等,预测吉非替尼（易瑞沙）、厄罗替尼（特罗凯）,石蜡白片或胸水300mL,外显子,20(T790M),K-ras,突变,密码子,12,13,61,肠癌、肺癌、胃癌、,甲状腺,癌,预测西妥昔单抗（爱比妥）、帕尼单抗（维克替比）疗效，甲状腺癌辅助诊断,石蜡白片,BRAF,突变,V600E,C-kit,突变,外显子,9,11,17,胃肠间质瘤、肉瘤,预测伊马替尼（格列卫）疗效,石蜡白片,PDGF,突变,外显子,14、18,肿瘤个体化治疗基因检测项目,检测项目,涉及肿瘤,预测内容,样本类型,JAK-2,突变,外显子,12，14,真性红细胞增多症，原发性骨髓纤维化、原发性血小板增多症,辅助临床诊断,2mL,抗凝血或骨髓活检,预测化疗和干扰素疗效,ABL,突变,酪氨酸激酶区点突变,髓细胞白血病,预测伊马替尼（格列卫）疗效,2mL,抗凝血或骨髓活检,Her-2/CEP17,FISH,乳腺癌、胃癌,乳头状癌诊断,石蜡白片,预测曲妥珠单抗（赫赛汀）疗效,VEGF/-actin,VEGFR/-actin,mRNA表达量,肠癌、肺癌、胃癌、乳腺癌、肾癌,预测贝伐单抗（阿瓦斯丁）疗效,石蜡白片+,2mL,抗凝血,肿瘤个体化治疗基因检测项目,检测项目,涉及肿瘤,预测内容,样本类型,ERCC1/-actin,mRNA表达量,肺癌、胃癌、肠癌、卵巢癌、宫颈癌、乳腺癌、胰腺癌、胆囊癌,预测铂类疗效,石蜡白片+2mL抗凝血,预测铂类疗效,BRCA1/-actin,mRNA表达量,紫杉醇类和长春碱类药物疗效,RRM1/-actin,mRNA表达量,肺癌、胰腺癌、胆管癌,预测吉西他滨疗效,石蜡白片+2mL抗凝血,TS/-actin,mRNA表达量,胃癌、肠癌、肺癌、乳腺癌、,预测氟尿嘧啶类药物疗效,石蜡白片+,2mL,抗凝血,肺癌,预测培美曲塞疗效,肿瘤个体化治疗基因检测项目,检测项目,涉及肿瘤,预测内容,样本类型,TOP-A/CEP17,FISH/mRNA表达量,乳腺癌,预测蒽环类药物疗效,石蜡白片+2mL抗凝血,预测蒽环类药物毒性,UGT1A1,启动子区多态性,肠癌、肺癌、胃癌、乳腺癌,预测伊立替康毒性,石蜡白片前处理,1.烤片（90-95，,0.5,小时）,2.脱蜡（过夜，最后一缸换新二甲苯）,3.HE染色,4.镜下区分选择肿瘤组织,4.刮片,5.消化肿瘤组织（200lTL+20lOB酶，552-3h消化时间视具体情况定）,第三章 基因检测前处理,HE染色结果,DNA的提取,1.血DNA的提取,2.石蜡组织DNA的提取,血液DNA提取,250l抗凝血加入250l Buffer BL和25l OB酶，70孵育15分钟。,加入260l无水乙醇震荡混合约20秒。,取上清转入收集柱中，12000rpm离心2分钟。,将收集柱置一新收集管上，加入500l HB solution，12000rpm离心2分钟。,加入700l wash Buffer，12000rpm离心2分钟。,空甩离心，12000rpm2分钟。,将收集柱置一新1.5ml离心管上，加入50l 70预热的洗脱液，静置5分钟，12000rpm离心4分钟洗脱，即为DNA模板。,琼脂糖电泳检测提取DNA质量（或用分光光度计定量并记录）。,Omega Blood DNA kit protocol,石蜡DNA提取,在消化充分的组织中加入220l BUffer BL，震荡混合，于70孵育。,加入220l无水乙醇震荡混合约20秒。,取上清转入收集柱中，12000rpm离心2分钟。,将收集柱置一新收集管上，加入500l HB solution，12000rpm离心2分钟。,加入700l wash Buffer，12000rpm离心2分钟。,空甩离心，12000rpm2分钟。,将收集柱置一新1.5ml离心管上，加入50l70预热的洗脱液，静置5分钟，12000rpm离心4分钟洗脱，即为DNA模板。,琼脂糖电泳检测提取DNA质量（或用分光光度计定量并记录）。,Omega Tissuse DNA kit protocol,电泳图,RNA的提取,1.石蜡组织RNA的提取,2.血RNA的提取,（化疗后需,1200,微升血,白细胞太少,）,1.石蜡组织RNA的提取,RNAlater,样本处理另注,加入,250,lbufferPKD和10l的蛋白酶K,涡旋混匀后，55,C孵育2-3h，80C15min。,然后加入500l的bufferRBC，充分混匀。,将溶液转入gDNA Eliminator spin柱内，10000g离心30s，吸取收集管内液体至新的离心管，重复操作直至溶液都过滤收集柱。,在溶液内加入1200l无水乙醇，混匀，将溶液转入RNeasy MinElute spin柱内，10000g离心15s，弃收集管内液体。,加入500l buffer RPE，10000g离心15min，弃收集管内液体。,加入500l buffer RPE,10000g离心2min。小心将柱取出，放入一新的收集管内，最大速度离心5min（将柱盖打开）,将柱放入1.5ml收集管内，加入40-60l无Rnase酶水，盖上盖子，室温放置2min，最大速度离心1min洗脱RNA.,Qiagen RNEASY FFPE RNA kit protocol,2.血RNA的提取,300l全血+1500l 1 buffer ERL（150l 10 ERL+1350l H,2,O）混匀。同时做3管。,冰上孵育10min，至半透明。,450g 4，10min，弃上清。,600l 1 buffer ERL混匀，洗涤细胞。洗涤后合并3管液体。,450g 4，10min，弃上清。,600l TRK裂解液+12l-巯基乙醇吹打混匀（可以暂时-70冻存）。加等体积70%乙醇，吹打混匀。,将液体转入HiBind RNA提取柱内（2.1,:,核酸降解,1.6:,蛋白质污染,第四章 基因操作,DNA提取,测序反应,上机测序及结果分析,PCR扩增,电泳检验,电泳检验，PCR产物纯化,测序产物纯化,PCR扩增,（以K-ra,s为例）,反应体系为：,10,buffer,dNTP(2mM),Mg2,+,Taq,Genome DNA,Primer-F（10,M,）,Primer-R（10,M,）,H,2,O,2l,2l,0.75l,0.25l,1l,0.4l,0.4l,13.2l,Total 20l,PCR反应条件：,置PCR扩增仪中95预变性15min，用TouchdownPCR，94变性50秒，63-58退火1分钟，72延伸1分钟，共循环10次，94变性50秒，57退火1分钟，72延伸1分钟，共循环30次，最后于72延伸10分钟。,电泳图,用1.5%琼脂糖凝胶电泳观察PCR扩增产物是否为单一目的条带。,PCR产物纯化,1.加100lPCR-A液，混匀，转入纯化柱内，室温静置10min，12000rpm离心2min。,2.弃收集管内液体，加700lwashing buffer，12000rpm离心2min。,3.弃收集管内液体，加400lwashing buffer，12000rpm离心2min。,4.弃收集管内液体，12000rpm离心2min。,5.柱内加30l70,C,预热洗脱液，12000rpm离心2min。,测序反应,（以K-ra,s为例）,反应体系为：,BigDye（2.5X）,0.8,l,BigDyeSeqBuffer（5X）1.,6,l,Primer,0.3,l,PCR纯化产物 1l,ddH,2,O,6.3,l,Total 10l,测序产物纯化,1.每管加1lEDTA（125mM）;1lNaAc（3M）到管里。,2.每管加100l100%酒精，震荡混匀，室温静置15min。,3.10,C;4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min。,4.每管加100l70%酒精，5,C;4000rpm离心30min，马上倒置，1200rpm离心1min。,5.37,C;30min挥发净酒精，加10l Hi-Di溶解DNA。,6.95,C；变性5min，4,C；4min，加样上机。,片段分析操作,PCR扩增,加LIZ、HIDI混合变性,上机测序及结果分析,避光,步骤,1,多重荧光,PCR,：,15,l,PCRmix,五种（胃肠）或七种（尿）引物,0.8,l（其中,D17S283,加,1.2,l）,1,l,DNA.,条件：,95,C,15min,，,94,C,1min,，,56,C,1min,，,72,C,1min,，,30,个,cycle.,l,PCR,产物,0.4,l,LIZ size standard+8l,HiDi,95,C,5min,4,C冰冷,5min,。,上机，分析数据。,Q-PCR操作,RNA提取,Q-PCR仪扩增,结果分析,RT,分光光度计评估质量,详细步骤,1.RT反应:gDNA1l+RNA 6l；上机42,C，2min；离心。RT Buffer 2l，RT酶0.5l，,Primer,0.5l；上机A64程序,。,2.,Q-PCR仪扩增 （反应体系）,2,SYBR 2.5l,Primer 1(5uM)0.5l,Primer 2(5uM)0.5l,RT产物,1,l,Nuclease-free water 1l,Total,5l,7900PCR仪反应程序,95,C 10min；95C 15s；60C 1min，40cycle。,RQ Manager 1.2软件分析实验数据。,第五章 结果解读及诊断报告出具,基因测序结果分析,RNA表达量结果分析,测序结果图及分析,ABI3100测序仪测序，SeqScape v2.0分析结果为。,以K-ras和EGFR为例,K-RAS,基因测序突变类型,K-ras:,K2第12（GGT),13密码子（GGC）,K3第61（,CAA,）密码子,共9种突变类型：,GGT-GAT G12D,GGT-GTT G12V,GGC-GAC G13D,GGT-TGT G12C,GGT-GCT G12A,GGT-AGT G12S,GGT-CGT G12R,GGC-TGC G13C,GGC-GCC G13A,GGC-GTC G13V,7种 98%,3种 2%,EGFR基因测序突变类型：,EGFR 第18,19,20,21外显子和第一内含子（CA）,EG,F,R 19:容易发生缺失,EGFR 21:L858R,EGFR(CA):(CA)n16，EGFR非突变NSCLC患者服用TKI类药物具有短期疗效,EGFR 20:T790M 突变会使患者对EGFR-TKI 类药物产生耐药,EGFR18测序图,EGFR19测序图,EGFR20测序图,EGFR21测序图,EGFR intron 1测序图,RNA表达量结果图及分析,使用仪器为：ABI7900荧光定量PCR仪，分析软件为：RQ Manager 1.2,ERCC1,血液,石蜡组织,BRCA1,血液,石蜡组织,RRm1,血液,石蜡组织,VEGF,血液,石蜡组织,血液,石蜡组织,TS,第六章 资料汇总，资料库建立,将申请单，诊断报告按基因申请号装订成册,按申请项目汇总电子版诊断报告，详细记录病人资料，做患者后续随访纪录治疗效果。,统计总数，计算突变率，统计突变类型。可做纵向质控。,方便后续资料检索查阅,