第七章微生物的遗传变异和育种-微生物学.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,遗传,（,heredity,inheritance,）,：,亲代与子代相似,变异,（,variation,）,：,亲代与子代、子代间不同个体不完全相同,遗传,（,inheritance,）,和,变异,（,variation,）,是生命的最本质特性之一,（,1,）,遗传型,（,genotype,）,生物的全部遗传因子及基因,又称,基因型,，指某一生物个体所含有的全部遗传因子即,基因组,（,genome,）,所携带的遗传信息。遗传型是一种内在可能性或潜力，其实质是遗传物质上所负载的,特定遗传信息,。,（,2,）,表型,（,phenotype,）,具有一定遗传型的个体，在特定环境条件下通过生长发育所表现出来的形态等生物学特征的总和。,又称,表现型,，,指某一生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和，是其遗传型在合适环境下通过代谢和发育而得到的具体表现。,表型饰变：,指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。,表型的差异只与环境有关,特点：,暂时性、不可遗传性、表现为全部个体的行为,橘生淮南则为橘，生于淮北则为枳。,（,4,）,饰变,（,modification,）,微生物是遗传学研究中的明星：,微生物细胞结构简单，营养体一般为单倍体，方便建立纯系。,很多常见微生物都易于人工培养，快速、大量生长繁殖。,对环境因素的作用敏感，易于获得各类突变株，操作性强。,第一节 遗传变异的物质基础,一、,DNA,作为遗传物质,二、,RNA,作为遗传物质,三、朊病毒的发现与思考,一、,3,个经典实验,（一）,经典转化试验,最早进行,转化,（,transformation,）,实验的是,F.Griffith,（,1928,年）,，他以,Streptococcus pneumoniae,（肺炎链球菌，旧称,“,肺炎双球菌,”,）作为研究对象。,（,1,）,动物实验,著名的肺炎球菌转化试验,S,型，致病菌，,具荚膜，菌落表面光滑（,smoth,）,R,型，非致病菌，,无荚膜，菌落表面粗糙（,rough,）,S,型,R,型,加热灭菌,热死,S,菌活,R,菌,（,2,）,细菌培养试验,（,3,）,S,型菌的无细胞抽提液试验,Avery,在四十年代以更精密的实验设计重复了以上实验,（,1,）从活的,S,菌中抽提各种细胞成分（,DNA,，蛋白质，荚膜多糖等）,（,2,）对各组分进行转化试验,只有,DNA,被酶降解破坏的抽提物无转化活性,DNA,是转化所必需的转化因子,（二）,噬菌体感染实验,1952,年，,A.D.Hershey,和,M.Chase,发表了证明,DNA,是噬菌体的遗传物质基础的著名实验,噬菌体感染实验,35,S,蛋白质外壳的噬菌体,32,P,DNA,核心的噬菌体,在,DNA,中存在着包括合成蛋白质外壳在内的整套遗传信息。,（三）,植物病毒的重建实验,为了证明核酸是遗传物质，,H.Fraenkel-Conrat,（,1956,）用含,RNA,的,烟草花叶病毒,（,TMV,）,进行了著名的,植物病毒重建实验,。,烟草花叶病毒的核酸,抗血清处理，证明杂种病毒的蛋白质外壳来自,病毒,1,，而非,病毒,2,杂种病毒的后代的蛋白质外壳表现为,病毒,2,，而非,病毒,1,遗传物质是核酸（,RNA,）而非蛋白质,霍氏车前病毒,的蛋白质外壳,HRV,HMV,亚病毒的一种：具有传染性的蛋白质致病因子，迄今为止尚为发现该蛋白内含有核酸。,其致病作用是由于动物体内正常的蛋白质,PrP,c,改变折叠状态为,PrP,sc,所致，而这二种蛋白质的一级结构并没有改变。,二、朊病的发现与思考,思考,1,）蛋白质是否可以作为遗传物质？,prion,是生命的一个特例？还是仅仅为表达调控的一种形式？,2,）蛋白质折叠与功能的关系，是否存在折叠密码？,DNA,RNA,肽链蛋白质,三、遗传物质在微生物细胞内存在的部位和方式,（一）,7,个水平,1.,细胞水平,DNA,都集中在细胞核或核质体中,2.,细胞核水平,3.,染色体水平,（,1,）染色体数,（,2,）染色体倍数,单倍体,（,heoloid,）：,一个细胞中只有一套染色体。,双倍体,（,diploid,）：,一个细胞中含有两套功能相同的染色体。,指同一细胞中相同染色体的套数,4.,核酸水平,（,1,）核酸种类,（,2,）核酸结构,（,3,）,DNA,长度,DNA,长度即基因组的大小，一般可用,bp,（碱基对，,base pair,）、,kb,（千碱基对，,kilo bp,）和,Mb,（百万或兆碱基对，,mega bp,）作单位。,5.,基因水平,基因,是生物体内一切具有自主复制能力的,最小遗传功能单位,，,其物质基础是一条以直线排列、,具有特定核苷酸序列的,核酸片段,。,6.,密码子水平,遗传密码,（,genetic code,）,是指,DNA,链上决定各具体氨基酸的特定核苷酸排列顺序。,遗传密码的信息单位是,密码子,（,codon,）,，每一密码子由,3,个核苷酸序列即一个三联体（,triplet,）所组成。一般都用,mRNA,上,3,个连续核苷序列表示。,7.,核苷酸水平,腺苷酸（,AMP,）,胸苷酸（,TMP,）,鸟苷酸（,GMP,）,胞苷酸（,CMP,）,5,羟甲基胞嘧啶,每个碱基对（,bp,）的平均相对分子质量约为,650,；,110,6,的,dsDNA,约为,1.5kb,（千碱基对）或,0.5,m,m,（长度）；,3nmol,碱基的重量约等于,1,m,g,。,（二）,原核生物的质粒,1.,定义和特点,质粒：,一种独立于染色体外，能进行自主复制的细胞质遗传因子，主要存在于各种微生物细胞中。,cccDNA,ocDNA,lDNA,另一类质粒的复制与核染色体的复制不同步，,在这类细胞中，一般含,10,15,个或更多质粒。,严紧型复制控制,（,stringent replication control,）,松弛型复制控制,（,relaxed replication control,）,质粒的复制与核染色体的复制同步，,在这类细胞中，一般只含,1,2,个质粒；,质粒是一种独立存在于细胞内的,复制子,（,replicon,）,。,通常以共价闭合环状（,covalently closed circle,，简称,CCC,）的超螺旋双链,DNA,分子存在于细胞中；,也发现有线型双链,DNA,质粒和,RNA,质粒；,质粒分子的大小范围从,1kb,左右到,1000kb,；,（细菌质粒多在,10kb,以内）,2.,质粒的分子结构,提取所有胞内,DNA,后电镜观察；,超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察；,对于实验室常用菌，可用质粒所带的某些特点，,如抗药性初步判断。,特定的质粒提取方法和后处理使染色体和,RNA,均被除掉。,3.,质粒的检测,质粒的主要功能,在某些特殊条件下，质粒有时能赋予宿主细胞以特殊的机能，,从而使宿主得到生长优势。,质粒所含的基因对宿主细胞一般是非必需的；,质粒所编码,的功能和赋,予宿主的表,型效应,致育因子,（,Fertility factor,，,F,因子）,抗性因子,（,Resistance factor,，,R,因子）,产细菌素的质粒,（,Bacteriocin production plasmid,）,毒性质粒,（,virulence plasmid,）,代谢质粒,（,Metabolic plasmid,）,隐秘质粒,（,cryptic plasmid,）,4.,质粒的主要类型,（,1,）,F,质粒（,F plasmid,）,又称,F,因子、致育因子（,fertility factor,）或性因子（,sex factor,），其大小约,100kb,，为,cccDNA,，这是最早发现的一种与大肠杆菌的有性生殖现象（接合作用）有关的质粒。,携带,F,质粒的菌株称为,F,+,菌株（相当于雄性），,无,F,质粒的菌株称为,F,-,菌株（相当于雌性）。,（,2,）,R,质粒（,R plasmid,）,包括抗药性和抗重金属二大类。,又称,R,因子,（,R factor,）,、,抗性因子,（,resisitrance plasmid,）,。,含调节,DNA,复制和拷贝数的基因以及转移基因，相对分子量约,11,10,7,，具有转移功能；,抗性转移因子,（,resistance transfer factor,，,RTF,）,抗性决定因子,（,r-determinant,）,大小不很固定，相对分子量从几百万至,11,10,8,以上，无转移功能，含各种抗性基因，如抗青霉素、氨苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素和磺胺等基因。,R,质粒一般由两个相连的,DNA,片段组成,由,RTF,和,r,决定子结合而形成,R,质粒的过程：,抗性质粒在细菌间的传递是细菌产生抗药性的重要原因之一。,R100,质粒（,89kb,）可使宿主对下列药物及重金属具有抗性：,汞（,mercuric ion,，,mer,）,四环素（,tetracycline,，,tet,）,链霉素（,Streptomycin,Str,）、,磺胺（,Sulfonamide,Su,）、,氯霉素（,Chlorampenicol,Cm,）,夫西地酸（,fusidic acid,，,fus,）,并且负责这些抗性的基因是成簇地存在于抗性质粒上。,R,质粒的种类很多，,例如，,R1,（,94kb,）和,R100,（,89.3kb,）等。,（,3,）,Col,质粒（,colicin plasmid,，,col plasmid,）,又称,大肠杆菌素质粒,或,产大肠杆菌素因子,（,colicinogenic factor,，,col factor,）,。,细菌素,（,bacteriocin,）,是质粒编码的蛋白质，一般由细菌产生，可抑制或杀死其他近缘细菌或同种不同菌株的代谢产物，但不具有很广的杀菌谱。,细菌素结构基因、,涉及细菌素运输及发挥作用（,processing,）的蛋白质的基因、,赋予宿主对该细菌素具有“免疫力”的相关产物的基因,一般都位于质粒或转座子上，,细菌素可以杀死同种但不携带该质粒的菌株。,细菌素一般根据产生菌的种类进行命名：,大肠杆菌（,E.coli,）产生的细菌素为,colicins,（大肠杆菌素），,而质粒被称为,Col,质粒。,Col E1,质粒：,相对分子量小（,9kb,，约,5,10,6,），无接合作用，是松弛性控制、多拷贝的；,Colb,质粒：,相对分子量大（,94kb,，约,8,10,7,），具有通过接合而转移的功能，属严紧型控制，只有,1,2,个拷贝。,（,4,）,Ti,质粒（,tumor inducing plasmid,）,即,诱癌质粒,或,冠瘿质粒,（,crown gall plasmid,）,。,Ti,质粒是一种,200kb,的环状质粒，包括,毒性区（,vir,）,、,接合转移（,con,）,、,复制起始区（,ori,）,和,T-DNA,区,4,部分。,T-DNA,区可携带任何外源基因整合到植物基因组中，,Ti,质粒是植物基因工程中使用最广、效果最佳的克隆载体。,Agrobacterium tumefaciens,（根癌土壤杆菌或根癌农杆菌）释放出的,Ti,质粒上的,T-DNA,片断与植物细胞的核基因组整合，合成冠瘿碱类（,opines,）,破坏控制细胞分裂的激素调节系统，使之变成癌细胞。,（,5,）,Ri,质粒（,root inducing plasmid,）,250kb,的,Ri,质粒中的一段,T-DNA,整合到,宿主根部细胞,的核基因组中，可发生转化。,Agrobacterium rhizogenes,（发根土壤杆菌或发根农杆菌）可侵染双子叶植物的根部，并诱发大量称为毛状根的不定根。,Ri,质粒是外源基因的良好载体！,（,6,）,mega,质粒（,megaplasmid,）,即,巨大质粒,，其相对分子量,比一般质粒大几十倍至几百倍，存在于,Rhizobium,（根瘤菌属）中，,其上有一系列与共生固氮相关的基因。,（,7,）降解质粒,这类质粒是由降解一系列复杂有机物的酶编码，所以在污水处理、环境保护等方面发挥作用。,只在假单胞菌属（,Pseudomonas,）中发现降解质粒。,降解质粒以其所分解的底物命名，,例如，,CAM,（樟脑）质粒，,OCT,（辛烷）质粒，,XYL,（二甲苯）质粒，,SAL,（水杨酸）质粒，,MDL,（扁桃酸）质粒，,NAP,（萘）质粒，,TOL,（甲苯）质粒等,“超级菌”,通过遗传工程手段构建具有数种降解质粒的菌株，具有广谱降解能力的工程菌。,还没有完呢，稍等片刻！,本章小结,1.,真核微生物包括,植物界的,显微藻类,动物界的,原生动物,“,菌物界,”,的,真菌微生物,酵母菌,霉菌,蕈菌,真菌,2.,真核微生物的共同特征,细胞较大、,结构复杂，,有细胞膜、细胞质和细胞核（真核），,具有执行特殊生理功能的细胞器。,3.,真核微生物的特殊构造,细胞壁,鞭毛和纤毛,复习思考题,试设计一张表格，比较细菌、放线菌、酵母菌和霉菌四大类微生物的细胞形态、组成、结构和菌落特征等特征，并讨论它们原生质体的制备方法。,2.,什么叫锁状联合？其生理意义如何？是图示其过程。,下节课再见了,第二节 基因突变和诱变育种,基因突变,诱变育种,一、基因突变,（,genemutation,）,一个基因内部遗传结构或,DNA,序列的任何改变,简称,突变,，是变异的一种，泛指细胞内（或病毒粒内）遗传物质的,分子结构,或,数量,突然发生的可遗传的变化，可自发或诱导产生。,突变几率一般很低,（,10,-6,10,-9,）,从自然界分离到的菌株，简称,野生型,。,野生型经突变后形成的带有新性状的菌株，又称,突变体,或,突变型,。,突变株,（,mutant,）,野生型菌株,（,wild type strain,）,（一）突变类型,凡能用,选择性培养基,（或其他选择性培养条件）快速选择出来的突变株。,选择性突变株,（,selective mutant,）,非选择性突变株,（,non-selective mutant,）,反之。,表型,基因型,这里主要介绍几种常用的由于基因突变而造成微生物表型变化,的突变型及其分离,link1,突变株的表型,非选择性突变株,选择性突变株,抗性突变型（株）,营养缺陷型（株）,条件致死突变型（株）,形态突变型（株）,抗原突变型（株）,产量突变型（株）,突变率,每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率,例如，突变率为,10,-8,的，,指该细胞在,1,亿次细胞分裂中，会发生,1,次突变。,某一单位群体在每一世代（即分裂,1,次）中产生,突变株,（,mutant,，即,突变型,）,的数目来表示,例如，一个含,10,8,个细胞的群体，当其分裂为,210,8,个细胞时，即可平均发生一次突变的突变率也是,10,-8,。,（二）突变率,（,mutation rate,）,突变一般是独立发生的。,某一基因发生突变不会影响其他基因的突变率。,同一细胞中同时发生两个基因突变的几率是极低的。,（三）基因突变的特点,基因突变的,7,个共同点,（,1,）,自发性,各种性状的突变，,可在无人为的诱变因素处理下自发地产生。,（,2,）,非对应性,突变的性状与引起突变的原因间,无直接的对应关系。,这是突变的一个重要特点，也是容易引起争论的问题,（,3,）,稀有性,自发突变虽可随时发生，,但其突变率却是极低和稳定的，一般在,10,-6,10,-9,间。,某基因的突变率不受它种基因突变率的影响。,（,5,）可,诱变性,自发突变的频率可因,诱变剂,（,mutagen,）,的影响而大为提高（,10,10,5,倍）。,（,4,）,独立性,基因突变后的新遗传性状是稳定的、可遗传的。,野生型菌株某一性状可发生,正向突变,（,forward mutation,）,，也可发生相反的,回复突变,（,reverse mutation,或,back mutation,，也称,回变,）,。,（,7,）,可逆性,（,6,）,稳定性,（四）基因突变自发性和不对应性的实验证明,如何证明基因突变的非对应性？,证明突变的性状与引起突变的原因间无直接对应关系！,三个经典实验,变量实验、涂布实验、影印实验,1.,变量试验,（,fluctuation test,）,又称,波动试验,或,彷徨试验,。,1943,年，,S.E.Luria,和,M.Delbrck,根据统计学的原理，设计实验。,Salvador Luria,Max Delbruck,The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1969,甲管,乙管,2.,涂布试验,（,Newcombe experiment,）,1949,年，,H.B.Newcombe,在,NATURE,上发表了一篇与变量试验属同一观点的但实验方法更为简单的涂布试验结果。,3.,平板影印培养试验,（,replica plating,）,1952,年，,J.Lederberg,夫妇发表了一篇著名的,平板影印培养法和细菌突变株的间接选择,论文，它更好地证明了微生物的抗药性是在未接触药物前自发地产生的，这一突变与相应的药物环境毫不相干。,影印的作用是保证这,3,个平板上所长出的菌落的,亲缘和相对位置,保持严格的对应性。,Joshua Lederberg,J.Lederberg is awarded the Noble Prize in,Medicine and Physiology in 1958,（五）基因突变极其机制,仅影响一对碱基,影响一段染色体,诱发突变,简称,诱变,，是指通过人为的方法，利用物理、化学或生物因素显著提高基因自发突变频率的手段。,1.,诱发突变,（,induced mutation,）,凡具有诱变效应的任何因素，都称,诱变剂,（,mutagen,）,。,(1),碱基的置换,（,substitution,）,碱基的置换只涉及一对碱基被另一对碱基所置换，属于典型的,点突变,（,pointmutation,）,。,染色体的,微小损伤,（,microlesion,）,碱基的置换,转换,（,transition,）,颠换,（,transversion,）,一个嘌呤,另一个嘌呤,一个嘧啶,另一个嘧啶,一个嘌呤,另一个嘌呤,一个嘧啶,另一个嘧啶,置换的机制,直接引起置换的诱变剂,一类可,直接,与核酸的碱基发生化学反应的化学诱变剂，在体内（,in vivo,）或离体（,in vitro,）条件下均有作用。,各种烷化剂,（,alkylating agent,）,等,硫酸二乙酯（,DES,），,甲基磺酸乙酯（,EMS,），,N-,甲基,-N,-,硝基,-N-,亚硝基胍，,N-,甲基,-N-,亚硝基脲，,乙烯亚胺，环氧乙酸，氮芥等。,亚硝酸,羟胺,它们可与一个或几个碱基发生生化反应，,引起,DNA,复制时发生转换，,能引起颠换的诱变剂很少。,间接引起置换的诱变剂,引起这类变异的诱变剂都是一些,碱基类似物,（,base analog,）,。,5-,溴尿嘧啶（,5-BU,）、,5-,氨基尿嘧啶（,5-AU,）、,8-,氮鸟嘌呤（,8-NG,）、,2-,氨基嘌呤（,2-AP,）,6-,氯嘌呤（,6-CP,）等。,它们的作用是通过活细胞的代谢活动掺入到,DNA,分子中,后而引起的，故是间接的。,(2),移码突变,（,frame-shift mutation,，,phase-shift mutation,）,指诱变剂使,DNA,序列中的一个或少数几个核苷酸发生,增添,（,插入,）或,缺失,，从而使其后面的全部遗传密码发生,阅读框,发生改变，并进一步引起转录和转译错误的一类突变。,由移码突变所产生的突变株，称为,移码突变株,（,frame-shift mutant,）,。,DNA,分子的,微小损伤,点突变,能引起移码突变的有效诱变剂,吖啶类染料,原黄素,吖啶黄,吖啶橙,-,氨基吖啶,ICR,类的化合物,由吖啶类化合物诱发的,移码突变,及其,回复突变,图示：,（双线部分代表正常密码子，单线部分表示不正常）,正常,DNA,链上的三联密码子：,第三个密码子中增添一个碱基后的三联密码子：,在第二个密码子上缺失一个碱基,A,后引起的变化：,增添一个碱基和缺失一个碱基后，其后的密码子又恢复正常：,如缺失三个碱基，也只引起一段密码子不正常：,增添三个碱基后，只引起一段密码子不正常：,吖啶类化合物引起移码突变的机制：,在,DNA,复制过程中使链上,增添,或,缺失,一个碱基，引起移码突变。,吖啶类化合物,嘌呤嘧啶对,平面型三环分子,结 构 相 似,嵌入,两个相邻的,DNA,碱基对之间,造成,双螺旋的部分解开,(3),染色体畸变,（,chromosomal aberration,）,电离辐射,（,X,射线等,）,烷化剂,亚硝酸等,某些强烈理化因子,引起,点突变,DNA,的大损伤,（,macrolesion,）,DNA,的大损伤,（,macrolesion,）,染色体畸变,缺失,（,deletion,）,重复,（,duplication,）,插入,（,insertion,）,易位,（,translocation,）,倒位,（,inversion,）,染色体结构上,染色体数目的变化,DNA,序列通过,非同源重组,的方式，,从染色体某一部位转移到,同一染色体上另一部位,或,其他染色体上某一部位,的现象，,称为,转座,（,transposition,）,。,凡具有转座作用的一段,DNA,序列，称,转座因子,（,transposible element,，,TE,），又称,跳跃基因,（,jumping gene,）、,可移动基因,（,moveable gene,）、,可移动遗传因子,（,mobile genetic element,）。,转座因子,插入序列,（,insertion sequence,，,IS,）,转座子,（,transposon,，,Tn,）,Mu,噬菌体,（,mutator phage,）,转座噬菌体,（,transposable phage,）,原核生物,E.coli,进化研究,抗药性产生机制,各种研究用的突变株的获得,转座作用的频率为,10,-5,10,-7,“,自发基因工程,”,、,“,内源性基因工程,”,转座因子的特点,在转座时，通过转座因子的复制，可将新形成的拷贝以非同源重组的方式转移到染色体的新部位上；,在转座因子两端各有一段一定长度的末端重复序列，包括,正向重复,（,direct repeat,）,和,反向重复,（,inverted repeat,，或,颠倒重复,）,；,每个转座因子还带有一个对转座有特异功能的,转座酶基因,（,transposase gene,）,。,2.,自发突变,（,spontaneous mutation,）,自发突变,（,spontaneous mutation,）,是指生物体在无人工干预下自然发生的低频率突变。,自发突变的原因,（,1,）背景辐射和环境因素,（,3,）,DNA,复制过程中碱基配对错误,（,2,）微生物自身有害代谢产物,一个,1000bp,的基因自发突变频率约为,10,-6,例如，过氧化氢等,例如，天然的宇宙射线等,（六）紫外线对,DNA,的损伤及其修复,嘧啶（敏感性）嘌呤,紫外线,（,ultraviolet ray,，,U.V.,）,嘧啶二聚体,（,TT,，,TC,，,CC,）,和水合物,把经,UV,照射后的微生物,立即,暴露于,可见光,下时，可明显降低其死亡率的现象，称为,光复活作用,。,1.,光复活作用,（,photoreactivation,，,photorestoration,）,最早是,A.Kelner,（,1949,）在,Streptomyces griseus,（灰色链霉菌）中发现的。后来，在许多微生物中都得到了证实。,最明显的是在,E.coli,的实验,对照：,810,6,个,mL,E.coli,100,个,mL,E.coli,试验：,810,6,个,mL,E.coli,210,6,个,mL,E.coli,UV,UV,360,490nm,可见光，,30min,使,二聚体,（,dimer,）,重新分解成,单体,（,monomer,）,带有嘧啶二聚体的,DNA,分子,DNA,分子,UV,照射,黑暗下结合,光激活酶,光解酶,（,光裂合酶,，,photolyase,）,复合物,300,500nm,可见光,获得光能而激活,释放光解酶,在一般的微生物中都存在光复活作用，在利用,UV,进行诱变育种等工作时，应在,红光下,进行照射和后续操作，并放置在,黑暗条件下培养,。,注 意,2.,切除作用,（,excision repair,）,是活细胞内一种用于修复被,UV,等诱变剂（包括烷化剂、,X,射线和,射线等）损伤后,DNA,的修复方式之一，又称,暗修复,（,dark repair,）,，通过,酶切作用,去除嘧啶二聚体，随后重新合成一段正常,DNA,链的核酸修复方式。,酶切,合成,切开,切除,聚合,连接,原理：检测受试物诱发,鼠伤寒沙门氏菌组氨酸营养缺陷型突变株,(his,-,),回复突变成野生型,(his,+,),的能力。即组氨酸突变菌,(his,-,),在不含组氨酸的最低营养平皿上不能生长；回复突变成野生型,(his,+,),，可在不含组氨酸的最低营养平皿上生长。,是应用最广泛的检测,基因突变,的体外试验。,Ames,试验,鼠伤寒沙门氏菌,野生型,（,his,）,鼠伤寒沙门氏菌,突变型（,his,）,正向突变,回复突变,受试物,试验菌种,(his,-,),S,9,试验菌种,(his,-,),S,9,Ames,试验原理,Ames,试验的常规方法有斑点试验和平板掺入试验,斑点试验,吸取测试菌增菌培养后的菌液,0.1ml,，注入融化并保温,45,左右的上层软琼脂中，需,S9,活化的再加,0.3ml,0.4mlS9mix,，立即混匀，倾于底平板上，铺平冷凝。用灭菌尖头镊夹灭菌圆滤纸片边缘，纸片浸湿受试物溶液，或直接取固态受试物，贴放于上层培养基的表面。同时做溶剂对照和阳性对照，分别贴放于平板上相应位置。平皿倒置于,37,温箱培养,48h,。在纸片外围长出密集,菌落,圈，为阳性；,菌落,散布，密度与自发回变相似，为阴性。,标准试验菌株,(,配套菌株,),：有四种,TA98,、,TA97,：检测移码突变,TA100,：检测碱基置换突变,TA102,：对醛、过氧化物及,DNA,交联剂较敏感,这四个试验菌株除了含有,his,-,突变，还有一些附加突变，以提高敏感性,Ames,试验,结果判断,:,只要在一种试验菌株得到阳性结果，即认为受试物是致突变物,仅当四种试验菌株均得到阴性结果，才认为受试物是非致突变物,Ames,试验,不加,S9,混合液得到阳性结果，说明受试物是直接致突变物,加,S9,混合液才得到阳性结果，说明该受试物是间接致突变物,Ames,试验,二、突变与育种,（一）自发突变与育种,（,breeding by spontaneous mutation,）,1.,从生产中育种,在生产第一线易获得较优良的生产菌株。,2.,定向培育优良菌株,定向培育,是一种利用微生物自发突变，并采用特定的选择条件，通过对微生物群体不断移植以选育出较优良菌株的古老方法。,（二）诱变育种,（,breeding by induced mutation,）,诱变育种,是指利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显著提高的基础上，采用简便、快速和高效的,筛选方法,，从中挑选出,少数符合育种目的的突变株,，以供科学实验或生产实践使用。,筛选,诱变,诱变育种,定向的,更重要,随机的,可获得供工业和实验室应用的各种菌株；,提高有用代谢产物的产量；,减少杂质、提高产品质量、扩大品种和简化工艺等。,诱变育种具有重大的实践意义,诱变育种的特点,（,1,）提高突变率，扩大突变谱,（,2,）有效地改良个别、单一性状,（,3,）缩短育种年限,（,4,）定向变异和有益突变的频率低,1.,诱变育种的基本环节,出发菌株,纯化、同步培养,培养液,离心收集细胞，洗涤，制菌悬液玻璃珠打散，过滤,细胞或孢子悬液,诱变处理,平板分离,初筛,复筛,保藏及扩大试验,活菌计数，诱变预备试验,存活细胞计数，致死率计算,变异率计算,2.,诱变育种中的原则,（,1,）选择简便有效的诱变剂,诱变剂,（,mutagen,）,物理因素,化学诱变剂,非电离辐射类的,紫外线,、,激光,和,离子束,（,ion beam,，有小型加速器提供）等,引起电离辐射的,X,射线,、,射线,和,快中子,等,主要有,烷化剂,、,碱基类似物,和,吖啶类化合物,烷化剂,可与巯基、氨基和羧基等直接发生反应，更易引起基因突变。,最常用的烷化剂,N-,甲基,-N-,硝基,-N-,亚硝基胍（,NTG,）、,甲基磺酸乙酯（,EMS,）、,甲基亚硝基脲（,NMU,）、,硫酸二乙酯（,DES,）、,氮芥、乙烯亚胺和环氧乙烷等。,拟辐射物质,氮芥、硫芥和环氧乙烷等,各种点突变,一般只有辐射才能诱发的,染色体畸变,诱发,出发菌株,（,original strain,）,是指用于育种的原始菌株，选用合适的出发菌株有利于提高育种的效率。,（,2,）挑选优良的出发菌株,合适的出发菌株来源：,由自然界直接分离获得的野生型菌株；,在生产中经历生产条件考验的菌株；,已经过诱变甚至多次改造的菌株；,选用对诱变剂敏感性较高增变变异株；等等。,在诱变育种中，所处理的细胞必须是单细胞、均匀的,悬液状态,。,（,3,）处理单细胞或单孢子悬液,菌悬液制备目的在于提高诱变处理的效果,因为,:,一方面,，分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，,另一方面,，又可避免长出不纯菌落。,诱变剂一般只作用于,DNA,双链中的某一条单链，故某一突变还是无法反映在当代的表型上。只有当经过,DNA,的复制,和,细胞分裂,后，这一变异才会在表型上表达出来，于是出现了不纯菌落，这就叫,表型延迟,（,phenotypiclag,）,。,表型延迟,（,phenotypiclag,）,用于诱变育种的细胞应尽量选用单核细胞,，,例如，细菌的芽孢；,霉菌或放线菌的分生孢子。,诱变剂,的作用有三条：,一是提高诱变的频率,二是扩大变异的幅度,三是使变异向正变的方向移动（产量提高）,（,4,）选用最适的诱变剂量,凡在提高诱变率的基础上，既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变范围的剂量，就是,合适的剂量,。,两条重要的实验曲线,横坐标,纵坐标,剂量存活率曲线,诱变剂的剂量,细胞存活数的,对数值,剂量诱变率曲线,诱变剂的剂量,诱变后获得的,突变细胞数,通过比较上述两曲线，可找到,某,诱变剂的剂量,存活率,诱变率,三者的最佳结合点。,通常采用低剂量、长时间处理。,诱变剂的,复合处理,常常表现出明显的,协同效应,，这对育种工作是有利的。,（,5,）充分利用复合处理的协同效应（,synergism,）,复合处理有几类：,两种或多种诱变剂的先后使用；,同一种诱变剂的重复使用；,两种或多种诱变剂的同时使用。,为了大大提高育种时初筛的效率，必须进行大量的分析测定和统计工作，并找到,形态变异,与,产量变异,两者间的相关性。,（,6,）利用和创造形态、生理与产量间的相关指标,利用鉴别性培养基的原理或其他途径，就可有效地把原先肉眼无法观察的生理性状或产量性状转化为,可见的,“,形态,”,性状,。,快速平板检出法,在琼脂平板上，通过观察测定某突变菌落周围,蛋白酶水解圈,的大小、,淀粉酶变色圈,（用碘液使淀粉显色）的大小，,氨基酸显色圈,（将菌落用打孔机取下，转移到滤纸上，再用茚三酮试剂显色）的大小，,柠檬酸变色圈,（可在厚滤纸上培养，用溴甲酚绿作指示剂）的大小，,抗生素抑制圈,的大小，,指示菌生长圈,的大小（测定生长因子产生），,纤维素酶对纤维素水解圈,（用刚果红染色）的大小，,外毒素的沉淀反应圈,的大小等，,均可为初筛工作中估计某突变株代谢产物量的,“,形态,”,指标。,（,7,）设计高效筛选方案,设计简便、高效的科学筛选方案。,初筛,筛选工作,复筛,以量为主（选留较多有生产潜力的菌株）,以质为主（对少量潜力大的菌株的代谢产物量作精确测定）,常用的筛选方案,第一轮：,第二轮：,第三轮：,同第二轮,第四轮：,同上,.,.,.,直至获得较满意的结果为止,初 筛,复 筛,对产量突变株生产性能的测定方法,粗测为主,在培养皿平板上,在摇瓶中,（,8,）创造新型筛选方法,较精确的测定,摇瓶培养,or,台式自控发酵罐培养,3.,3,类突变株的筛选方法,（,1,）产量突变株的筛选,1971,年，国外有人报道了筛选春日霉素（,kasugamycin,，即,“,春雷霉素,”,）生产菌时所采用的一种,琼脂块培养法,，一年内曾使该抗生素产量提高,10,倍。,此法的关键是用,打孔器,取出含有一个小菌落的琼脂块作分别培养。这样，各琼脂块所含养料和接触空气面积基本相同，且产生的抗生素等代谢产物不致扩散出琼脂块外。,数据精确，效率高,（,2,）抗药性突变株的筛选,基因突变使菌株对某种或某几种药物，特别是抗生素，产生抗性。,特点：,正选择标记,（突变株可直接从抗性平板上获得,-,在加有相应抗生素的平板上，只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。）,梯度平板法,（,gradient plate,）,是,定向筛选抗药性突变株,的一种有效方法，通过制备琼脂表面存在药物浓度梯度的平板、在其上涂布诱变处理后的细胞悬液、经培养后再从其上选取抗药性菌落等步骤，就可定向筛选到相应抗药性突变株。,梯度平板法,（,gradient plate,）,是定向筛选抗药性突变株的一种有效方法。,表示方法：,所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“,r”,。,str,r,str,s,对链霉素的,抗性,敏感性,（,3,）营养缺陷型突变株的筛选,营养缺陷型突变株,（,auxotrophic mutant,）,在生物学基础理论和应用研究以及生产实践上都有极其重要的意义。,营养缺陷型的表示方法：,基因型：,所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示：,his,C,（组氨酸缺陷型，其中的大写字母,C,同一表型中不同基因的突变）,表型：,同上，但第一个字母大写，且不用斜体：,HisC,在具体使用时多用,his,C,-,和,his,C,+,，分别表示缺陷型和野生型。,a.,基本培养基,（,MM,，符号为）,与筛选营养缺陷型突变株有关的,3,类培养基,仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的组合培养基，称,MM,。,b.,完全培养基,（,complete medium,，,CM,，符号为）,凡可满足一切营养缺陷型菌株营养需要的天然或半组合培养基，称为,CM,。,一般可在基本培养基中加入一些富含氨基酸、维生素、核苷酸和碱基之类的天然物质，如蛋白胨或酵母膏等配制而成。,c.,补充培养基,（,supplemental medium,，,SM,，符号为,A,或,B,等）,凡只能满足相应的营养缺陷型突变株生长需要的组合或半组合培养基，称为,SM,。,在基本培养基上再添加对某一营养缺陷型突变株所不能合成的某相应代谢产物所组成，可专门选择相应的突变株。,原养型,（,prototroph,）,与营养缺陷型突变有关的,3,类遗传型个体,野生型,（,wild type,，,wild strain,）,营养缺陷型,（,auxotroph,）,从自然界分离到的原始菌株（,A,B,）,经诱变剂处理后的突变株（,A,B,）,经回复突变或重组后产生的菌株（,A,B,