细胞生物大分子的结构与功能.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细胞生物大分子的结构与功能,教学内容,结构生物学概述,蛋白质的结构与功能,核酸的结构与功能,糖复合物的结构与功能,1970,年被提出来，当时研究内容是什么，意见不一致。,1993,年英国,Nature,杂志召开分子生物学国际学术会议。会上原哈佛大学、麻省理工学院,Petsko,教授在会上宣称结构生物学的时代已开始。生命科学的各个分支学科都必然需要深入到分子水平，运用结构生物学的概念、知识和方法才能保持学科的生命力，才能彻底解释各种生命现象的本质。,Current Biology,（,1991,年建刊）是介绍生物学领域内最新成就和观点的刊物，在,“,结构生物学,”,分册中包括,12,个专题：蛋白质核酸相互作用、折叠和结合、大分子组装、理论与模拟、核酸、序列与拓扑学、脂质膜蛋白、工程与设计、糖与多糖、生物方法、蛋白质、催化与调节等。,一、结构生物学,（,structural molecular biology,）,结构生物学时代形成的突出标志是多种新的国际性结构生物学专业的创刊：,J.Structural Biology(1990,年）,(IF=3.092),Current Opinions in Structural Biology,（,1991,年）,(IF=8.686),Macromolecular Structural,（,1991,年）,(IF=8.686),Structure,（,1993,年）,(IF=5.993),Nature,的,Nature Structural&Molecular Biology,（,1994,年）,(IF=11.579),1,、,定义：,是以分子生物物理学为基础，结合分子生物学和结构化学方法测定生物大分子及其复合物的三维结构及结构的运动，阐明其相互作用的规律和发挥生物学功能的机制，从而揭示生命现象本质的学科，是生物学各前沿领域的基石。,结构生物学研究的,核心内容,是生物大分子（蛋白质、核酸、多糖等）及其复合物和组装体的三维结构、运动和相互作用，以及与正常生物学功能、异常生理现象的关系。,结构生物学的中心法则为：序列空间结构功能。,图 通过三维结构获得大分子生物学功能的概要信息,三维结构,缝隙,（酶活性位点）,形态和静电属性,催化族结构功能,/,基序,-,催化机制,不同基团的相关性,配体和功能位点,蛋白质配体复合物,抗原位点及,表面修饰,表面残基暴露,与分子构成,突变、单核苷酸、,保守残基的分布,折叠,晶胞堆积,晶体或高浓度,溶液中蛋白质,的四级结构,进化关系,推测相互作用界面,生物多聚态,朊病毒仅含有,PrP,sc,，不包含任何核酸，它是由正常的,PrP,c,在翻译后发生构象转变而形成的，即朊病毒是以正常的为模板进行复制的，是一种,蛋白蛋白,的模式。,PrP,sc,在蛋白酶的作用下切去,N,端序列，可生成,PrP27-30,PrP27-30,的浓度同传染性朊病毒的滴度成正比，因此认为朊病毒是由,PrP27-30,的聚合作用引起的。,正常的,PrP,c,结构也可发生改变，形成部分解折叠的单体结构,PrP,，它是,PrP,c,生成的,PrP,sc,中间物。由于,PrP,浓度和,PrP,sc,生成量都非常低，且在未生成,PrP,sc,之前，大部分,PrP,已经回复生成,PrP,c,或被降解，故一般不致病。但在某些传染型朊病毒中，外源的,PrP,sc,侵入刺激,PrP,c,生成,PrP,sc,，由于是不溶性蛋白质，从而使得,PrP,c,到,PrP,sc,的结构转变为不可逆过程。同时，,PrP,sc,的不断积累又会反馈刺激,PrP,和,PrP,sc,的生成。,PrP,sc,经蛋白酶降解又可形成,PrP27-30,，后者能够进一步多聚化形成淀粉样蛋白斑或原纤维，致使人和动物患病。,遗传性朊病毒病是由突变的,prp,基因编码的蛋白,PrP,c,的不稳定引起的，这种不稳定性能促进,PrP,c,生成,PrP,，并进一步生成,PrP,sc,。经过蛋白酶降解同样可产生具有蛋白酶抗性的,PrP27-30,，尽管,PrP27-30,的蛋白酶抗性可能比野生型低，但同样能使人和动物致病。,结构生物学依赖于新技术和新仪器的应用，其主要方法和技术基础全部来自现代物理、化学和数学的最新发展，尤其是物理学的新方法和技术，物理学家已涉足生命科学。,精细测定的生物大分子结构以指数曲线增加，据国际蛋白质数据库（,Protein Data Bank,，,PDB,）的统计为,10,个,/,天，目前已公开在原子水平测定的大分子超过,18000,个（蛋白质及核酸占,93.6,）。已有,7,千多个生物大分子结构可被利用。,2,、结构生物学的主要研究方法,三大数据库,美国的国家生物技术信息中心（,National Center for Biotechnology Informatics,，,NCBI,，,1988,年,）,欧洲生物信息学研究所,(European Bioinformatic Institute,，,EBI,，,1993,年,),日本信息生物学中心（,Center for Information Biology,，,CIB,，,1995,年,）,北大生物信息中心,diffraction methods,）,1912,年，布拉格父子提出和发展，首先用于晶体分析。,1951,年,Pauling,和,Corey,应用,X,射线衍射阐明蛋白质的,螺旋和,折叠，,1953,年用于,DNA,晶体分析，上世纪,60,年代研究了血红蛋白和肌红蛋白，逐渐成为生物大分子晶体结构研究的重要手段。目前所得的测定结构中占,81.9,。,X,射线的波长范围为,0.01,10nm,，晶体结构分析常用,0.1nm,左右的,X,射线，相当于,分子中原子之间的距离,。波长过长时，吸收增加，衍射能力降低，背景增强，对结构分析不利；波长过短时，造成衍射斑点太密，难以分辩。,X,射线的衍射现象是从光栅发现的，衍射花样的结构与衍射光栅结构一一对应。晶体中的原子是三维排布，构成了一个对,X,射线的三维光栅。,X,射线打到晶体上，每个原子都是一个点,X,射线源，产生与原射线具有相同波长的散射线，进而相互干涉产生衍射花样，相位相同者振幅变大，在荧光屏上生成亮点，相位不一致者相消，振幅变小而消失，在荧光屏上成为暗点。,X,射线晶体学分析是研究分子结构的专门学科，涉及许多物理和数学问题。在此仅扼要介绍其过程：,1,）以,X,射线照射晶体获得不连续干涉的衍射图，从衍射线方面研究晶体的最小重复单位,晶胞类型、大小、空间群等几何晶体学参数；,2,）测量衍射线的强度。晶胞中原子位置及原子种类的全部信息都包含在衍射线强度中。,3,）推算衍射线的相位。这是最重要也是最难的问题，生物大分子是用同晶置换法，通过加入到晶体中的重原子来间接推算蛋白质晶体衍射线的初始相位。,4,）建立电子密度图。根据衍射点位置提供的单元波频率和衍射点密度提供的振幅及推算出的相位，通过傅立叶（,Fourier,）加和可以得到电子密度图，从而确定原子或原子团的位置和种类，进而建立模型。,5,）精确定位。将初步确定的原子位置，通过限制性最小二乘法等进行修正，得到精确的位置。,目前，计算机技术在生物大分子晶体结构研究重起着重要作用。不仅对衍射数据能迅速处理，而且能够模拟、比较、修正、建立高精度的大分子三维结构模型。,优点：分辨率高，达到原子分辨率；既可研究水溶性蛋白，也可研究膜蛋白和大分子组装体与复合体，可确定活性中心的位置与结构，从分子水平理解蛋白质是如何识别和结合配体分子、如何催化、如何折叠和进化等生命的基本过程，阐明生命现象。,缺点：,1,）样品必须是晶体。生物大分子特别是膜蛋白和病毒等分子组装体结晶更难，且获得的结果是结晶状态的结构，不是自然状态。,2,）测定大的分子组装体，测量其精细结构十分复杂。一是因为大晶胞含有的原子极多，,X,射线衍射点很多，无法区分、辨认和探测；二是衍射点强度过弱，特别是高分辨率时，无法与背景区分。,改进：,同步辐射,X,射线衍射装置,，利用高通量、高亮度、高准直性、光谱分布宽且波长连续可调的,X,射线。如第三代同步辐射,X,射线装置，亮度提高,10,12,倍，测定的最大结构是蓝舌病毒，衣壳直径为,69nm,，分辨率为,0.35nm,。,突破：,1,）晶体尺寸减小，为,20,40m,；,2,）可测定精细结构的尺寸增加，如上千蛋白质亚基；,3,）获取数据的速度极快，可达,10,9,S.,（,2,）多维核磁共振技术,核磁共振（,nuclear magnetic resonance,，,NMR,）可测定生物大分子在溶液中的构象及其相互作用的方式，是单晶,X,射线衍射技术的重要补充手段，特别是高磁场,NMR,的开发，计算机的应用、二维和多维,NMR,谱的诞生。目前所测结构占样品的,16,左右。,NMR,的基本原理：原子核中的质子、中子都有,自旋现象,，可产生一个微小的磁场，可用,磁矩,来描述。整个原子核的自旋和磁矩由其组成的质子、中子数来决定，如果所含质子数和中子数均为偶数，则其自旋和磁矩会成对地相互抵消；,只有质子数或中子数为奇数的原子核，才能因自旋产生磁矩形成一个小磁场。,在没有外加磁场时，磁矩的方向是随机的，没有固定指向，磁矩的总和为零。,当有外加磁场时，大部分原子核的磁矩都会顺外加磁场方向排列，仅一小部分具有较大位能的原子核磁矩逆外加磁场方向排列,。,如果在外加磁场的垂直方向再加入一个交变磁场，并改变磁场频率，使交变磁场能量达到一定数值，就会产生共振吸收，即核磁共振。,以频率对吸收作图，可显出吸收峰位置，获得,NMR,谱图。不同原子核（如,1,H,、,13,C,、,15,N,）的,NMR,波谱位置差别很大，不同化学基团或化合物中的同种原子核的,NMR,谱也存在着差异，由此鉴别大分子的构象。,一维,NMR,是共振峰强度随频率变化所得的图谱。采用一维,NMR,谱对大分子识别是难以实现的。,二维和多维,NMR,可使信号在,频率,空间沿不同方向发展，从而获得大量结构信息应用于大分子的构象分析及模型重建。,优点：可直接在溶液中测定自然状态下大分子结构，分辨率为,0.2nm,。特别是同步辐射核高分辨率（,1000MHz,）大规模,NMR,谱仪的应用，结构生物学必将迎来,“,一个想研究什么就研究什么,”,的时代。,缺点：所测生物分子的相对分子量较小，一般为,15,25kDa,；要求所测样品纯度高且数量相对较多，使样品制备有困难；只能用于水溶液性的生物样品，对膜蛋白或病毒等组装体，复合体等无法测定。,（,3,）,电子显微学方法,电子晶体学（,electron cryslallography,，,EC,）是其中之一，是借助电子与晶体的相互作用来研究晶体结构，常用于蛋白质晶体的结构研究。,1968,年,De Rosier,和,Klug,第一次用电子显微镜对生物大分子的结构（,T4,噬菌体的尾部）进行了解析。,优点：,1,）可直接从电子显微镜中获得晶体结构信息；,2,）所需样品只是二维晶体，制备较简单，适于解析膜蛋白、大分子复合体等；,3,）适于捕捉动态结构变化信息；,4,）数据处理较,X,射线晶体学简单。,缺点：对生物材料造成电子辐射损伤；分辨率低，最高可达,0.3nm,；信噪比低；不能保持样品的天然含水状态。,改进：冰冻电镜（低温电子显微术），样品迅速侵入被液氮冷却的乙烷中而高速冷冻，水形成玻璃态的冰。,冷冻电镜计算机三维重构方法,在病毒等大分子组装体（如核糖体）的结构与功能研究中发展很快，已有,100,余种病毒的三维结构被阐述。如：,Bottcher,和,Conway,研究的乙肝病毒衣壳的三维结构（,Nature,）；我国留美学者周正洪博士研究的疱疹病毒（,Science,）。,3,、发展方向,（,1,）倾向更大、更复杂的结构,从研究大分子的结构进而研究超分子复合体，如病毒颗粒、细胞器结构、膜复合体等，使结构研究从大分子到细胞得以衔接。,（,2,）由静态发展到动态,在毫秒数量水平上测定蛋白质的动态活动，如蛋白质变性和新生肽链的折叠情况、酶与底物作用时构象变化等。,4,、前景,（,1,）在后基因组时代的生物学中，结构生物学将具有战略性的关键地位；,（,2,）结构生物学必将与基因组学,“,联姻,”,，产生新的重大科学工程，推动生物学进入以整合研究为主的新阶段。,（,3,）结构生物学的研究将成为揭示某些疑难病症分子机理的基本途径。,（,4,）结构生物学研究将成为创新药物设计和开发的重要基础。,二、蛋白质的结构与功能,蛋白质是表达生命的物质，在化学、物理结构和性质上变化很大，是细胞组分中含量最丰富、功能最多的生物大分子。,各种蛋白质的元素组成很相似，都含有碳、氢、氧、氮，大多还含硫，有的还含磷、铁、铜、碘等。,各种蛋白质的含氮量近于,16,，,可作蛋白质的定量分析。,1,、蛋白质的结构基础,氨基酸,德国生物化学家,Emil Fischer,第一个发现所有蛋白质由氨基酸组成，,1902,年获得了诺贝尔奖。,自然界的氨基酸有,300,余种，但从现已分析的生物体内蛋白质发现，由基因编码的仅有,20,种氨基酸。,氨基酸结构的共同特征,：,1,）与羧酸相邻的,碳原子上都有氨基（脯氨酸是亚氨酸），故称为,氨基酸。在中性水溶液中氨基和羧基都可解离而成两性离子；,2,）与,C,连接的四个原子或基团是不同的，故是不对称（手性）碳原子（甘氨酸例外），则,氨基酸有,L,和,D,两种构型（,configuration,）的立体异构体，两种构型互为对映体。组成蛋白质的,氨基酸多是,L,构型，,D,型氨基酸只存在于某些抗生素和生物碱中。,氨基酸的分类（,R,侧链不同）：,非极性疏水氨基酸,（,7,个）：,R,侧链是脂肪烃或芳香烃，烃链越长疏水性越大。根据氨基酸在有机溶剂和水中的分配系数基氨基酸在蛋白质结构中的分布，总结其疏水由强到弱的顺序是,IVLFCMAGTSWYPHENQDKR,。疏水氨基酸常因相互疏水作用而处于球状蛋白或生物膜的跨膜双脂层中。,不解离的极性氨基酸,（,8,个）：,R,侧链是带有极性的羟基、巯基和酰胺基，有亲水性，但不解离。,解离的极性氨基酸,（,5,个）：,Asp,和,Glu,的,R,侧链有羧基，可解离带负电荷，是酸性氨基酸；,Lys,、,Arg,和,His,的,R,侧链可解离而带正电荷，为碱性氨基酸。在蛋白质分子内碱性氨基酸残基常与酸性氨基酸残基形成盐键。这些极性强的氨基酸常出现在蛋白质分子表面，与环境中水分子形成氢键。,注：在蛋白质的序列比较时，同类型氨基酸发生的取代均属于保守性取代，对蛋白质的空间结构和功能没有大的影响。,非编码氨基酸,：在蛋白质生物合成后由编码氨基酸乙酰化、甲酰化、丙酰化、磷酸化、羟基化、甲基化等修饰而成或形成二硫键。如蛋白质中,Ser,、,Thr,、,Tyr,的磷酸化，在细胞信号传递系统中起重要作用；胶原中的羟脯氨酸和羟赖氨酸；凝血酶原中,Glu,的,羧化；,N,端氨基酸的乙酰化或,C,端氨基酸的酰胺化；氨基酸的糖基化或脂质化而使其亲水或疏水性增大。,硒代半胱氨酸（,Sec,）,构成真核细胞和原核细胞中几种酶的活性部位，如：人硫氧还蛋白还原酶、谷胱甘肽过氧化物酶、脱碘酶。,硒代半胱氨酸是通过对结合在,tRNA,分子上的丝氨酸修饰而成，是在肽链合成过程中与肽链结合的。,Sec-tRNA,Sec,的合成步骤是：在连接酶的催化下，,L-Ser,氨酰化与,tRNA,Ser,连接形成,L-Ser-tRNA,Ser,，进而硒磷酸的硒转换丝氨酸的氧。,硒代半胱氨酸的密码子,UGA,，而这个,UGA,只有在该特定,mRNA,的,3,非翻译区（,3UTR,）内存在硒代半胱氨酸插入序列即一个特异的,茎,-,环结构,时，才能作为硒代半胱氨酸的密码子而被翻译。,例：人,谷胱甘肽过氧化物酶,2,、蛋白质的多聚性质,蛋白质是一个相对均一的分子，是一个线性的、无分支的、有精确的长度和确定的氨基酸排列顺序的分子。,蛋白质的一级结构是蛋白质分子结构的基础，包含了决定蛋白质分子所有结构层次的全部信息，使不同的蛋白质各自具有特定的功能。,氨基酸通过肽键（,peptide bond,）相互聚合形成多肽链。参与肽键平面的,6,个原子,C,1,、,C,、,O,、,N,、,H,、,C,2,在同一平面内，,C,1,和,C,2,呈反式构型。,在某些肽中，有非,羧基和,氨基形成的肽键，如谷胱甘肽分子中，谷氨酸的,羧基和半胱氨酸的,氨基形成肽键。,自然界中存在的肽有开链式结构和环状结构，开链式肽有自由氨基端和自由羧基端。大多数小肽具有一定的结晶形状，熔点较高，有等电点，除二肽外，肽都有双缩脲反应。许多肽具有特殊的生物活性，如短杆菌肽,S,对革兰氏阳性细菌有强大的抑制作用；,鹅膏蕈碱是一个环状八肽，能抑制真核生物,RNA,聚合酶的活性而抑制,RNA,的合成，导致机体死亡；脑啡肽由,5,个氨基酸组成，具有镇痛作用。,3,、蛋白质的空间构象,蛋白质高级结构的作用力,蛋白质的二级结构,：肽平面、,二面角、,螺旋、,折叠、,转角、非规则区域。,两亲,螺旋,（,amphipatuic-helix,）,:,一面具有疏水残基，相对的一面具有极性的或带电荷的残基，是一个既可以与极性化学环境也可以与非极性化学环境相互作用的结构，如亮氨酸拉链、离子通道。,超二级结构,/,基序（,motif,）,：由二级结构间组合的结构层次，一般以一个整体参与折叠，充当三级结构的构件。常见的如,型聚集体、,型聚集体，如球状蛋白质中的,Rossmann,卷曲、与,DNA,结合的螺旋,-,转角,-,螺旋结构、锌指结构。,结构域（又称辖区）（,domain,）,：是蛋白质亚基中存在的在空间上可明显分开的、相对独立的结构区域。较小的蛋白质中与三级结构是同一含义。常见的结构域氨基酸残基在,100,400,，是蛋白质中独立的结构单位、功能单位与折叠单位。,蛋白质的三级结构,蛋白质的四级结构,两亲,螺旋,4,、蛋白质折叠（,protein folding,）,多肽链线状合成后，必需折叠以获得正确的空间构象，正确的结构是分子的天然状态即生物活性状态。,蛋白质折叠主要描述二级结构的排列和多肽链的折叠方式，是拓扑学研究范畴。一个蛋白质的折叠不可能是,“,随机搜索,”,的过程，因此蛋白质折叠必需由在能量上有利的相互作用指导并遵从一定的限定途径进行。,多肽链折叠的一般原则：,1,）序列上邻近的二级结构在三维空间结构中往往发生接触并以反向的方式进行紧密包装；,2,）,-X-,单位呈右手结构；,3,）连接二级结构的环既不能交叉又不能打结。,框架模型（,framework model,）,：多肽链在没有确定三级结构存在时相互作用形成二级结构，二级结构的可能排列数目有限，呈现出来的这些结构的随机融合而达到它的天然构象。,疏水内陷模型（,hydrophobic collapse model,）,：在非极性侧链将水分子排斥这一能量上有利的过程起始时形成疏水蛋白质核心的折叠反应，蛋白质的其他部分可以在较有限的可能的构象中进行选择重新组织。,在以上两种模型中都有一个紧密堆积的中间体，即熔球态（,molten globule,），它富含二级结构并且排列成大致正确的构象但松散堆积。蛋白质的巩固阶段涉及中间态的重新组织以产生天然态。（如：鸡卵溶菌酶、,-,乳清蛋白）,成核模型（,nucleation model,）,：蛋白质折叠通过多肽链上特殊残基形成的核起始折叠，其他结构围绕着核产生。这个球状折叠的过程不需要中间体，通过一个较确定或较不确定的核发生，各种结构围绕着核产生同时核发生缩聚。,5,、分子伴侣（,molecular chaperones,）,生物体内，很多新合成的蛋白质不能自发地折叠成天然构象（自组装，,self-assembly,）。原因可能是由于折叠过程要求过渡能量上不利的中间态，或者由于同时存在几种可能的稳定折叠途径而只有一种可以达到天然态。在这种情况下，正确的折叠由,分子伴侣（,1997,年，,Eliis,）,来指导。,分子伴侣：具有帮助其他含蛋白质的结构在体内进行非共价的组装或卸装功能的一大类蛋白质，不是这些结构在发挥其正常生物学功能时的永久组成成分。,分子伴侣在很多水平指导蛋白质折叠、去折叠、重折叠与聚合，包括：蛋白质合成后开始折叠、热诱导变性等过程后的重折叠（如热休克蛋白、应激诱导蛋白质是分子伴侣）、跨膜过程中的去折叠与重折叠、异构蛋白质的不同构象之间的转换、蛋白质降解的准备、多聚体及蛋白质配体复合物的形成的控制等。,分子伴侣可完成以下功能：,1,）封闭需折叠蛋白的暴露疏水区段；,2,）创建一个隔离的环境，蛋白质可互不干扰地在此折叠；,3,）促进折叠和去聚合；,4,）遇到应激，使已折叠的蛋白质去折叠。,分子伴侣家族：,核质蛋白（是核分子伴侣，控制核小体的聚集）、,Hsp70,家族（稳定新生肽链）、陪伴蛋白（控制折叠的起始）、,Hsp90,家族与,Hsp100,家族（在蛋白质合成后起作用，在应激过程之后防止或逆转蛋白质的错折叠与积聚）等。,6,、蛋白质的结构与功能,蛋白质的一级结构与功能：一级结构决定高级结构；一级结构与生物进化；一级结构的变化直接影响功能；一级结构与记忆。,蛋白质的空间结构与功能：血红蛋白的构象与功能；免疫球蛋白的结构与功能；膜蛋白的结构与功能；钙调素的结构与功能。,蛋白质分子的修饰,三、糖复合物的结构与功能,糖的分类：,单糖、寡糖、多糖、复合多糖,糖的功能：,1,）糖类是细胞的构成成分；,2,）糖类是生物体内的主要能源物质；,3,）糖类与遗传信息的传递密切相关；,4,）糖类是生物体内许多物质的前体；,5,）糖类是细胞之间相互识别的信息分子的组成成分。,糖的结构：,构型与构象,单糖的结构；寡糖的结构；多糖的结构,（一）多糖,多糖广泛存在于植物、动物、微生物（细菌、真菌）、海藻等。,植物多糖的药理作用：免疫调节作用（牛漆多糖、黄芪多糖）、抗病毒作用（杜仲碱、红藻多糖）、延缓衰老（魔芋多糖、肉苁蓉）、抗肿瘤作用（香菇多糖、螺旋藻多糖）、抗辐射作用（柴胡多糖、黑木耳多糖）、抗氧化作用（枸杞多糖、天门冬多糖）等。,动物多糖的药理作用：抗癌、提高免疫力作用（鹿茸多糖、鲍鱼多糖），抗凝血、抗血栓作用（酸性粘多糖，海参多糖），降血脂（鲨鱼酸性粘多糖），降血糖（灵芝多糖、莼菜多糖），抗心率失常（壳多糖）等。,菌多糖的药理作用：抗肿瘤、抗辐射、抗溃疡、保肝作用、抗突变作用、抗血栓作用、延长凝血作用、降血糖血脂、抗炎、促进蛋白质与核酸的合成。如银耳多糖。,单糖、寡糖或多糖链由酶催化与蛋白质或脂类等非糖物质的特定部位共价结合可形成糖复合物。该过程被称为糖基化作用（,glycosylation,）。,糖化作用（,glycation,）：由还原糖上的,-CHO,基与蛋白质或核酸分子上的游离氨基间形成西夫氏碱，经重排生成糖化中间物，再经脱水和重排产生一些带有荧光的终末糖化产物的过程，也称非酶糖化反应或,Millard,反应。,糖化作用与多种疾病发生关系密切，糖化血红蛋白可作为糖尿病与高血糖的指标，一些代谢周期较长的蛋白质的糖化作用也可作为机体衰老的标志。,自然界发现的单糖及其衍生物有,200,多种，目前在糖复合物中出现的仅十余种，即,D-,葡萄糖（,D-glucose,Glc,），,D-,半乳糖（,D-galactose,Gal,），,D-,甘露糖（,D-mannose,Man,），,D-,木糖（,D-xylose,Xyl,），,L-,岩藻糖（,L-fucose,Fuc,），,L-,阿拉伯糖（,L-arabinose,Ara,），葡萄糖醛酸（,glucuronic acid,GA,）、艾杜糖醛酸（,iduronic,Idu,）、,2-N-,乙酰氨基葡萄糖（,2-N-acetylglucosamine,GlcNAc,），,2-N-,乙酰氨基半乳糖（,2-N-acetylgalactosamine,GalNAc,），,N-,乙酰神经氨酸,/,唾液酸（,sialic acid,Sia,）。,单糖及其衍生物通过糖苷键互相连接成糖链。,（二）,糖蛋白（,glycoprotein,）,糖蛋白是蛋白质与糖类的共价复合物，其分子量一般为,151000kDa,；其糖基数目差别很大，可为一个到数百个，分子中的含糖量一般为,2,50,，聚糖的相对分子量可达数千。糖基常连接成寡糖链，又称聚糖，糖链的存在和结构变化，不仅对糖蛋白的生物学功能十分重要，而且影响糖蛋白在体内的寿命和代谢。蛋白质肽链可在不同部位结合多个糖基或聚糖。,人体内的蛋白质,1/3,以上是糖蛋白，分布于各种组织细胞中，如酶、抗体、载体蛋白、受体蛋白、激素、细胞因子、血型抗原、结构蛋白等。,（,1,）糖蛋白中糖基或糖链与多肽链的连接方式,糖苷键分类,O,连接型,：糖基或糖链的还原端与蛋白质肽链中,Ser,、,Thr,、,Hyp,、,Hyl,等残基上的,OH,形成,O,糖苷键。这类连接方式很容易被稀碱水解。,1,）,O,Fuc,连接：由,Fuc,残基通过其,1,位羟基与,Ser/Thr,上的羟基缩合形成。这种连接方式常见于含有表皮生长因子同源结构域的蛋白质分子。,2,）,O,Xyl,连接：由,Xyl,基的,1,位羟基与,Ser,上的羟基缩合而成。这种连接方式见于人甲状腺球蛋白分子。,1,、糖蛋白的分子结构,3,）,O,GalNAc,连接：这是最常见的,O,连接方式，由,GalNAc,以,1,位羟基与蛋白质的,Ser/Thr,上的羟基缩合形成。其糖基数目少则一个，多达,18,个以上；可为直链、也可分支。糖基组成除有,GalNAc,外，还可有,Gal,、,Fuc,、,Sia,等。,4,）,O,GlcNAc,连接,:,由,GlcNAc,基通过其,1,位羟基与,Ser/Thr,上的羟基缩合形成，其连接位点只有一个糖基，但可有多个连接位点。许多癌基因蛋白、转录因子、细胞骨架蛋白和神经细丝蛋白等糖蛋白分子中存在这种连接方式。,5,）,O,Hyl,连接：,Gal,的,1,位羟基与,Hyl,的羟基缩合而成，其连接位点通常只有一个,Gal,，或者是,Glc,Gal,二聚糖结构。这种连接方式仅见于胶原蛋白。,6,）,O,Hyp,连接：,Ara,的,1,位羟基与,Hyp,上的羟基缩合而成，这种连接方式仅存在于植物和海藻的糖蛋白中，在动物中尚未发现。,N,连接型,：聚糖与多肽链中,Asn,位酰胺,N,原子形成,N,糖苷键而共价连接。,1,）,N,GlcNAc,连接：由,GlcNAc,基的,1,位羟基与,Asn,酰胺氮原子缩合而成，其中,Asn,通常处于,Asn,X,Ser/Thr,序列子中（,X,位置不能是,Pro,）。这类糖链一般由,6,数十个糖基构成，都有分支。这种连接方式在动物糖蛋白中广泛存在，可见于血浆,1,酸性糖蛋白、免疫球蛋白及膜糖蛋白等；植物和微生物中也存在。,2,）,N,GalNAc,连接和,N,Glc,连接：这两种,N,糖基化方式较罕见，目前发现存在与嗜盐菌细胞表面膜糖蛋白分子中。,O,GalNAc,连接和,N,GlcNAc,连接是最重要的糖蛋白糖链，可共存于同一肽链上。,（,2,）糖蛋白中聚糖的结构,1,）,O,GalNAc,连接型聚糖,(a),单糖基和双糖基,最简单的,O,GalNAc,连接只有一个,GalNAc,，存在于少数黏蛋白及分泌型糖蛋白中，如颌下腺黏蛋白、胃黏蛋白和,IgA,。已发现的由两个糖基组成的,O,GalNAc,糖有,Sia2,6 GalNAc1 Ser/Thr,、,Gal 1,3 GalNAc1 Ser/Thr,、,GlcNAc1,3 GalNAc1 Ser/Thr,、,GalNAc 1,3 GalNAc1 Ser/Thr,。,(b),多糖基：含有两个以上糖基的,O,GalNAc,聚糖，其结构可分为核心、骨架和非还原端,3,个部分。,核心结构：是指与,Ser/Thr,相连接的糖基部分，主要由内侧的,GalNAc,和外测的,Gal,或,/,和,GlcNAc,以不同的连接方式组成。已发现的核心结构至少有,8,中，常见的是,1,4,类。,骨架结构：是指核心结构的外延部分，通常由,Gal,与,GlcNAc/GalNAc,以不同方式连接形成的二糖单位，可以重复存在。,非还原端：聚糖链最外端的非还原糖基可以是,Gal,、,GlcNAc,、,GalNAc,、,Fuc,、,Sia,。这些糖基通常参与组成血型抗原决定簇。,2,）,N,GlcNAc,连接型聚糖,是由一个分支的五糖核心和不同数量的外链组成。,五糖核心结构：是一种共性结构，由内侧的两个,GlcNAc,和外侧的三个,Man,组成，称为三甘露糖五糖核心。,外链结构：由连接在上述五糖核心外侧的糖基构成，其糖基组成和结构有较大差异，可进一步分为高甘露糖型、复杂型、杂合型。,高甘露糖型（,high-mannose type,）：外链结构的糖基全部由,Man,组成，可有分支。,复杂型（,complex type,）：外链结构的糖基除含有,Man,外，还可有,GlcNAc,、,Gal,、,Fuc,、,Sia,等。根据在五糖核心的两个,Man,上所连接的糖链（又称天线，,antenna,）数目，分为单天线型、二天线型、三天线型、四天线型等。,杂合型（,hybrid type,）：其外链结构的糖基组成具有高甘露糖型合复杂型的混合特征，即五糖核心的一个,Man,上连接有类似高甘露糖型的外链，而另一个,Man,上连接有类似复杂型的外链。,糖蛋白分子中蛋白质部分与一般蛋白质合结构研究方法相同。,聚糖部分的研究有特殊之处，主要包括以下步骤：聚糖链的释放和分离、糖基组成的测定、异头碳原子构型的测定、糖苷键类型的测定、糖基顺序的测定等。,2,、研究糖蛋白分子结构的方法,（,1,）聚糖链的释放,应先采用蛋白水解酶（如链霉蛋白酶）对糖蛋白进行初步降解，获得带有聚糖链的蛋白片断或糖肽。连接在蛋白片断或肽片断上的聚糖链，可采用下列方法将其切离下来。,1,）酶解法：对于,N,连接型聚糖链,，可运用,N,聚糖酶,F,或各种内切糖苷酶切离。,N,聚糖酶,F,可以切断,GlcNAc,Asn,间的酰胺键而使聚糖链完全释放，该酶对底物聚糖链有专一性。内切,N,乙酰氨基葡萄糖苷酶可水解,N-,连接型聚糖链中与,Asn,连接的两个,GlcNAc,之间的,1,4,糖苷键，从而释放出少一个,GlcNAc,的聚糖链，内切酶有,C,、,C,、,D,、,H,、,L,等,5,种，也具有底物专一性。能够作用,O,连接型聚糖链,的糖苷酶极少，较有效的是从肺炎球菌中纯化的内切,N,乙酰氨基半乳糖苷酶，可专一水解,Gal,与,GalNAc,间的,1,3,糖苷键，从而释放少一个,GalNAc,的聚糖链。,2,）化学法：肼解法常用于释放,N,连接型聚糖链，即将干燥的糖蛋白片断与无水肼封管后于,100,反应,8,10h,。应用该法需严格控制肼解条件，避免聚糖链的进一步降解或修饰。,O,连接型聚糖链的释放是在稀碱条件下（,0.05M KOH,，,1.0M KBH,4,，,45,，,15,24h,）通过,消除反应来完成。另一种方法是采用无水氟化氢在,0,23,处理,1,3h,，则所有的,O,连接型聚糖链均可释放。,（,2,）聚糖链的分离纯化：凝胶过滤、离子交换层析、亲和层析、,HPLC,、高压电泳等。,（,3,）聚糖链中糖基组分的测定：,先将聚糖进行酸水解（问题：水解不完全；单糖被降解）,1,）气相色谱法：适于中性糖和氨基糖。将样品用,2MHCl,，在,100,230,处理,1,6,小时，得到的单糖再还原和乙酰化转变成相应的醛糖醇醋酸盐（具挥发性）后分离、定性和定量。,2,）阴离子交换层析法：样品用,1,2MHCl,在,100,水解,6,8,小时，水解物用碱中和后加于阴离子交换柱上，硼酸盐缓冲液梯度洗脱，用苔黑酚硫酸反应进行定量比色测定。,3,）唾液酸的测定：用过碘酸氧化唾液酸后，再与,2,硫代巴比妥酸生成有色物质进行比色测定。,（,4,）聚糖链中糖基结构的测定,1,）化学分析方法：,过碘酸氧化法（,Smith,降解法）：在,pH35,的水溶液中，用过碘酸盐作氧化剂将糖基中两个羟基间的连接键断裂并氧化成双醛型产物，然后用硼氢化钠将其还原为醇，最后进行酸水解。,不同糖苷键连接的单糖将产生不同的产物,，分析这些,产物可确定其糖苷键的类型,。如：,1,2,型糖苷键最终产物甘油和甘油醛，,1,3,型糖苷键为原来的单糖，,1,4,型糖苷键为赤藓醇和乙醇醛，,1,6,型糖苷键为甘油和乙醇醛。,甲基法：是分析复杂聚糖结构最优方法。首先对聚糖中全部羟基甲基化，即将样品在二甲基亚砜中与氢氧化钠加热制备负碳离子，然后与碘甲烷作用生成甲基醚；生成的甲基化物用酸水解成单糖，并用硼酸钠将醛基还原为稳定的醇羟基，然后乙酰化水解生成的羟基，得到各种部分甲基化的糖醇乙酰衍生物，最后采用气相色谱法或气相色谱质谱法进行定性定量测定，即可确定聚糖链中各种单糖的种类、比例及糖苷键的类型。,2,）酶学分析方法：利用各种外切糖苷酶的作用特点和底物专一性，从聚糖链的非还原端逐步降解糖基。不仅能确定糖基的顺序，也能确定异头碳原子的构型。常用的,外切糖苷酶,有：,D,半乳糖苷酶、,D,半乳糖苷酶、,D,甘露糖苷酶、,D,甘露糖苷酶、,L,岩藻糖苷酶、,N,乙酰,D,氨基己糖酶、,N,乙酰,D,氨基半乳糖酶及神经氨酸苷酶等。（注意：酶的纯度、来源）,运用糖苷酶分析结构，需将每一次的水解产物分离后进行鉴定，操作繁琐。,改进：固定化顺序分析法、试剂列阵分析法。,3,）仪器分析法,质谱法（,MS,）：利用物质在电子轰击时所产生的各种电离碎片的特殊性质来确定物质的结构。可鉴定甲基化衍生物、确定聚糖链的分子量、糖基的连接顺序、糖苷键的位置。该法灵敏、快速、准确、样品少。,磁共振法（,MR,）：通过获得聚糖链的氢核磁能谱来确定结构。该法不破坏样品，但样品需高度纯化。,（,1,）聚糖对糖蛋白空间结构的影响：肽链的正确折叠、亚基聚合、正常的空间构象的形成。,（,2,）聚糖对蛋白质的屏蔽作用：防止糖蛋白被蛋白酶水解。,（,3,）聚糖影响糖蛋白的定位、投送和分泌。,（,4,）聚糖影响糖蛋白的生物活性：酶的活性、激素的活性。,（,5,）聚糖与分子识别：在受体配体识别中的作用；凝集素对单糖和聚糖的识别作用；病原体对细胞膜上糖基的识别和侵染的关系；在精卵识别和结合中的作用。,3,、糖蛋白聚糖的功能,糖蛋白与血型,糖蛋白与主要组织相容性抗原,糖蛋白与细胞分化,糖蛋白与淋巴细胞归巢,糖蛋白与恶性肿瘤,糖蛋白与自身免疫疾病,糖蛋白与感染,4,、糖蛋白与医学的关系,（三）,蛋白聚糖（,proteoglycan,）,蛋白聚糖（,PG,）也是糖类与蛋白质的复合物，其分子中含糖量多为,50,90,。由糖胺聚糖（,glycosaminoglycan,GAG,）与核心蛋白两部分共价连接构成。,构成蛋白聚糖的核心蛋白分子大小和结构不同，糖胺聚糖链的种类、数量、链的长短以及硫酸化的部位和程度等差异，因此蛋白聚糖的分子种类和类型很多。,蛋白聚糖在人体中广泛存在，大量存在于软骨、皮肤、肌键等基质中，是细胞外基质的主要成分，近年来发现其也存在于细胞表面、内分泌颗粒及细胞内。,蛋白聚糖可与其他生物大分子作用，具有重要的生物学功能并参与许多生理调节过程。,（,1,）核心蛋白（,core protein,）,成熟蛋白聚糖的核心蛋白常被糖胺聚糖链的复杂结构所包围，用常规蛋白质测序方法是难以进行的，随着分子生物学理论和技术的应用，一些蛋白聚糖核心蛋白的结构已被确定，从而对蛋白聚糖结构有了新的认识。,1,）主要特点：,多数核心蛋白可分为几个不同的结构域；所有核心蛋白均含有相应的糖胺聚糖取代结构域；通过核心蛋白中的特异结构域，一些蛋白聚糖可锁定在细胞表面或细胞外基质的大分子上；具有特异相互作用性质的结构域。,1,、蛋白聚糖的分子结构,2,）类型：,饰胶原蛋白聚糖（,decorin,）,，可以修饰胶原纤维，,Mr,为,36000,，富