第14章基因重组和基因工程--本科.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,目录,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,目录,第二节 重组,DNA,技术,又称DNA克隆或分子克隆,DNA Recombination Technique is also Called DNA Cloning or Molecular Clone,重组DNA技术的发展史,1865年 G.J.Mendel的豌豆,杂交试验,。,1944年 O.T.Avery的肺炎球菌,转化实验,。,1973年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个,重组DNA分子,。,1977年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上,第一家遗传工程公司,，专门应用重组DNA技术制造医学上重要的药物。,1980年 开始建造第一家应,用重组DNA技术生产胰岛素,的工厂。,1997年 英国罗林研究所成功的,克隆了多莉,。,148天,技术水平：,分子克隆,(molecular clone),（即,DNA,克隆）,将某一特定,DNA,片段通过重组,DNA,技术插入到一个载体中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的大量完全相同的该,DNA,片段的“群体”。,细胞克隆：由单一的共同祖先细胞分裂形成的细胞,群体。,个体克隆（动物或植物）：基因完全相同的两个或,更多的个体组成的群体。,应用酶学的方法，在体外将各种来源的遗传物质（同源的或异源的、原核的或真核的、天然的或人工的DNA）与载体DNA接合成一具有自我复制能力的DNA分子复制子(replicon)，继而通过转化或转染宿主细胞，筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增提取获得大量同一DNA分子，也称,基因克隆或重组DNA(recombinant DNA),。,DNA,克隆,（,）,DNA克隆,各种来源DNA,载体DNA,复制子(replicon),酶学方法,宿主细胞,转染,转化,转化子细胞,筛选,扩增,提取,获得大量同一DNA分子,生物技术工程,:,基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等,目的：,分离获得某一感兴趣的基因或,DNA,获得感兴趣基因的表达产物（蛋白质）,基因工程,(genetic engineering),实现基因克隆所用的方法及相关的工作称基因工程，又称重组,DNA,工艺学。,（,）,（二）工具酶,限制性核酸内切酶,Klenow,片段：,DNA,聚合酶,大片段,逆转录酶,DNA,连接酶,碱性磷酸酶,末端转移酶,Taq,DNA,聚合酶,重组DNA技术中常用的工具酶,工 具 酶,功 能,限制性核酸内切酶,识别特异序列，切割DNA,DNA连接酶,催化DNA中相邻的5磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸二酯键，使DNA切口封合或使两个DNA分子或片段连接,DNA聚合酶,合成双链,cDNA,分子或片段连接,缺口平移制作高比活探针,DNA,序列分析,填补,3,末端,Klenow片段,又名DNA聚合酶I大片段，具有完整DNA聚合酶I的5,3,聚合、,3,5,外切活性，而无,5,3,外切活性。常用于,cDNA第二链合成，双链DNA 3,末端标记等,反转录酶,合成,cDNA,替代,DNA,聚合酶,I,进行填补，标记或,DNA,序列分析,多聚核苷酸激酶,催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针,末端转移酶,在3羟基末端进行同质多聚物加尾,碱性磷酸酶,切除末端磷酸基,限制性核酸内切酶,(,restriction endonuclease),限制性核酸内切酶,(restriction endonuclease,RE),是识别DNA的特异序列,并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,定义：,（,）,此酶存在于细菌体内，与甲基化酶共同构成细菌的限制-修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。,、（基因工程技术中常用型）,分类：,作用：,第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；,第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；,第四个字母代表株；,用罗马数字表示发现的先后次序。,命名：,H,in,d,属,系,株,序,H,aemophilus,in,fluenzae,d,株,流感嗜血杆菌,d,株的第三种酶,双链DNA中含有两个结构相同、方向相反的序列，称为反向重复序列，也叫回文结构。即每条单链以任一方向阅读时与另一条链以相同方向阅读时的序列是一致的。,限制酶（型）识别及切割位点,类酶识别序列特点,回文结构,（,）,Bam,H,GTC,CAG,G,CCTAG,GATCC,G,+,GGATCC,CCTAGG,Hin,d,GTCGAC,CAGCTG,GAC,CTG,+,平端切口,（切割点是识别序列的对称轴）,粘端切口,切口：,平端切口、粘端切口,5粘性末端 3粘性末端,3突出粘性末端,GATCC,G,+,5,突出粘性末端,GATCC,G,+,G,CCTAG,5,G,CCTAG,3,来源不同的限制酶，但能识别和切割同一位点，这些酶称,同功异源酶,。,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bam,H,GGATCC,CCTAGG,G,CCTAG,GATCC,G,+,Bst,同功异源酶：,有些限制性内切酶虽然识别序列不完全相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端，称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配伍未端(compatible end)。,Bam,H,Bg,l,GGATCC,CCTAGG,AGATCT,TCTAGA,G,CCTAG,GATCC,G,+,+,A,TCTAG,GATCT,A,同尾酶,名称 识别序列及切割位点,名称识别序列及切割点,切割后产生突出末端:,BamH,5G,GATCC.3,Bgl,5A,GATCT.3,EcoR,5G,AATTC.3,Hind,5A,AGCTT.3,Hpa,5C,CGG.3,Mbo,5,GATC.3,Nde,5GA,TATG.3,切割后产生3突出末端:,Apa,5GGGCC,C.3,Hae,5PuGCGC,Py.3,Kpn,5GGTAC,C.3,Pst,5CTGCA,G.3,Sph,5GCATG,C.3,切割后产生平末端:,Alu,5AG,CT.3,EcoR,5GAT,ATC.3,Hae,5GG,CC.3,Pvu,5CAG,CTG.3,Sma,5CCC,GGG.3,限制性内切核酸酶,（三）目的基因,(target gene),（,）,cDNA,(complementary DNA),指经反转录合成的、与,RNA(,通常指,mRNA,或病毒,RNA),互补的单链,DNA,。以单链,cDNA,为模板、经聚合反应可合成双链,cDNA,。,基因组,DNA(genomic DNA),指代表一个细胞或生物体整套遗传信息,(,染色体及线粒体,),的所有,DNA,序列。,（四）基因载体,定义,为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些,DNA,分子。,常用载体,（,）,质粒,DNA,、噬菌体,DNA,、病毒,DNA,这些载体均需经人工构建，除去致病基因，并赋予一些新的功能，如有利于进行筛选的标志基因、单一的限制酶切点等。,载体的选择标准：,能自主复制；,具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定；,有克隆位点（外源,DNA,插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；,分子量小,，,以容纳较大的外源,DNA,。,克隆载体,(cloning vector),为使插入的外源,DNA,序列被扩增而特意设计的载体称为,克隆载体,。,表达载体,(expression vector),为使插入的外源,DNA,序列可转录翻译成 多肽链而特意设计的载体称为,表达载体,。,质粒,(plasmid),特点:,能在宿主细胞内独立自主复制；带有某些遗传信息,会赋予宿主细胞一些遗传性状。,概念：,是存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，大小为1-200kb。,耐四环素基因,耐氨苄青霉素基因,噬菌体,DNA,改造系统,gt,系列（插入型，适用,cDNA,克隆）,EMBL,系列（置换型，适用基因组克隆）,噬菌体,(phage),M13,噬菌体,DNA,改造系统（含,lacZ,基因）,M13mp,系列,线性双链DNA分子，大小约50kb。,酵母人工染色体,(yeast artificial chromosome,YAC),柯斯质粒载体,(,cosmid,vector),动物病毒,DNA,改造的载体,（如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）,3.其他,以,质,粒,为,载,体,的,DNA,克,隆,过,程,二、重组DNA技术基本原理,（,）,目的基因的获取,DNA导入受体菌,外源基因与载体的连接,克隆载体的选择和构建,重组体的筛选,克隆基因的表达,（一）目的基因的获取,化学合成法,要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。,基因组,DNA,文库,(genomic DNA library),cDNA,文库,(cDNA library),聚合酶链反应,(polymerase chain reaction,PCR)(,见第,22,章,),已知目的基因的核苷酸序列,已知基因产物的氨基酸序列。,化学合成法,推导出编码基因核苷酸序列,化学合成仪,合成目的基因,一般用于小分子活性多肽基因的合成。如胰岛素原、,干扰素基因等。,化学合成法获取目的基因,由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。,组织或细胞染色体DNA,基因片断,克隆载体,重组DNA分子,含重组分子的转化菌,限制性内切酶,受体菌,基因组DNA文库,存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合,从基因组,DNA,文库获取目的基因,限制酶切位点,限制酶消化,除去中间片段,cos L,R cos,cos L,左臂,R cos,右臂,真核生物染,色体DNA,限制酶部分消化,外源DNA与载体DNA混合,连接反应,体外包装,用重组噬菌体,感染大肠杆菌,20 Kb DNA 片段,cos L,R cos,20 Kb 外源 DNA 片段,基因文库,用随机切割的真核生物染色体DNA片段构建基因文库,以mRNA为模版，反转录合成cDNA，与载体拼接后导入受体菌，即获得cDNA文库。由总mRNA 制作的cDNA文库包含了细胞表达的各种mRNA信息，自然也含有我们感兴趣的基因。目前发现的多数蛋白质的编码基因都是如此分离的。,从,cDNA,文库获取目的基因,mRNA,cDNA,双链cDNA,重组DNA分子,cDNA文库,反转录酶,载体,受体菌,复制,从,cDNA,文库获取目的基因,逆转录酶,A A A A,T T T T,AAAA,SI核酸酶,DNA,聚合酶,碱水解,T T T T,（二）克隆载体的选择和构建,外源DNA片断离开染色体是不能复制的，,必须借助载体，随载体的复制而复制，重组DNA技术中克隆载体的选择和改进是一种极富技术型的专门工作，目的不同、操作基因的性质不同载体的选择和改建方法也不同。,（三）外源基因与载体的连接,粘性末端连接,即DNA的体外重组，靠DNA连接酶将外源基因与载体共价连接，其连接方式主要有：,1）同一限制酶切位点连接,2）配伍末端连接,2、平端连接：,非配伍粘性末端经特殊酶处理，使单链突出处被补齐或削平，变为平端，也可实行平端连接。,目的基因,载体,限制性内切酶,限制性内切酶,T4 DNA连接酶,15,C,重组体,载体自连,目的基因,自连,3、同聚物加尾连接,在末端转移酶作用下，在DNA片断末端加上同聚物序列，制造出粘性末端，而后进行粘性末端接。,4、人工接头连接,对平端DNA片断或载体DNA可在连接前将磷酸化的接头或适当分子连到平末端，使产生新的酶切位点，再用识别新位点的限制酶切割，产生粘性末端，这也是粘性末端连接的一种特殊形式。,（四）重组DNA导入受体菌,外源,DNA(,含目的,DNA),与载体在体外连接成重组,DNA,分子后，需将其导入受体细胞,(,形成转化子,),。随受体细胞生长、增殖，重组,DNA,分子也复制、扩增，这一过程即为无性繁殖。,受体菌条件：,1,）容易接纳重组分子,2,）对载体的复制扩增无严格要求,3,）不存在特异的限制,-,修饰酶体系降解或修饰,外源,DNA,4,）符合“重组,DNA,操作规则”的安全标准。,1.,直接选择法,(1)抗药性标记选择,(2)标志补救(marker rescue),(3)分子杂交法,原位杂交,Southern印迹,2.免疫学方法,如免疫化学方法及酶免检测分析等,（五）重组体的筛选,对于带有抗药基因的质粒重组体，可采用插入灭活法进行筛选。,抗药性标记选择(插入失活法),概念：若克隆的基因能够在宿主菌表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷互补，那么就可以利用营养突变菌株进行筛选，这就是标志补救。,例如：,标志补救,组氨酸缺陷,型大肠杆菌,无组氨酸,的培养基,酵母咪唑甘油磷,酸脱水酶基因,促进组氨酸合成,噬菌体DNA,重组体,标志补救,互补(alpha complementation),Lac Z,-半乳糖苷酶,N端146个氨基酸残基,C端,2个片段组合后有活性，可使X-gal水解成深蓝色产物。,X-gal,（5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖）,形成蓝色菌落,蓝白筛选示意图,互补,利用互补原理筛选重组体pUC18,重组DNA技术操作过程可形象归纳为：,小结,（,）,分,分离目的基因,切,限制酶切目的基因与载体,接,拼接重组体,转,转入受体细胞,筛,筛选重组体,重组DNA技术操作的主要步骤,（,）,载体,质粒,噬菌体,病毒,目的基因（外源基因）,基因组DNA,cDNA,人工合成,PCR产物,限制酶消化,开环载体DNA,目的基因,连接酶,重组体,转化,体外包装，转染,带重组体的宿主,筛选,表型筛选,酶切电泳鉴定,菌落原位杂交,蛋白质表达体系的建立：,表达载体的构建,受体细胞的建立,表达产物的分离纯化,（六）克隆基因的表达,表达体系包括原核表达体系和真核表达体系两类。,1.原核表达体系,（,E.coli表达体系最为常用,）,标准：,选择标志强启动子,翻译调控序列多接头克隆位点,E.coli表达体系的不足,不宜表达真核基因组DNA,不能加工表达的真核蛋白质,表达的蛋白质常形成不溶性包涵体,(inclusion body),很难表达大量可溶性蛋白,（,）,优点：,可表达克隆的cDNA及真核基因组DNA,可适当修饰表达的蛋白质,表达产物分区域积累,缺点：,操作技术难、费时、经济,2.真核表达体系,酵母、昆虫、哺乳类动物细胞,应用较多的哺乳类细胞是,（,）,COS细胞（猿猴肾细胞）,CHO 细胞（中国仓鼠卵巢细胞）,第三节,重组DNA技术与医学,的关系非常密切并前景远大,DNA Recombination Technique is Closly Related with Medicine and has a Good Perspective,一、疾病基因的发现与克隆,根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。,疾病基因发现的两个典型例子,:,脆性X综合征,Kallmann综合征,二、生,物制药,利用基因工程生产有药用价值的蛋白质、多肽产品已成为当今世界一项重大产业，并将有望成为,21,世纪的支柱产业。,美国,Eli Lilly,公司于,1982,年首先利用重组,DNA,技术合成人胰岛素并投放市场，标志着生物工程药物时代的开始。迄今为止，已有,50,多种基因工程药物上市，近千种处于研发状态，形成一个巨大的高新技术产业，产生了不可估量的社会效益和经济效益。,重组DNA医药产品,产 品,功 能,组织胞浆素原激活剂,抗凝,血液因子VIII,促进凝血,颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子,剌激白细胞生成,促红细胞生成素,剌激白细胞生成,生长因子(bFGF,EGF),刺激细胞生长与分化,生长素,治疗侏儒症,胰岛素,治疗糖尿病,干扰素(,1b,2a,2b,),抗病毒感染及某些肿瘤,白细胞介素,激活、剌激各类白细胞,超氧化物歧化酶,抗组织损伤,单克隆抗体,利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗,乙肝疫苗(CHO,酵母),预防乙肝,口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗,预防霍乱,（一）,基因诊断,(genetic diagnosis),基因诊断,是,利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。,（,）,三、基因诊断与基因治疗,基本过程,区分或鉴定DNA的异常,分离、扩增待测的DNA片断,标准,.,能正确扩增靶基因；,.能准确区分单个碱基的差别；,.本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定;,.便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。,（二）基因治疗,1.定义,（,）,基因治疗(gene therapy)是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。,2.方式,体细胞基因治疗(somatic cell gene therapy),性细胞基因治疗(germ line gene therapy),四、遗传疾病的预防,1.产前诊断,2.携带者测试,3.症候前诊断,4.遗传病易感性,