第一章-基因工程.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,基因工程主要内容,一、,基因及基因工程概述,二、基因工程理论基础,三、DNA重组技术,1 DNA,重组路线,2,基因工程中用的酶,3,基因工程载体,4,目的基因的获得,5,重组,DNA,导入受体细胞,6,重组体筛选与鉴定,7,目的基因的高效表达,四、基因工程的应用及发展前景,1,第一节 基因及基因工程概述,1 基因工程的发展历程,2 基因工程的概念,3 基因工程的主要内容,2,1 基因工程的发展历程,孟德尔定律：生物每一个性状都是通过,遗传因子,来传递的，遗传因子是一些独立的遗传单位。这样把可观察的遗传性状和控制它的内在的遗传因子区分开来了，遗传因子作为基因的雏形名词诞生了。,1903年萨顿和鲍维里两人注意到在杂交试验中遗传因子的行为与减数分裂和受精中染色体的行为非常吻合，他们作出“,遗传因子位于染色体上,”的“萨顿鲍维里假想”。,1909年丹麦遗传学家约翰逊在精密遗传学原理一书中提出“,基因,”概念，以此来替代孟德尔假定的“遗传因子”。从此，“基因”一词一直伴随着遗传学发展至今。,3,1972年 美国P.Berg领导的研究小组完成DNA体外重组，获得了猿猴病毒SV40和DNA的,重组杂种DNA分子,1973年，S.Cohen等人成功的将外部质粒基因重组导入大肠杆菌内，获得了既,抗卡那霉素又抗四环素,的菌落,1982年开发出第一个,基因工程药物,：胰岛素,6,基因工程三大理论基础,遗传物质是,DNA,DNA,的双螺旋结构,遗传信息传递方式：中心法则,技术上的三大发明,工具酶,载体,逆转录酶,7,2 基因工程的概念,基因工程,的定义：按照人们的愿望对携带遗传信息的分子（DNA）进行设计和改造的分子工程，包括基因重组、克隆、表达；其核心是构建重组DNA的技术。,（P21）,8,3 基因工程的主要内容,基因工程实施4个必要条件,：,工具酶,基因,载体,受体细胞,9,带有目的基因的DNA片断的分离或人工合成,在体外，将带有目的基因的DNA片断连接到载体上，形成重组DNA分子,重组DNA分子导入受体细胞,带有重组DNA分子的细胞培养，获得大量的细胞繁殖群体,重组体的筛选,重组体中的目的基因的功能表达,基因工程研究的主要内容,10,11,第二节 基因工程理论基础,DNA,的结构与复制,DNA,的变性、复性与杂交,RNA,的转录与逆转录,基因的表达与调控,12,1 DNA的结构与功能,1）DNA的分子组成与基本结构,2）DNA分子的二级结构,3）DNA的复制,13,1）DNA的分子组成与基本结构,DNA的分子组成与一级结构,核酸,磷酸,核苷,戊糖（核糖,或脱氧核糖,）,含氮碱基（嘌呤,或嘧啶）,核苷酸,14,碱基,嘧啶碱,嘌呤碱,15,核苷：NC键，糖环上的C1与嘧啶碱,的N1或与嘌呤碱的N9相连接,16,（3）核苷酸：戊糖羟基被磷酸化，多是5-核苷酸。用碱水解RNA，可得到2-与3-核糖核苷酸的混合物,17,脱氧核糖核酸（DNA）,（1）Chargaff法则,AT，GC，AGTC,DNA的碱基组成具有种的特异性,（2）DNA的一级结构，形成3,5-磷酸二酯键,18,DNA双螺旋模型基本特点,两条反向平行的多核苷酸围绕同一中心轴相互缠绕,嘌呤与碱基位于双螺旋的内侧，磷酸在外测,双螺旋的平均直径为,2nm,两条核苷酸依靠彼此之间形成的氢健相联系而结合在一起,碱基在一条链的顺序不受任何限制，但是两条链之间互补。,2）DNA的二级结构,19,3)DNA的复制,复制方式：半保留复制,，,复制的起点和过程：在特定位点（复制起始点）开始，在通常情况下，复制是双向的和对称的，每一条双链链都是由一条亲链和一条子链组成，复制高度忠实。复制在起始阶段进行控制，一旦复制开始，即继续下去，直到整个复制子（能独立进行复制的单位）完成。,20,DNA复制过程（原核生物）,DNA复制叉上进行的基本活动包括,双链的解开,RNA,引物的合成,DNA,链的延长,切除,RNA,引物，填补缺口，连接相邻的,DNA,片断,切除和修复渗入,DNA,的脱氧尿苷酸和错配碱基,21,真核生物的DNA复制,有许多复制起点,在全部复制完成之前，不再新的复制,首先复制的是常染色质细胞，然后才是异染色质,亲代核小体的组蛋白全保留,22,2 DNA的变性、复性与杂交,核酸的变性、复性和杂交,变性：氢键断裂，形成单链，不涉及共价键,复性：两条彼此分开的链，重新缔合,核酸的杂交：异源DNA之间，或DNA与RNA之间会形成杂交,23,3 RNA的转录与逆转录,1）RNA的结构,2）RNA的转录,3）RNA的逆转录,24,1）RNA的结构,核糖核酸,（1）主要由腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶（U）核糖核苷酸组成,（2）RNA一级结构：,形成于,3,5-,磷酸二酯键,单链线形分子，只是局部区域为双螺旋结构,（,3,）,RNA,类型：,核糖体,RNA,，,rRNA,5S,，,5.8S,，,16S,，,23S,转运,RNA,，,tRNA,4S,沉降,信使,RNA,，,mRNA,变化范围大,25,26,27,2）RNA的转录,RNA聚合酶,原核生物,真核生物,28,在体外，两条链可同时转录，在体内仅有一条链，或某些区域以这条链转录，另一条区域以另一条链转录,以完整双链,DNA,为模板，,DNA,链局部解开，转录后双链仍然保持双链的结构,转录分为起始、延长和中止三个步骤,合成方向,5 3,方向,3）,转录过程,29,30,3）,RNA的逆转录,逆转录酶：研究致癌RNA病毒过程中发现,属于多功能酶：,以,RNA,为模板合成,DNA,链，形成杂交分子,以新合成,DNA,为模板合成互补,DNA,链,具有,3 5,和,5 3,核酸外切酶作用,31,逆转录过程：致癌RNA病毒进入细胞逆转录酶合成双链DNA（前病毒）环化并进入细胞核整合进宿主细胞并转录,32,4,基因的表达与调控,基因的分类和结构,结构基因,：决定某一种蛋白质分子结构相应的一段DNA,调节基因,：带有阻遇蛋白基因，控制结构基因活性,操纵基因,：与阻遇蛋白结合，结构基因无活性，当诱导物与阻遇蛋白结合，操纵基因打开控制结构基因的开关,33,操纵子,：细菌基因的表达和调控单位，包括结构基因、调节基因和由调节基因所控制的序列。,启动子,：与RNA聚合酶识别，结合和开始转录的一段DNA序列,中止子,：提供转录停止信号的DNA序列,外显子,：真核基因的编码区域,内含子,：真核基因中结构基因中的非编码区域,34,原核生物中的基因的表达和调控,组成型：,即基因的转录、地点、水平基本不受发育阶段或组织特异性的调控，始终处于转录状态。,调控型：,低分子量化合物与调控蛋白之间的相互作用，或诱导基因的转录，或抑制基因的转录，如大肠杆菌乳糖操纵子模型,35,36,真核生物中基因的表达和调控,基因转录调控,功能有关的结构基因分布在染色体不同部位，甚至不同的染色体上,体内调控信号常来自体内的激素,真核生物存在增强子，对转录起增强作用，有时必不可少,基因翻译调控,形成正确的二硫键,切割前体,蛋白质糖基化,对氨基酸的修饰,37,第三节 DNA重组技术,1 DNA重组路线,2 基因工程中用的酶,3 基因工程载体,4 目的基因的获得,5 重组DNA导入受体细胞,6 重组体筛选与鉴定,7 目的基因的高效表达,38,一、DNA重组技术路线,DNA重组技术也称为DNA克隆或分子克隆或称为基因克隆,就是将DNA 限制性酶切片段插入克隆载体，导入宿主细胞，经过无性繁殖，以获得相同的DNA扩增分子,39,典型DNA重组技术的步骤,分,获取目的基因和载体,接,目的基因与载体的连接,转,重组DNA导入宿主细胞,筛,重组DNA的筛选与鉴定,检,检测外源基因是否表达,P 25,40,1、获取,DNA重组基本过程,41,2、重组,42,3、转化,43,4、筛选,44,5、克隆,45,6、表达,表达产物分离纯化,46,二、,基因工程工具酶,基因工程中的工具酶主要是指,用于,DNA,和,RNA,分子,的,切割、,连接,、,聚合、修饰、反转录等,有关的各种酶,系,统。,可分为三类,分类：,限制性内切酶,连接酶,修饰酶,47,1、限制性核酸内切酶(RE)(P26),是一类能专一识别双链DNA中的特定核苷酸序列、并在适当的反应条件下使特定磷酸二酯键断裂，产生3OH或5P的核酸内切酶，简称,限制酶,或,切割酶,。,根据,限制酶的,作用特性，一般分为三类：,、和型，,其中常用的是,型限制酶,。,48,型限制性内切酶的特点,1）识别特定的核苷酸序列，识别位点大多是,回文 结构,长度多为4,6个bp,回文序列,是指该部位的核苷酸序列呈180,O,旋转对称;,GG,A,T,CC,CC,T,A,GG,49,型限制性内切酶的特点,2）具有特定的酶切位点，并产生特定的酶切末端,主要产生3种缺口：,5粘性末端,3粘性末端,平端或钝端,粘性末端,是指经内切酶特异切割后产生的5末端突出或3末端突出的碱基序列相互具有互补性,。,50,产生5-粘性末端,产生3-粘性末端,-,G,-,C,T,T,A,A,5,3,A,A,T,T,C,-,G,-,3,5,-,G,-,C,T,T,A,A,5,3,A,A,T,T,C,-,G,-,3,5,+,EcoR,I,51,产生平(头末)端/钝端,52,型限制性内切酶的特点,3）II限制修饰系统由限制内切酶和甲基化酶组成,4）有些酶来源不同，但能识别相同的顺序，或产生相同的末端,特殊性质,的,型限制酶,同裂酶（,异源同工酶,）,同尾酶,可变酶,53,同裂酶,又称异源同工酶。指来源不同，但具有,相同的识别,序列,。,在切割DNA时，其,切割点,可以是,相同,的，产生平头末端，称为,同识同切,；,切割点,也可以是,不同,的，产生3,或5粘性末端，称为,同识异切,。,54,同裂酶,同识,同,切,55,同裂酶,同识,异,切,56,同 尾 酶,同尾酶,指来源不同，但识别与切割顺序有一定的相关性的一类酶。它们作用后,产生相同,的,粘性末端,。,57,可变酶,可变酶,识别顺序中的一个或几个碱基是可变的，,并且识别顺序往往超过6个碱基对。,如，,Bst,p，其识别顺序为GGTNACC。,58,2、DNA连接酶(DNA ligase),DNA连接酶可以催化带有粘性末端或平头末端的双链DNA中一条链的3OH与另一条链的5PO,3,H,2,形成磷酸二酯键而相连，从而构成一条完整的DNA长链。,DNA连接酶的用途,（1）两个双链DNA片段连接起来,5-ACG AATTCGT-3,T,4,DNA连接酶,5-ACGAATTCGT-3,3-TGCTTAA GCA-5 3-TGCTTAAGCA-5,（2）修补带有缺口的双链DNA分子,T,4,DNA连接,酶,59,3、DNA聚合酶,（,最常用的DNA聚合酶有以下4种,）,DNA聚合酶,DNA聚合酶大片段Klenow片段,T,4,噬菌体DNA聚合酶,Taq DNA聚合酶,60,DNA聚合酶,E.Coli,DNA聚合酶（DNA pol）是一个具有,3 种酶活性的多功能性酶。,包括：,5,3,DNA,聚合酶活性,5,3,核酸外切酶活性,3,5,核酸外切酶活性,61,Klenow片段（DNA pol I大片段）,62,Klenow片段用途,补齐双链DNA的,3末端；,用标记碱基补,齐3,末端；,在cDNA克隆中，,用于第二股链,的合成；,DNA序列分析。,63,T,4,噬菌体DNA 聚合酶,作用特点,1）具有,53DNA 聚合酶活性,和,35核酸外切酶活性,，类似DNA pol,I大片段,2）不从单链DNA模板上置换寡核苷酸链,3）最适合用于体外突变反应,64,Taq,DNA pol（耐热DNA聚合酶）,作用特点,1）Taq DNA pol催化DNA合成的最适温度范围,70,75，,2）95以上高温，半小时不失活，,3）最适合用于聚合酶链反应（PCR）。,65,4、逆转录酶,逆转录酶是一类依赖于RNA的DNA聚合酶,特点：,逆转录酶是一个多功能性酶，至少具有以下3种酶活性：,以单链RNA 为模板，催化合成DNA单链,具有RNase H 活性，能水解RNA:DNA杂交链中的 RNA,以DNA为模板，催化合成cDNA双链。,66,67,逆转录酶的应用：,将mRNA逆转录成cDNA，构建cDNA文库；,补平和标记5,-末端突出的DNA片段；,代替Klenow酶用于DNA序列分析；,制备杂交探针等。,68,5、碱性磷酸酶,碱性磷酸酶(BAP)能够催化水解去除DNA或RNA5-端的磷酸基团。,用途,制备载体时，用碱性磷酸酶处理去除载体分子 5端磷酸基后，可防止载体自身环化连接，提高重组效率。,用,32,P标记5-端前，去除5-P，再通过激酶作用把放射性核苷酸加到5-端进行标记。,69,重要的工具酶,工具酶,活性,限制性核酸内切酶,识别特异序列，切割DNA,T4 DNA连接酶,催化DNA5,-磷酸与3,-羟基,形成磷酸二酯键,DNA聚合酶,以DNA为模板合成DNA,逆转录酶,以RNA为模板合成DNA,碱性磷酸酶,切除末端磷酸,T4多聚核苷酸激酶,催化核酸5-羟基磷酸化,末端脱氧核苷酸转移酶,催化3-端合成同聚体尾,70,四 基因克隆常用的载体,载体(vector),是将外源DNA(目的DNA)片段引入宿主细胞的运载工具，其化学本质为DNA。,主要内容,载体必须具备的基本条件,载体的种类,常用的载体,71,一）载体必须具备的基本条件,有自身的,复制子,，能独立复制,具备多个限制酶的识别位点(,多克隆位点,),具有,遗传表型或,筛选,标记,有,足够的容量,以容纳外源DNA片段。,表达型载体,还应具备与宿主细胞相适应的,启动 子、前导序列、增强子、终止子,等调控元件。,载体DNA中均有一段,非必需区,，将外源基因插入 该非必需区，而载体本身不受影响。,7.载体必须安全,72,二）载体的种类,（一）,克隆载体,以繁殖DNA为目的的载体,（二）,表达载体,用来将克隆到的外源性基因在宿主细胞内表达成蛋白质的载体,除具有克隆载体所具有的性质外，还带有表达构件转录和翻译所必需的DNA顺序。,73,三）常用的载体,（一）质粒(plasmid)：,是存在于细菌染色体外的、,能自主复制的双链环状DNA分子。,作为克隆载体的质粒应具备以下特点：,1.分子量相对较小，能稳定存在于细菌体内，,有较高的拷贝数,2.具有1个以上的遗传标志，便于筛选,3.具有多克隆位点,74,总而言之，质粒载体应该是一种分子量较小、高拷贝的“松弛型”质粒，且具有一个以上遗传标志和多克隆位点的质粒。,广泛应用的质粒：,pBR32质粒、pUC系列等,75,pBR322质粒（,p plasmid BR构建者 Boliver 和 Rodriguez 322实验标号,4361 bp,含一个复制点,含一个抗氨卞青霉素标,记,(,amp,R,),一个抗四环素标记,(,tet,R,),amp,R,和,tet,R,基因内各有一些限制酶的酶切位点，供外源基因插入,当外原基因插入抗药基因位点时，,Amp,R,Amp,敏感,(,Amp,S,),、,Tet,R,Tet,敏感,(,Tet,S,).,76,pUC系列质粒,由pBR322和M13噬菌体构建而成的双链质粒载体；,（1）2674bp；,（2）有amp,r,和与M13噬菌体,相同的多克隆位点（MCS）,（3）有一个来自大肠杆菌的LacZ操纵子的DNA片段,编码半乳糖苷酶,77,(二)噬菌体载体,组成特点：,双链线状DNA分子，,全长50kb,含65个基因,左臂、右臂、中央片段,在其分子两端各含有12个碱基的互补单链，是天然的粘性末端，被称为COS位点。,1、,噬菌体,78,噬菌体感染细菌后的溶菌性生长和溶源性生长,溶菌性生长（lytic pathway）,噬菌体感染细菌后，借助其2个COS位点互补,成环,，在宿主菌体内,连续复制,，合成大量基因产物，进而装配成噬菌体颗粒，,裂解宿主菌,，释放出来的噬菌体又可感染其他细菌。,溶源性生长(lysogenic pathway),噬菌体感染细菌后，可将自身DNA,整合,到细菌的染色体中去，与之,一起复制,，并遗传给子代细胞，宿主细胞不被裂解。,79,噬菌体两种生长途径（示意图）,80,噬菌斑,81,2、COS质粒,柯斯质粒(cosmid)是人工构建的带有粘性末端cos的一类质粒，其主要组成有:,质粒的复制起始区和抗药标记,、,一种或多种限制酶的,单一切点,DNA的COS区小片段(约20至数百个碱基对),。,因而这类质粒兼具,噬菌体和质粒的优越性,，又具有高容量的克隆能力，容纳外源DNA的长度可达45kb左右,82,Cos质粒的特点,第一，具有噬菌体的特性。,第二，具有质粒载体的特性。,第三，具有高容量的克隆能力。,第四，具有与同源序列的质粒进行重组的能力。,83,84,（三）其他载体,动物病毒DNA改造的载体,（如腺病毒，疱疹病毒相关病毒，逆转录病毒）,酵母人工染色体（p32）,(yeast artificial chromosome,YAC),细菌人工染色体,(bacterial artificial chromosome,BAC),PAC（P1-Derived artificial chromosome),哺乳动物人工染色体,（mammalian artificial chromosome,MAC),85,四）宿主系统,易于接受外源DNA,无限制酶,无重组能力,易于生长和筛选,安全,86,五、目的基因的获取（,分,）,目的基因,是指所要研究或应用的基因，也是需要克隆或表达的基因。,目的基因来源,1）制备基因组DNA,2）制备cDNA,3）聚合酶链反应,4）人工合成基因,87,（一）制备基因组DNA,（基因组,文库概念 P34）,分离、纯化基因组DNA,条件：,温和，在EDTA或SDS等存在下,RE,用蛋白酶K消化细胞、酚抽提,大小不同酶切片段,片段分离：,常用蔗糖梯度或电泳分离,分别与同样RE消化的载体连接,常用噬菌体载体或质粒载体,DNA连接酶连接。,导入细胞,进入宿主细胞内培养扩增。,筛选鉴定,用分子杂交、凝胶电泳,等方法鉴定。,88,89,（二）制备cDNA,（cDNA文库）,（1）分离细胞，提取总RNA（或mRNA）,（2）合成cDNA第一条链,反应体系只有mRNA、逆转录酶、4种dNTP、引物。,引物,是寡聚dT（1218dT片段）,cDNA文库：细胞全部mRNA逆转录成cDNA并被克隆的总和。,90,（3）合成cDNA第二条链,RNase H去掉模板mRNA，主要方法：,置换合成法,引物接头衔接法,（4）构建cDNA文库,cDNA两端加接头或衔接头,接头,是人工合成的双链寡核苷酸两端平头，含有限制酶切位点。,衔接头,是另一种人工合成的双链寡核苷酸一端平头，另一端为粘性末端。,cDNA与载体相连。,导入宿主细胞进行克隆，这些菌体内保存cDNA集合体便是cDNA文库。,91,（一）制备cDNA,（cDNA文库）,分离目的基因,的mRNA,逆转录生成cDNA单链,水解去除mRNA，,合成cDNA双链,水解回折处单链,得到平端双链cDNA,导入宿主细胞克隆,构建cDNA文库,92,（三）聚合酶链反应(PCR),在模板DNA、引物、dNTP、TaqDNA聚合酶等条件下，体外经94,变性、54,退火及72,延伸3个步骤的反复多次循环（25,30次,），扩增目的基因,RTPCR：从mRNA入手，先反转录得到cDNA，以此作为模板。,93,（四）人工合成基因,引用DNA测序仪测出某一基因的碱基序列，或根据某一蛋白质的氨基酸组成反推核苷酸序列，再用DNA合成仪通过化学合成原理合成目的基因。,一般先合成短片段DNA，然后再拼接成长片段。,94,六、重组DNA导入宿主细胞（,转,）,重组DNA导入宿主细胞的类型,转化,以,质粒,作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；,转染,以病毒,作载体构建的重组体导入受体细胞的过程；,转导,以,噬菌体,作载体构建的重组体导入受体细胞的过程,。,感受态细胞,用特殊方法处理后，受体细胞具有易于接受外源DNA的能力，这种细胞称,感受态细胞,。,感受态细胞有原核细胞和真核细胞两大类。,95,七、重组DNA的筛选与鉴定（,筛,）,（,筛选含重组体的阳性菌落，一般有下列几种方法,）,1）平板筛选,2）原位杂交技术,3）PCR筛选重组体,4）限制酶切图谱筛选,5）序列测定,6）免疫法,插入失活,蓝白筛选,96,1 平板筛选,是指利用载体的,遗传性标记,直接筛选的方法。,如，具有,抗药性标记,的载体，,（1）插入失活,当外源DNA序列插入质粒中某一抗药基因内，使,该基因失活，转化细胞就不能生长在含相应抗生素的,培养平板上。,97,抗生素平板筛选,（,插入失活,）,98,（2）,蓝,-,白,筛选,利用蓝色化合物的形成作为指示剂，筛选含有编码-半乳糖苷酶的基因。,载体：,编码-半乳糖,宿主：,编码-半乳糖,苷酶,N端,序列,苷酶,C端,序列,-互补,细菌表达：,-半乳糖苷酶活性蛋白,5-溴-4-氯-3-吲哚（,X-gal,）,形成,蓝色菌落,当在质粒中插入外源DNA-半乳糖苷酶的N端基因失活不能与宿主,-半乳糖苷酶的C端,进行-互补,产生,白色菌落,。,（IPTG 存在下）,99,蓝,白,筛选,示意图,100,101,2.核酸杂交筛选,102,3.PCR筛选重组体,抽提少量重组DNA,PCR扩增,电泳鉴定,4、序列测定,通过核酸测序，来确定外源基因准确性,103,5、免疫法,免疫法测定只能是所转移外源DNA必须表达后才能进行，而且必须具备有效的特异性抗体。,104,显色或显影,Protein,Protein,Blocking Agent,Blocking Agent,Blocking Agent,E,E,Primary Antibody,Secondary,AntibodyEnzyme(E),s,s,s,s,s,P,P,P,P,Substrate,105,6.限制性内切酶图谱鉴定,106,八、重组体在宿主细胞中的表达和调控,基因工程的最终目的是通过载体将外源基因导入合适的宿主细胞中高效表达，产生有重要价值的蛋白质产品。,107,需要考虑的几个问题：,启动子和终止子,核糖体结合位点,基因的拷贝数和基因的定位,合成外源基因的定位,宿主的翻译效率,外源蛋白在宿主中的稳定性,108,非融合蛋白与融合蛋白,非融合蛋白：指所表达的外源蛋白N端不含有任何其他的氨基酸,融合蛋白：蛋白质或多肽的N-末端由原核DNA编码,C-末端由克隆的真核DNA编码,这样表达的蛋白质由原核多肽和真核蛋白连接在一起,称,融合蛋白,109,第四节 重组技术在医学和制药工业中的应用,一、疾病基因的发现,1990年,美国科学家首先启动,人类基因组计划（HGP），,计划历时15年，至2005年完成；,2001年2月12日,由Since和Nature杂志同时向世界宣布，人类基因组3X10,9,bp的最新图谱，约含3,4万个基因；,整个人类基因组的全部核苷酸序列不久即将完成。,但要揭示人类4万个基因功能的任务将更为艰巨。,110,人类基因组图谱的初步完成，不仅为全部基因的定位建立了一个开放框架，而且为分离、鉴定人类疾病相关基因提供了参照模板。,如，已知,人类遗传性疾病约有3000种,，推测可能是由于,某些基因结构异常或基因位移等突变所致,。,111,产品名称,治疗功能与医药范围,1.人胰岛素,治疗糖尿病,2.人生长激素,治疗侏儒症，加速创口愈合,3.干扰素,治疗癌症、病毒感染,4.干扰素,治疗带状疱疹，眼结、角膜炎,5.干扰素,治疗癌症、病毒感染,6.人组织纤溶酶原激活因子(tPA),溶解血栓，治疗急性心肌梗塞,7.红细胞生成素(Epo),治疗肾病性贫血，增加红细胞及血色素水平,8.超氧化物歧化酶,清除超氧化物，治疗关节炎，缓解心肌坏死,9.凝血因子,治疗A型血友病,10.乙型肝炎疫苗,防治肝炎,11.神经生长因子,维持神经元细胞存活、生长和分化,12.脑啡肤,镇痛,13.降钙素,治疗骨质疏松症,二、生产蛋白质和多肽类活性物质,112,基因工程生产胰岛素的原理（示意图）,113,三、制备基因工程疫苗,基因工程疫苗可以帮助解决传统技术难以解决的,一些特殊的病原体疫苗。,如,，,（1）乙型肝炎病毒疫苗（HBV）、丙型肝炎病毒疫,苗（HCV）等；,（2）有诱发致癌或产生免疫病理作用的疫苗，如人,T细胞免疫缺陷病毒（HITV-1）等；,（3）常规效果较差的疫苗，如霍乱和痢疾疫苗等,（4）制备一些多价疫苗等。,114,四、改良物种特性,115,动物药厂,通过转基因动物生产感兴趣的基因,把YFG放在乳球蛋白的启动子下,注入羊卵细胞植入借腹怀孕的母羊体内,YFG在乳腺中表达,乳汁中提纯YFG蛋白。,116,五、其他应用（略）,117,第五节 蛋白质工程,118,蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求。,前提,：,原理,：,目的：,了解蛋白质的结构和功能,改造基因（基因修饰或基因合成）,定向改造或制造蛋白质,一、蛋白质工程的概念,119,比较,蛋白质工程产生新的蛋白质,自然界中产生新的蛋白质,都是产生了变异，但蛋白质工程速度比自然进化快,120,二、蛋白质工程的流程,121,研究方法,1、分离纯化目的蛋白,2、目的蛋白进行氨基酸测序，结构测定，推测结构与功能的关系,3、获得目的蛋白的编码基因,4、设计改造方案，改造基因序列,5、改造后的基因进行表达,6、分离纯化表达产物，进行功能测定,122,三、蛋白质工程的应用,1、蛋白质工程酶酶特性的改造,（1）改变酶的催化活性,（2）改变酶的底物专一性,（3）提高酶的稳定性,（4）酶的反应特性改变,（5）产生新酶,2、合理药物设计蛋白质工程用于新药研制,123,比较：基因工程和蛋白质工程,基因工程,蛋白质工程,相同点,都要改造基因，都属于分子水平,产生新的,基因型，无新基因,基因（型）,产生的蛋白质,原有的,新的,联系,蛋白质工程以基因工程为基础，,是基因工程的应用和延伸,124,第六节 基因组学和蛋白质组学,1,基因组学,基因组学概述,基因组图谱的构建,125,一、基因组概述,1、基因组：生物具有的携带遗传信息的遗传物质的总和,物种遗传信息的“总词典”,控制发育的“总程序”,生物进化历史的“总档案”,126,2、基因组学（genomics),1986,年提出，至今,20,年，已经发展成为遗传学中最重要的分支学科。,对物种的所有基因进行定位、作图、测序和功能分析,127,钓鱼,竭泽而渔,128,CREDIT:JOE SUTLIFF,Science,Vol 291:1221.,Fishing in a More Effective Way!,129,3.基因组学的研究内容,结构基因组学,功能基因组学,比较基因组学,130,3.1 结构基因组学（structural genomics）,基因定位,基因组作图,测定核苷酸序列,131,3.2 功能基因组学（functional genomics）,又称后基因组学（postgenomics),基因的识别、鉴定、克隆,基因结构、功能及其相互关系,基因表达调控的研究,132,3.3 比较基因组学,（Comparative genomics）,对不同基因组进行比较,揭示生命的起源、进化等重大生物学问题,筛选物种特异基因,133,二、基因组图谱的构建,遗传图,物理图,序列图,转录图,134,2,蛋白质组学,背景,基因数量有限性和基因结构的相对稳定性,vs,生命现象的复杂性和多变性,从,genomic,到,proteome,135,对蛋白质的数量、结构、性质、相互关系和生物学功能进行全面深入的研究已成为生命科学研究的迫切需要和重要任务。,136,蛋白质组学的概念及其发展史,蛋白质组学研究内容,蛋白质组学在疾病研究中的应用,主要内容,137,蛋白质组是澳大利亚学者Williams和Wilkins于1994年首先提出，源于蛋白质（protein）与基因组（genome）两个词的杂合,意指proteins expressed by a genome，即“一个细胞或一个组织基因组所表达的全部蛋白质”。,一、蛋白质组学的概念,138,对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。,同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同。,在空间和时间上动态变化着的整体。,蛋白质组是：,139,蛋白质组学(proteomics),定量检测蛋白质水平上的基因表达，分析基因组的蛋白质类型、空间结构变异以及相互作用的机制，从而揭示生物学行为和基因表达调控机制的学科。,140,二、主要研究内容,了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类；,明确各种蛋白质分子是如何形成类似于电路的网络的；,描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其结构上的关键部位，如与药物结合并且决定其活性的部位。,141,三、主要技术,双向电泳技术,质谱技术,142,143,144,145,