《药物分析》chapter4.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,*,基本要求,一、掌握定量分析方法验证的效能指标,二、熟悉定量分析样品的前处理方法,三、了解定量分析样品的前处理方法的,进展及在药物分析中的应用,第一节 定量分析样品的前处理方法,一、概述,1.为什么要对定量分析的样品进行前处理？,卤素有机药物 R-X（F，Cl,Br,I）,金属有机药物 R-O-M（有机酸,含金属有 或酚的金属盐结合不牢固）,机药物,有机金属药物 R-M（结合牢固）,2.常用的处理方法,不经有机破坏的分析方法,经有机破坏的分析方法,二、不经有机破坏的分析方法,（一）直接测定法,例如：富马酸亚铁,溶于热稀矿酸，采用铈量法，邻二氮菲作指示剂,3.利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量,（1）含锑药物 例如：葡萄糖酸锑的含量测定,（2）含铁药物,Sb,5+,+2KI Sb,3+,+2K,+,+I,2,I,2,+2Na,2,S,2,O,3,2NaI +Na,2,S,4,O,6,2Fe,3+,+2KI 2Fe,2+,+2K,+,+I,2,I,2,+2Na,2,S,2,O,3,2NaI +Na,2,S,4,O,6,三、经有机破坏的分析方法,药物分析中常用的有机破坏的方法有,湿法破坏,干法破坏,HNO,3,-HClO,4,法,(一)湿法破坏,HNO,3,-H,2,SO,4,法,H,2,SO,4,-硫酸盐法,HNO,3,-H,2,SO,4,-HClO,4,法；,H,2,SO,4,-H,2,O,2,；H,2,SO,4,-KMnO,4,凯氏定氮法,包括：常量法、半微量法、,原理：,浓硫酸 有机结构-,CO,2,+H,2,O,含氮药物-,共热 有机结合的氮-氨气-硫酸胺盐,NaOH,-氨气-硼酸溶液吸收-酸碱滴定,(二)干法破坏,包括：,高温炽灼法,、,氧瓶燃烧法,(1),高温炽灼法,主要适用含卤素药物的的鉴别亦可用于含,磷药物的定量测定和药物中砷盐的检查 可以,根据需要加入碳酸钠、硝酸镁、氢氧化钙、氧,化锌等辅助灰化,(2),氧燃瓶燃烧法,(oxygen flask combustion method),1.,仪器装置,500ml,1000ml,2000ml磨口、硬质玻璃锥形瓶,2.,称样,固体样；液体样要求详见P85,3.,吸收液的选择,依据待测元素种类与分析方法,多数是H2O或H2O-NaOH；少数为H2O-NaOH-H2O2.,例：含F药物 茜素氟蓝比色法 H,2,O,含Cl药物 银量法 H,2,O-NaOH,含Br药物 H,2,O-NaOH-SO,2,(aq),含I药物 H,2,O-NaOH-SO,2,(aq),含S药物 H,2,O-H,2,O,2,含P药物 H,2,O,含Se药物 H,2,O-HNO,3,4.,燃烧分解操作法,P86,应用示例：碘苯酯的测定,第二节 定量分析方法特点,药品的含量测定评价药品质量优劣的重要手段,包括：,容量分析法,光谱分析法,色谱分析法,一、容量分析法,由已知浓度的滴定液（标准液）滴加至被测药物的溶液中，直至滴定液与被测药物反应完全（指示剂），由化学计量关系计算被测药物的含量。,（一）容量分析法的特点,操作简单、快速；比较准确（RSD0.2%）；仪器普通易得。,选择性差，适用于含量较高的试样，主要测化学原料药,（二）容量分析法的计算问题,1、,滴定度（,T,）的概念,：,每1ml规定浓度的滴定液相当于被测物质,的质量(mg),2.,滴定度的计算,：,aA,+,bB cC,+,dD,药物,滴定液,WA=,m,B,V,B,(a/b)M,A,T(mg/ml)=m(a/b)M,3.,含量的计算,（1）直接滴定法,D%=(,V,F,T)/W,100%,F,=实际标定摩尔浓度/规定摩尔浓度,F-,浓度校正因数,（2）间接滴定法（生成物滴定法；剩余量滴定法）,a.生成物滴定法,被测药物+A,P 用滴定液滴定生成P,D%=（,V,F,T,）/,W,100%,b.剩余量滴定法,被测药物+A(过量）,P 用滴定液滴定剩余A,空白校正：,D%=（,V,O,V,B),F,T,/,W,100%,二、光谱分析法,（一）紫外-可见分光光度法,（200nm760nm),灵敏度高，可达10-4g/ml,10-7g/ml,1.,特点,准确度高，SRD（%）为2%,5%,仪器价格低廉，操作简单，易普及，应用范,围广。,2.,朗伯-比耳定律,A=ECL E,1%1,cm,=,10/M,3.,仪器校正和检定,波长校正用汞灯中较强谱线（P91)或用仪器中,氘灯的486.02nm与656.10nm进行校正。,吸收度的检定,：用K2CrO7(60mg)+0.005mol/L,H2SO4液至1000ml,波长(nm)235(最小)257(最大)313(最小)350(最大),E,1%1,cm 124.5 144.0 48.62 106.6,杂散光检查：试剂 浓度(g/ml)测定波长 透光率(%),NaI 1.00 220nm 0.8,NaNO2 5.00 340nm 0.8,4.,对溶剂的要求,220,240nm 241250nm 251300nm 300nm以上,溶剂+,0.41 0.20 0.10 0.05,吸收池A,5.,测定方法,吸收峰波长应在该品种项下规定的波长,2nm,内，并以吸光度最大的波长作为测定波长；,要求供试品溶液的A应在0.30.7之间；,仪器狭缝波带宽度应小于供试品吸收带半宽度的1/10；,扣除空白读数。,1.对照品比较法：,C,x=(,A,x/,A,R),C,R,原料药,：含量%=（,C,x,D）/W,100%,固体制剂,：,标示量%=（,C,x,D,w）/,(,W,B,)100%,液体制剂,：,标示量%=（,C,x,D,v）/,(,V,B,)100%,常用方法,2.吸收系数法：,Cx=Ax/(,E,1%1,cm,100),3.计算分光光度法：,VA的三点校正法,4.比色法：,在紫外-可见光区没有强吸收，,加入适当的显色剂显色后进行测定，,需要绘制标准曲线,（二）荧光分光光度法,灵敏度高，可达10-10g/ml,10-12g/ml,在低浓度进行测定，防止F与C不成正比,及自熄灭作用,1、特点,用基准物溶液校正仪器灵敏度，防止样品,液荧光衰减,灵敏度高，但干扰因素多。,制备荧光衍生物，可提高其灵敏度和选,择性。,用样品量少，操作简单，方法快速，应,用范围较广。,2、荧光分析仪,有二个单色光器激发单色光器与发射单色光,器；且激发光源、样品池和检测器成直角。,3、含量测定,常用的方法对照品比较法:,C,x,=(,R,x,-,R,x,b,)/(,R,r,-,R,rb,),C,r,(,R,x-,R,xb)/(,R,r-,R,rb)在0.50-2.0之间,Ch.P收载地高辛片、利血平片、洋地黄毒苷片。,三、色谱分析法,按分离原理分为：吸附；分配；,方法分类,离子交换；排阻色谱,按分离方法分为：PC；TLC；,柱色谱；GC；HPLC,（一）HPLC法,1.,对HPLC仪器一般要求,色谱柱、流动相按品种项下要求。,色谱柱的理论板数：,n,=5.54(,t,R,/,W,h/2,),2,2.,系统性试验,分离度：,R,=2（,t,R1,t,R2,)/(,W,1,+,W,2,);要大于1.5,拖尾因子：,T,=,W,0.05h,/2,d,1,应在0.9,1.05,内标法加校正因子测定供试品,中主成分含量,3、,测定方法,外标法测定供试品中主成分含量,（二）GC法,1.,对GC仪器一般要求,载气为氮气；色谱柱为填充或毛细管柱 色谱柱的理论板数：,n,=5.54(,t,R,/,W,h/2,),2,2.,系统性试验,分离度：,R,=2（,t,R1,t,R2,)/(,W,1,+,W,2,);要大于1.5,拖尾因子：,T,=,W,0.05h,/2,d,1,应在0.9,1.05,内标法加校正因子测定供试品,3.,测定方法,中主成分含量,外标法测定供试品中主成分含量,标准加入法,第三节 药品质量标准分析方法验证,一、准确度,是指用该方法测定结果与真实值接近的程度，用,回收率表示,（一）含量测定方法的准确度,1.,原料药,可用已知纯度对照品或样品进行测,定；或与已建准确 度的另一方法测定的结果,进行比较。,2.,制剂,要考察辅料对回收率的影响。采用在空,白辅料中加入原料对照品的方法作回收率试,验，然后计算RSD。,（二）杂质定量测定方法,色谱法 标准加入法,（三）数据要求,回收率%=（测定平均值-空白值）/加入量,100%,要求制备高、中、低三浓度的样品，各测定3,次。应报告已知加入量的回收率，或测定结果,平均值与真实值之差及其可信限。,二、精密度,是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次测定结果之间的,接近程度,（一）精密度表示方法,1.,偏差,(deviation,d,),d,=测得值-平均值=,X,i,-,X,2.,标准偏差,（standard deviation,SD,或,S,）,S,=(,X,i,X,),2,/(n-1),1/2,3.,相对标准差,(relative standard deviation,RSD,)也称变异系数(coefficient of variation,CV,),RSD=标准偏差/平均值100%=,S/X,100%,（二）验证内容,1.,重复性,在相同条件下,由一个分析人员测定所得结果的精密度.,2.,中间精密度,在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果的精密度。,3.,重现性,在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度。,（三）数据要求,应报告标准偏差（S或SD）、相对标准偏差（RSD）和可信限。,三、专属性,是指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检查、含量测定方法，均应考察其专属性。,（一）鉴别反应,应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分的样品均应呈现负反应。,（二）含量测定和杂质测定,色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性。图中应注明各组分的位置，色谱法中分离度应符合要求。在能获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对结果的干扰。在杂质和降解物不能获得的情况下，可用以验证方法和药典方法进行对照；也可用对试样加速破坏的方法，比较两种方法。,四、检测限（limit of detection,LOD,）,是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或,量，是限度检验指标。它无需测定，只要指出,高于或低于该规定的浓度或量即可。,（一）常用的方法,1.,非仪器分析目视法,用已知浓度被测物，,目试出能被可靠地检测出的最低浓度或量。,2.,信噪比法,可用已知的低浓度样品测出的信,号与空白样品测出的信号进行比较，计算出能,被可靠检测出的最低浓度或量。,（二）数据要求,应附测试图，说明测试过程和检测限结果。,五、定量限（limit of quantitation,LOQ,),是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。杂质和降解产物进行定量测定时，要求,LOQ,.常用信噪比法确定定量限，一般以S/N=10时相应的浓度进行 测定。,六、线性,是指在设定的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。,UV法,：首先制备一个标准系列，,浓度点n=5;A=0.30.7,建立回归方程C=aA+b;r0.9999。,HPLC法,：制备一个标准系列，浓度点n=57;,以C对h或A或与内标物的峰面积之比，,建立回归方程r0.9999。,七、范围,是指达到一定精密度、准确度和线性、测试方法适用的高低限度或量的区间。,原料药和制剂含量测定,：范围应为测试浓度的80%-,120%。,制剂含量均匀度检查,：范围应为测试浓度的70%-,130%。,溶出度或释放度中的溶出量测定,：范围应为限度的20%。,八、耐用性,是指在测定条件下有效的变动时，测定结果不受影响的,承受程度,。典型的变动因素有：被溶液的稳定性、样品提取次数、时间等。,HPLC法变动因素,有：流动相组成与pH，色谱柱，柱温，流速等。,GC法变动因素,有：色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检测器温度等。,分析方法效能指标的具体应用：,1.,非定量分析方法,：只要求专属性、检测限、耐用性。,2.,定量分析方法,：除了检测限、定量限外，其余六项均要求。,3.,微量定量分析方法,：除了检测限供选择外，其余六项均要求。,第四节,生物样品分析,方法,的基本要求,一、,常用样品的种类、采集和贮藏,血样、唾液、尿液,二、,生物样品分析前处理技术,去除蛋白质等,三、,定量分析方法验证,课堂练习与思考,1、验证分析方法应视方法使用对象拟定验证的内容。对于非定量分析方法如鉴别试验和杂质的限度检查法，一般需要验证以下哪些项目。,A:专属性 B:检测限,C:耐用性 D:精密度,请大家思考：,1如何用高效液相色谱进行定量分析？,2为什么需要对分析方法进行验证？,本章结束！,